مقالة منهجية

عزل وتوصيف المواد الكيميائية من الدهن من البكتيريا سالبة الجرام

32.1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/50623

⸱

سبتمبر 16, 2013

 ,  ,  , 
1Section of Molecular Genetics and Microbiology, The University of Texas at Austin, 2Department of Chemistry and Biochemistry, The University of Texas at Austin, 3The Institute of Cellular and Molecular Biology, The University of Texas at Austin

في هذه المقالة

ملخص

عزل وتوصيف الدهون ومجال عديد السكاريد الشحمي (LPS) من البكتيريا سالبة الجرام يوفر نظرة ثاقبة الآليات القائمة على سطح الخلية المقاومة للمضادات الحيوية، وبقاء البكتيرية واللياقة البدنية، وكيف كيميائيا الدهون المتنوعة والأنواع الجزيئية تعدل تفاضلي المضيف الاستجابات المناعية الفطرية.

الملخص

عديد السكاريد الشحمي (LPS) هو رئيسي جزيء سطح الخلية من البكتيريا سالبة الجرام، تترسب على النشرة الخارجي من طبقة ثنائية الغشاء الخارجي. ويمكن تقسيم LPS في ثلاثة مجالات: القاصي O-السكاريد، وهو قليل السكاريد الأساسية، والدهون والمجال تتكون من الدهون والأنواع الجزيئية وبقايا حمض ديوكسي 3-D-مانو أكتوبر-2-ulosonic (KDO). الدهون والمجال هو العنصر الوحيد الضروري لبقاء الخلية البكتيرية. التوليف التالية لها، والدهون غير معدلة كيميائيا في استجابة للضغوط البيئية مثل درجة الحموضة أو درجة الحرارة، لتعزيز المقاومة لمركبات المضادات الحيوية، والتهرب من الاعتراف من قبل وسطاء من الاستجابة المناعية الفطرية المضيفة. بروتوكول التالية تفاصيل العزلة الصغيرة والكبيرة الحجم والدهون A من البكتيريا سالبة الجرام. ثم وتتميز المواد معزولة كيميائيا بواسطة طبقة رقيقة اللوني (TLC) أو مطياف الكتلة (MS). بالإضافة إلى مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز / التأين وقت لوضوء (MALDI-TOF) MS، ونحن أيضا تصف جنبا إلى جنب MS بروتوكولات لتحليل الدهون والأنواع الجزيئية باستخدام التأين electrospray (ESI) بالإضافة إلى الاصطدام الناجم عن تفكك (CID) والإنحلال الضوئي فوق البنفسجية المستخدمة حديثا (UVPD) الأساليب. بروتوكولات MS دينا تسمح لتحديد لا لبس فيه من التركيب الكيميائي، أهمية قصوى لتوصيف جزيئات الدهون والتي تحتوي على التعديلات الكيميائية الفريدة أو الرواية. نحن أيضا وصف تسمية بالنظائر المشعة، والعزلة لاحقة، من الدهون (أ) من الخلايا البكتيرية لتحليلها من قبل TLC. نسبة إلى بروتوكولات يستند إلى MS-، TLC يوفر طريقة توصيف أكثر اقتصادا وسريع، ولكن لا يمكن أن تستخدم لتعيين بشكل لا لبس فيه الدهون والبنى الكيميائية دون استخدام معايير التركيبة الكيميائية المعروفة. على مدى العقدين الماضيين أدى عزل وتوصيف الدهون A إلى العديد من الاكتشافات المثيرة التي تحسنت فهمنا للعلم وظائف الأعضاء من البكتيريا سالبة الجرام، آليات المقاومات للمضادات الحيويةوقد وفرت اتجهت الاستجابة المناعية الفطرية الإنسان، والعديد من أهداف جديدة في تطوير مركبات مضادة للجراثيم.

