يصف هذا البروتوكول وسيلة لpermeabilization مؤقتة من الخلايا الملتصقة باستخدام طائرة غاز خامل. هذه التقنية تسهل نقل المادة الوراثية والجزيئات الحيوية في خلايا الثدييات ملتصقة بها استخدام القوات الميكانيكية لتعطيل غشاء البلازما.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
Permeabilization من خلايا منضمون باستخدام غاز خامل جت
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
توجد تقنيات مختلفة ترنسفكأيشن الخلية وهذه يمكن تقسيمها إلى ثلاث فئات عريضة: الفيروسية والكيميائية والميكانيكية. يصف هذا البروتوكول وسيلة ميكانيكية لpermeabilize زمنيا الخلايا الملتصقة باستخدام طائرة غاز خامل التي يمكن أن تسهل نقل الجزيئات عادة غير قابلة للاختراق في الخلايا. ونحن نعتقد أن هذا الأسلوب يعمل عن طريق نقل قوى القص على غشاء البلازما من الخلايا الملتصقة، مما أدى إلى تشكيل مؤقت لmicropores. مرة واحدة يتم إنشاء هذه المسام، والخلايا هي قابلة للاختراق ثم إلى المادة الوراثية والجزيئات الحيوية الأخرى. القوات الميكانيكية المعنية لا تتعرض لخطر الخلايا الضارة بشكل دائم أو فصل من الركيزة الخاصة بهم. هناك، بالتالي، على نطاق ضيق من ديناميات غاز خامل حيث الأسلوب هو فعالة. وقد ثبت طائرة غاز خامل كفاءة في permeabilizing مختلف خطوط الخلايا الملتصقة بما في ذلك هيلا، HEK293 والخلايا البطانية الأبهر البطني الإنسان. هذا البروتوكول هو مناسبة لعermeabilization من الخلايا الملتصقة على حد سواء في المختبر، وكما أثبتنا، في الجسم الحي، والتي تبين أنها يمكن أن تستخدم لأغراض البحث ويحتمل أن تكون في التطبيقات السريرية في المستقبل. كما أن لديها ميزة permeabilizing الخلايا بطريقة تقييدية مكانيا، والتي يمكن أن تكون أداة بحث قيمة.
المقدمة
مع تطور الطب الحيوي وفهم الميكانيكا الخلية، وأصبح تسليم الجزيئات الحيوية في الخلايا الحيوية لكثير من مجالات البحث والعلاجات الطبية. وقد تم تطوير تقنيات مختلفة لإدخال جزيئات الأجنبية من خلال غشاء البلازما والخلايا في العصارة الخلوية. هذه يمكن أن تصنف عموما إما: تقنيات الفيروسية أو الكيميائية أو الميكانيكية. يمكن أن تقنيات الفيروسية بالنقل المواد الجينية مثل الحمض النووي الريبي والحمض النووي باستخدام ناقلات فيروسية 1. تقنيات الفيروسية تميل إلى أن تكون الكفاءة عالية في خطوط الخلايا معينة، ولكن لديهم القدرة على التفاعلات المناعية والتهابات 2. وتشمل أساليب ترنسفكأيشن الكيميائية المشترك مع هطول فوسفات الكالسيوم 3، 4 والسموم الناتجة عن بعض بكتيريا lipofection 5. وقد أثبتت هذه التقنيات لتكون فعالة، ومع ذلك، تنشأ مشاكل معينة مثل السمية الخلوية وغير النوعية. علاوة على ذلك، تقنيات مثل الفوسفاط الكالسيومتم العثور على البريد هطول أن يكون الكفاءة ترنسفكأيشن تصل إلى 70٪ ولكن فقط في خطوط الخلايا معينة، ونادرا ما في الخلايا الأولية 6. هذا هو من المذكرة كما يتم وضع زيادة الجهود البحثية في الخلايا الأولية، وخاصة في حالة تصميم العلاجات المختلفة للاستخدام السريري ودراسة سير الحمض النووي.
تعطل الزمني للغشاء الخلية من خلال المحفزات الميكانيكية هو بديل لإدخال جزيئات الأجنبية إلى الخلايا. وتشمل التقنيات: Microinjection من جزيئات 7، التثقيب الكهربائي باستخدام مجال كهربائي لتعطيل الغشاء 8،9، باستخدام الموجات فوق الصوتية sonoporation لتعطيل غشاء الخلية 10-12، الجسيمات القصف كما يدل على ذلك "مدفع الجينات"، الذي يطلق النار على جزيئات ملزمة مع الجينات في الخلية 13، ومؤخرا، وتطبيق إجهاد القص السوائل التي قد تظهر لpermeabilize زمنيا خلايا الثدييات 14،15. على الرغم من ميكانيكيطرق آل تجنب بعض القضايا المذكورة آنفا، وعادة ما تصاحبها الكفاءة أقل والاجهزة المعقدة جدا والمتخصصة. وقد وضعت الشعلة توهج التفريغ الضغط الجوي (APGD تي) في ماكغيل مع الهدف الأولي من functionalizing الأسطح وفصل الخلايا الملتصقة في المختبر 16. مصادفة، تم اكتشاف أن وصمة العيش / قتيلا تستخدم على نحو ما كان يجري اتخاذها في الخلايا من دون وكيل permeabilizing إضافتها. وعلاوة على ذلك، وهذا يبدو أنه لم يحدث إلا في مناطق محدودة من الآبار التي حدثت لمتابعة المباراة مع مسار الشعلة. واصلت التحقيق في قدرات permeabilization من APGD-t و في دراسات المراقبة، تبين أن الطائرة غاز خامل الناقل من البلازما دون الإثارة كانت أيضا قادرة على permeabilize الخلايا. هذا يتناقض مع الفرضية الأولية أن رد الفعل الأنواع التي أوجدتها البلازما النفاثة ضعف وظيفة الغشاء مؤقتا واقترح ببساطة المطاط ووكانت قوات كال كافية للتسبب permeabilization الخلية. من هنا، واصلت الدراسات في المختبر في محاولة لتحديد وتوصيف كفاءة permeabilization من طائرة غاز خامل وكذلك نظرة على قدرات ترنسفكأيشن في 16.
من خلال هذه الدراسات، فقد وجد أن micropores القيام به في شكل الواقع في غشاء البلازما، وهذه المسام تميل إلى ختم غضون ما يقرب من 5 ثانية 15. لقد أثبتنا فائدة هذه التقنية في المختبر والمجراة في غشاء مشيمائي من جنين الفرخ.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. تطوير برنامج ابفيف
- وترد تحكم تدفق الشامل (MKS M100B قداس فلو المراقب المالي) إلى خط غاز الهيليوم لضمان معدل تدفق الغاز دقيقة. يتم التحكم من قبل هذه الوحدة مدخلا الجهد، والتي تتراوح بين 0 و 5 V. حلقة التحكم في البرنامج ابفيف يحدد الجهد المطلوب في أي وقت من الأوقات. التواصل بين الكمبيوتر ويتم تنفيذ وحدة تحكم تدفق الشامل من قبل الجهاز الحصول على البيانات (USB-NI 6009)، ويوفر 12 فولت التيار الكهربائي السلطة للتحكم تدفق الشامل.
- وتستخدم شريحتين المواقع الخطية للسيطرة على الحركة من لوحة 6 جيدا، واحدة لكل اتجاه. ويتكون كل مجلس من MA15 سلسلة Velmex الجمعية Unislide إلى جانب وجود محرك خطوة، ويتم التحكم في كل من المجالس التي كتبها واحد Velmex VXM يخطو المراقب للسيارات. وحدة تحكم يسمح للركض من كل دليل أو محرك يقبل سلسلة من الأوامر المسلسل الخارجية، ومزيج من التي تسمح لحركة معينة عatterns. عدة أنماط يمكن برمجتها في برنامج ابفيف، مما يتطلب من المستخدم سوى تقديم سرعة الشعلة المطلوب فضلا عن أبعاد المسار.