المقدمة

عديد السكاريد الشحمي (LPS) هو جزيء السطح الخارجي رئيسية من الكائنات سالبة الجرام تقريبا كل ويتكون من ثلاثة مجالات الجزيئية: أ-O مستضد السكاريد البعيدة، وهو قليل السكاريد الأساسية، والدهون المرتبطة الغشاء والمجال تترسب على النشرة الخارجي لل الغشاء الخارجي طبقة ثنائية 1،2. الدهون والمجال يتكون من 3 ديوكسي-D-مانو أكتوبر-2-ulosonic (KDO) المخلفات والدهون والأنواع الجزيئية، حيث الدهون ويمكن تعريفها بأنها جزء من كلوروفورم للذوبان من LPS على التحلل خفيفة حمض 1، 2. الدهون القياسية جزيء يمكن تعريفها كيميائيا بمثابة العمود الفقري diglucosamine هذا هو ومكرر فسفرته-acylated سداسي؛ متسقة مع الأنواع الدهنية والتي لوحظت في نموذج كائن كولاي (كولاي) 1،2. تسعة جينات أعرب جوهري، الحفظ في جميع أنحاء البكتيريا سالبة الجرام، هي المسؤولة عن إنتاج الدهون مجال (الشكل 1) 1،2. معظم البكتيريا لديها مجموعة إضافية من الجينات، التي تختلف في درجة الحفظ النشوء والتطور، التي تشارك في مزيد من التعديل الكيميائي للدهون A 3. نزع الفسفات، وإزالة السلاسل أسيل، وإضافة الأنصاف الكيميائية مثل السكريات الأمينية (على سبيل المثال aminoarabinose) و / أو phosphoethanolamine هي الأكثر شيوعا لوحظ الأنشطة (الشكل 1). يتم تنشيط العديد من الإنزيمات المسؤولة عن الدهون والتعديل مباشرة عن طريق إشارات البيئية، مثل الكاتيونات ثنائي التكافؤ، أو ينظم التعبير عنها من قبل اثنين من أنظمة الاستجابة منظم مكون 3.

وتتوسط الاعتراف الأنواع الدهون A من قبل المضيف نظام المناعة الفطرية التي تول مثل مستقبلات عامل التمايز 4/myeloid 2 (TLR4/MD2) شارك في مستقبلات 4. قوات مسعور بين MD2 والدهون وسلاسل أسيل، وكذلك بين TLR4 و 'مجموعات الفوسفات 1 و 4 من الدهون وتعزيز علاقة قوية من الشفةمعرف A مع TLR4/MD2 4،5. التعديلات التي تغير حالة أسيلة أو شحنة سالبة من الدهون والدهون تأثير TLR4/MD2 يستند الاعتراف والتحفيز المصب من الاستجابة المناعية الفطرية تفعيل NF كيلوبايت وسطاء الالتهاب مثل TNFα وIL1-β 6،7. التعديلات التي تحجب شحنة سالبة من الدهون وأيضا منع جراثيم الببتيدات المضادة للميكروبات الموجبة من الربط إلى سالبة الجرام سطوح الخلايا 3،8. وافترض كثير من الدهون وتعديلات لزيادة اللياقة البدنية البكتيرية تحت ظروف بيئية معينة، مثل داخل المضيف الإنسان أو في مكانة الايكولوجية. لهذا السبب كثير من الإنزيمات تعديل أهدافا جذابة في تطوير عقلانية من المركبات المضادة للميكروبات. التنوع الكيميائي للهياكل الدهون A، فيما يتعلق الحي و / أو البيئة، والآثار البيولوجية من هذه الهياكل المتنوعة جعل توصيف الهيكلية من الدهون ومسعى هاما في روقال انه يدرس من البكتيريا سالبة الجرام.

عزل جزيئات الدهون A من البكتيريا كله ينطوي على استخراج LPS من سطح الخلية البكتيرية، وهي خطوة المائي لتحرير الدهون A، يليه إجراء تنقية النهائي 9-11. الإجراء استخراج LPS في معظم الأحيان واستشهد هو الإجراء استخراج المياه الساخنة الفينول، لأول مرة من قبل ويستفال جن 10. بعد تعرض استخراج LPS كله إلى خفيفة حمض المائي الذي يفصل كيميائيا KDO من الهيدروكسيل-6'من السكر الجلوكوزامين البعيدة من الدهون A (الشكل 1). وجود مطبات عديدة لإجراء المياه الساخنة الفينول بما في ذلك استخدام كاشف المخاطر العالية، يطلب ضرورة للحط من الأحماض المستخرجة التعاون النووي والبروتينات، وعدة أيام لاستكمال البروتوكول 10.