2. إعداد معدات
- فتح كل من اسطوانة الهليوم ومنظم.
- تشغيل وحدة تحكم المحرك.
- فتح البرنامج ابفيف والتحقق من جميع الشروط.
- تأكد يتركز المنصة. للتحقق، والنظر في كل مرحلة الحركية والتحقق من أن كل حرف ليس بالقرب إما نهاية المرحلة. إما لديها مركز البرامج العربات أو ضبط باستخدام عناصر التحكم الركض على الجزء الأمامي من وحدة تحكم المحرك يدويا.
- إذا كانت هذه هي الجولة الأولى من النهار، فمن المستحسن لتشغيل البرنامج مرة واحدة دون الخلايا، لضمان يعمل الإعداد بشكل صحيح.
3. إعداد جيت الغاز شعرية فوهة الارتفاع
- إزالة الشعرية من صاحب الصفر والاتصال الهاتفي الارتفاع.
- وضع 6 جيدا لوحة سن المنصة.
- استبدال وتخفيض الشعرية طائرة الغاز إلى قاع البئر حتى يضرب انزلاق الغطاء. تأمين الشعرية في حامل.
- باستخدام الاتصال الهاتفي الارتفاع، رفع شعري 3 مم. بمناسبة هذا الارتفاع على قاعدة الشعرية.
- رفع الشعرية إلى ارتفاع آمنة ثم قم بإزالة لوحة 6 جيدا.
4. خلية بروتوكول Permeabilization
- ثقافة خط الخلية تمسكا نقطة التقاء على غطاء زجاجي ينزلق في لوحة 6 جيدا باستخدام تقنيات زراعة القياسية. لخلايا هيلا، البذور 6 لوحات جيدة مع 2 × 10 5 خلايا لكل بئر واحتضان لمدة 48 ساعة قبل العلاج.
- إعداد حجم مناسب من محلول يحتوي على ناقلات المطلوب. لhrGFPII-1، تركيز 50 نانوغرام / ميكرولتر في برنامج تلفزيوني 1X توفر إشارة قوية الفلورسنت في خلايا هيلا 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن. للدراسات ديكستران، فمن المستحسن 80 ميكروغرام / مل من 10 كيلو دالتون ديكستران الفلورية الخضراء. من الآن فصاعدا، سوف يحال هذا الحل لو "حل ناقلات".
- إزالة الخلايا سائل الإعلام والثقافة من بئر وشطف ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X.
- ماصة ميكرولتر من الحل 1،370 ناقلات أعدت في الخطوة 4.2 في أيضا. هذا ينبغي أن يؤدي إلى عمق السائل من حوالي 1.3 ملم.
- وضع البئر تحتوي على حل ناقلات في وسط المنصة. خفض فوهة طائرة الغاز إلى مستوى ملحوظ من قبل مما يدل على ارتفاع فوهة 3 مم فوق الشريحة.
- ضبط معدل تدفق الهليوم في برنامج ابفيف وتحديد نمط الحركة المطلوبة لاستخدامها. حدد "تشغيل" عندما تصبح جاهزة لبدء بروتوكول permeabilization. وسوف تكون هناك فترة تأخر الأولية خلالها تحكم تدفق الشامل تستعد لتوفير معدل تدفق اللازمة. مرة واحدة تم الوصول إلى معدل التدفق المناسبة، سيقوم البرنامج ابفيف تفعيل المحركات السائر لتحريك جيدا في نمط permeabilization المطلوب. بمجرد أن توقفت منصة، انتظر حوالي 30 ثانية وإزالة الحل النواقل.ملاحظة: يحدث permeabilization الأمثل قرب الضغط الديناميكي من 100 إلى 200 باسكال عند مخرج الفوهة، وهذا يتوقف على قطر الشعيرات الدموية.
- يغسل جيدا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X.
- ملء بشكل جيد مع وسائل الإعلام ثقافة جديدة.
- كرر الخطوات من 4،3-4،6 عن العدد المرغوب فيه من التجارب. ملاحظة: تأكد من تضمين عينات السيطرة التي تتكون من الآبار التي يجري شغلها مع الحل ناقلات الغاز دون طائرة يتم تشغيلها عليها. ترك الحل في آبار المراقبة لحوالي 1 دقيقة ثم الشروع في خطوات 4.5 و 4.6.
- إذا تشغيل تجربة ترنسفكأيشن hrGFP، والعودة لوحة 6 جيدا إلى الحاضنة لمدة 24 ساعة للسماح للمواد transfected أن كتب من قبل الخلايا. إذا تشغيل التجربة permeabilization ديكستران، والعودة لوحة 6 جيدا إلى الحاضنة لمدة 15 دقيقة.
5. خلية التصوير
- إذا رغبت في ذلك، وعلى الفور قبل التصوير، ومباين مع وصمة عار العيش / قتيلا المناسبة لتقييم موت الخلايا.
- الخلايا صورة مع appropالمجهر riate للتحقيق فعالية ترنسفكأيشن / permeabilization.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويرد Permeabilization من خلايا هيلا مع 10 كيلو دالتون ديكستران الفلورية الخضراء باستخدام طائرة غاز الهيليوم مع 0.86 مم القطر الداخلي الشعرية في الشكل 1. تم counterstained الخلايا مباشرة بعد permeabilization مع 2 ميكرولتر / مل EthD-1 الحل (لايف / الميت الجدوى / السمسة كيت) لتصور موت الخلية. مباشرة بعد counterstaining، وقد شنت زلات الغطاء وتصويرها. ويبين هذا الرقم نتائج تشغيل طائرة غاز الهيليوم في ثلاثة الضغوط منفذ مختلفة مقارنة مع عينة السيطرة. لاحظ أن عرض المسار p...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
خاملة permeabilization طائرة الغاز هو تقنية مفيدة لترنسفكأيشن الخلية ملتصقة. لأنها توفر القدرة على نقل الجزيئات الحيوية في الخلايا مع استخدام القوات الميكانيكية، مما يلغي الحاجة إلى المواد الكيميائية الضارة المحتملة أو ناقلات فيروسية. تقنية يحتمل أن تعطي الباحثين والأطباء وسيلة فعالة وبسيطة نسبيا لبالنقل على وجه التحديد الخلايا. الانتقائية من permeabilization هو أيضا فريدة من نوعها تسمح للباحثين لعلاج خلايا معينة فقط في مستعمرة واحدة والتي يمكن أن تكون مفيدة في تطبيقات متعددة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن الكتاب ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
شكر وتقدير
فإن الكتاب أود أن أشكر مصادر التمويل التالية: كندية معاهد للأبحاث الصحية (CIHR)، والعلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث (NSERC).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Vitality hrGFPII-1 | Agilent Technologies Canada | 240143-57 | بروتين الفلورسنت الأخضر لتجارب التعدي على خلايا HeLa |
| Dextran، AlexaFluor 488; 10,000 ميجاوات، Anionic، Fixable | Life Technologies Inc. | D22910 | ديكستران لتجارب النفاذية |
| LIVE / DEAD Viability / Cellular Toxicity Kit | Life Technologies Inc. | L3224 | لمواجهة تلطيخ خلايا |
| إطالة كاشف الذهب المضاد للبهتان | Invitrogen | P36930 | لتركيب الشرائح عند تصوير |
| Ultra High Purity Helium | Praxair Canada Inc. | معالي 5.0UH-T | & nbsp; |
| Hyclone DMEM / High Glucose Media - 500 مل | Thermo Scientific | SH30022.01 | لخلايا HeLa |
| مصل الأبقار الجنيني | Invitrogen | 26140079 لوسائط DMEM | |
| البنسلين الستربتومايسين ، سائل | Invitrogen | 15140-122 | لوسائط DMEM |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) 1x | تم إنتاجه في المختبر | ||
| ؛ | <قوي>الجدول 1. قائمة الكواشف المطلوبة | ||
| 6-Well Clear TC-Treated Microplates | Corning | 3506 | ؛ |
| # 1 22 × 22 أغطية | فيشر | 12-542B | ؛ |
| الشعيرات الدموية | العالمية للأدوات الدقيقة WPI | معلومات التحجيم | |
| (مم): 1 ، 0.86 ، 0.68 ، 0.5 طلب #: 1B200 ، 1B150 ، 1B120 ، 1B100 | |||