وقد مختبرنا تطويرها استخراج وعزل الدهون وكما وضعت أول من Caroff ورايتز وهو 12،13. مقارنة مع الإجراءات المياه الساخنة الفينول، وطريقة المقدمة هنا هي أكثر سرعة وكفاءة ويستوعب مجموعة واسعة من وحدات التخزين الثقافة من 5 مل ليتر متعددة. وعلاوة على ذلك، على عكس الاستخراج المياه الساخنة الفينول، أسلوبنا لا تحديد لأنواع السلس الخام أو من LPS، وتوفير الانتعاش الأمثل من أنواع الدهون A. في بروتوكول لدينا، يتم تنفيذ تحلل المواد الكيميائية من الخلايا البكتيرية كله باستخدام مزيج من الكلوروفورم والميثانول والماء، حيث يمكن مكعبات LPS بواسطة الطرد المركزي. وتستخدم مجموعة من التحلل خفيفة الحمضية والاستخراج بالمذيبات (بلاي-داير) لتحرير الدهون A من السكاريد المرفقة تساهميا. تم تطبيق أسلوب بليغ وداير أولا إلى استخراج أنواع الدهون من مجموعة متنوعة من الأنسجة الحيوانية والنباتية 14 أو تعديلها هنا لفصل السكاريد تحلل من الدهون A. في هذه الخطوة الانفصال النهائي، والكلوروفورم الدهون القابلة للذوبان تقسيم انتقائي في أقل العضوية المرحلة. لمزيد من تنقية الدهون A، عكس المرحلة أوأنيوني عمود التبادل اللوني يمكن استخدام 12.

بعد عزلة من نوع الدهون من الخلايا بأكملها، عددا من الأساليب التحليلية يمكن استخدامها لتوصيف التركيب الكيميائي للمواد المعزولة مثل الرنين المغناطيسي، TLC، وتحليل يستند إلى MS-. NMR يسمح للتوضيح الهيكلية غير مدمرة، ويقدم تفاصيل الهيكلية المتعلقة الروابط غليكوزيدية، الاحالة لا لبس فيه من مواقف سلسلة أسيل، وتعيين مواقع المرفقات للA التعديلات الدهون مثل aminoarabinose أو phosphoethanolamine 15-17. لم يتم مناقشتها تحليل NMR من الدهون وضمن بروتوكول لدينا، ولكن تم صفها على نحو كاف في أماكن أخرى 15،16. للتحليل السريع TLC استنادا تستخدم أساليب كثير من الأحيان، لكنه يفشل في تقديم معلومات مباشرة حول التركيبة الكيميائية غرامة. بروتوكولات MS تستند هي الطريقة الأكثر شيوعا المستخدمة لتوصيف والهياكل الدهون 18،19. المصفوفة المرتبطة الليزر الامتزاز التأين (MALDIوكثيرا ما يستخدم)-MS لمسح الأنواع في البداية سليمة الدهون A. يتم إنشاء الأيونات المشحونة منفردة من الحليلة أعدت وفقا للإجراءات استخراج لدينا. كما هو مطلوب التحليل البنيوي أكثر غرامة، على أساس أساليب MS / MS تكون أكثر إفصاحا من MALDI-MS. إلى جانب لالتأين electrospray (ESI) الدهون اتهم منفردة أو ضرب A أيونات السلائف هي مزيد مجزأة عن طريق الاصطدام الناجم عن تفكك (CID) أو الإنحلال الضوئي فوق البنفسجية (UVPD)، لتوليد أيونات المنتج بالمعلومات هيكليا 18،20،21. وكثيرا ما ولدت أيضا المنتجات وفقدان محايدة من الدهون والأيونات السلائف خلال ESI-MS توفير طبقة إضافية من المعلومات الهيكلية.

وقد ثبت جنبا إلى جنب مطياف الكتلة (MS / MS) لتكون وسيلة لا غنى عنها وتنوعا لتوضيح هياكل الدهون A. خلال MS / MS، يتم تنشيط أيونات لانتاج نمط تجزئة التشخيصية التي يمكن استخدامها لتوضيح هيكل أيون السلائف. لافا على نطاق واسعilable طريقة MS / MS هو CID. وتنتج هذه الطريقة الأيونات عبر جزء اصطدام السلائف أيون اختيارها بغاز خامل الهدف، مما أدى إلى ترسب الطاقة الذي يؤدي إلى التفكك. وقد ثبت CID أداة حاسمة في تخصيص الدهون هيكل لمجموعة واسعة من الأنواع البكتيرية 22-33.