| Mass-Flo Controller | MKS | M100B01314CS1BV | وحدة تحكم التدفق الشامل ، سلسلة M100B ، تتطلب مصدر طاقة خارجي بجهد 12 فولت |
| USB-6009 DAQ | Device National Instruments | 779026-01 | |
| مجموعة UniSlide مع محرك متدرج ووحدة تحكم | Velmex | Two series MA15 UniSlide Assemblies ، مزودة بمحركات متدرجة Vexta 1.8 & deg مقدمة من Velmex ، ويتم التحكم فيها بواسطة وحدة تحكم محرك متدرجة VXM | |
| ؛ | <قوي>الجدول 2. قائمة المعدات المطلوبة |
المراجع
- Rosenberg, S. A., et al. Gene transfer into humans--immunotherapy of patients with advanced melanoma, using tumor-infiltrating lymphocytes modified by retroviral gene transduction. The New England Journal of Medicine. 323, 570-578 (1990).
- Yang, Y., et al. Cellular immunity to viral antigens limits E1-deleted adenoviruses for gene therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 4407-4411 (1994).
- Chen, C., Okayama, H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Molecular and cellular biology. 7, 2745-2752 (1987).
- Walev, I., et al. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 3185-3190 (2001).
- Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 7413-7417 (1987).
- Hamm, A., Krott, N., Breibach, I., Blindt, R., Bosserhoff, A. K. Efficient transfection method for primary cells. Tissue engineering. 8, 235-245 (2002).
- Rauth, S., Kucherlapati, R. S. Expression of DNA Transferred into Mammalian-Cells. J. Bioscience. 6, 543-567 (1984).
- Spandidos, D. A. Electric field-mediated gene transfer (electroporation) into mouse Friend and human K562 erythroleukemic cells. Gene analysis techniques. 4, 50-56 (1987).
- Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA. Nucleic Acids Research. 15, 1311-1326 (1987).
- Fechheimer, M., et al. Transfection of mammalian cells with plasmid DNA by scrape loading and sonication loading. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 8463-8467 (1987).
- Koch, S., Pohl, P., Cobet, U., Rainov, N. G. Ultrasound enhancement of liposome-mediated cell transfection is caused by cavitation effects. Ultrasound in Medicine & Biology. 26, 897-903 (2000).
- Greenleaf, W. J., Bolander, M. E., Sarkar, G., Goldring, M. B., Greenleaf, J. F. Artificial cavitation nuclei significantly enhance acoustically induced cell transfection. Ultrasound in Medicine & Biology. 24, 587-595 (1998).
- Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87, 9568-9572 (1990).
- Hallow, D. M., et al. Shear-induced intracellular loading of cells with molecules by controlled microfluidics. Biotechnology and Bioengineering. 99, 846-854 (2008).
- Chouinard-Pelletier, G. L., Guay, M., Coulombe, D., Leask, S., L, R., Jones, E. Use of inert gas jets to measure the forces required for mechanical gene transfection. Biomedical Engineering Online. 11, (2012).
- Leduc, M., Coulombe, S., Leask, R. L. Atmospheric Pressure Plasma Jet Deposition of Patterned Polymer Films for Cell Culture Applications. Ieee T. Plasma Sci. 37, 927-933 (2009).
- Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Analytical Chemistry. 76, 5257-5264 (2004).
- Sankin, G. N., Yuan, F., Zhong, P. Pulsating tandem microbubble for localized and directional single-cell membrane poration. Physical Review Letters. 105, 078101(2010).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