على الرغم من أن إدارة البحث الجنائي هو الأكثر تنفيذا عالميا طريقة MS / MS، فإنه يولد مجموعة محدودة من الأيونات المنتج. 193 نانومتر UVPD هو البديل والتكميلي الأسلوب MS / MS. يستخدم هذا الأسلوب الليزر لأشرق الأيونات، وامتصاص الفوتونات النتائج في energization من الأيونات والتفكك اللاحقة. هذه الطاقة أعلى MS / MS تقنية تنتج مجموعة أكثر تنوعا من المنتجات من الأيونات CID وبالتالي يوفر أنماط تجزئة أكثر بالمعلومات. على وجه الخصوص، UVPD يتيح المعلومات حول التغييرات الطفيفة في أنواع الدهون وبناء على الانشقاقات في غليكوزيدية، أمين، أسيل وCC ربط السندات 18،21،34.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وينبغي إعداد كل الحلول مع الماء عالى النقاء وHPLC الصف الميثانول والكلوروفورم. حلول أعد التي تحتوي على المذيبات العضوية مثل الميثانول، والكلوروفورم، أو البيريدين والأحماض المركزة أو قواعد ينبغي إعداد واستخدامها تحت غطاء الدخان الكيميائية. ويمكن تخزين جميع الحلول في RT. ينبغي قياس المذيبات في اسطوانة تخرج الزجاج وتخزينها في الزجاج والزجاجات مذيب مع السليكوون اصطف مباراة دولية. للتخزين على المدى الطويل يجب أن يتم تخزين المذيبات التي تحتوي على الكلوروفورم في ملون الزجاجات العنبر لتجنب إنتاج الفوسجين، كلوريد حمض شديدة التفاعل. يجب شطف الأنابيب السليكوون الطرد المركزي وقوارير المبخر الدوار مع الميثانول والكلوروفورم قبل الاستخدام. اتباع اللوائح اللازمة الاتحادية والولائية و/ أو التخلص من النفايات المؤسسية عند التخلص من المذيبات و / أو النفايات المشعة.

1. على نطاق واسع الدهن استخراج (50 مل إلى 1.5 L)

  1. إعداد مرحلة واحدة بليغ-داير خليط: كلوروشكل الميثانول-1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، ودرجة الحموضة 7.4؛ 1:2:0.8 ت / ت). الجمع بين 200 مل من الكلوروفورم، 400 مل من الميثانول و 160 مل من برنامج تلفزيوني في 1 لتر زجاجة مذيب. زجاجة كأب وتخلط بواسطة قلب (> 30X). ترخي الغطاء بشكل دوري خلال خلط للتنفيس وتخزين مختومة.
  2. إعداد معايرتها قبل مرحلتين بليغ-داير خليط كلوروفورم: الميثانول: المياه (2:2:1.8 ت / ت). الجمع بين 400 مل من الكلوروفورم، 400 مل من الميثانول و180 مل من الماء في زجاجة 1 لتر المذيب. غطاء زجاجة وتخلط بواسطة انقلاب، والتأكد من أن ترخي غطاء دوريا خلال خلط للتنفيس. دعونا تتوازن O / N وتخزين مختومة.
  3. إعداد خفيفة التحلل حمض العازلة (50 ملي خلات الصوديوم، ودرجة الحموضة 4.5، 1٪ دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS)). ل500 مل من العازلة خفيفة التحلل الحامض، يزن 2.05 غرام من خلات الصوديوم ونقل إلى دورق 500 مل. إضافة الماء إلى وحدة تخزين من ~ 350 مل ويحرك، ثم يضاف 50 مل من 10٪ SDS. خلط وضبط درجة الحموضة إلى 4.5، ونقل إلى الاسطوانة، وإضافة الماء إلى 500 مل.
  4. إعدادالكلوروفورم: الميثانول (4:1، ت / ت): قياس 100 مل من الكلوروفورم ونقلها إلى زجاجة مذيب. قياس 25 مل من الميثانول وتخلط مع الكلوروفورم. تخزين في العنبر زجاجة.
  5. تطعيم 5 مل من وسائل الإعلام (مرق لوريا أو غيرها) من مستعمرة بكتيرية واحدة. تنمو O / N عند 37 درجة مئوية، أو في حاجة ° C للنمو. ويظهر رسم تخطيطي لإجراء الاستخراج في الشكل 2.
  6. في اليوم التالي، وقياس OD 600 واستخدام ثقافة 5 مل O / N لتطعيم 200 مل من ثقافة إلى OD بدءا من 600 0.05. تنمو الخلايا حتى يتم OD يتم التوصل إلى 600 من 0.8-1.0.
  7. خلايا الحصاد عن طريق الطرد المركزي في 10،000 x ج لمدة 10 دقيقة. يدور أطول قد تكون هناك حاجة لسلالات أن بيليه سيئة. تخلصي من طاف وسائل الإعلام.
  8. غسل بيليه الخلية مع 50 مل من الفوسفات مخزنة المالحة 1X (PBS). تكرار الطرد المركزي لبيليه الخلايا. تخلصي من طاف بيليه الخلية وتخزينها في -20 درجة مئوية، أو انتقل إلى الخطوة 1.9.
  9. خلايا resuspend في 40 ملمن برنامج تلفزيوني 1X والفجوة بين اثنين 250 مل أنابيب الطرد المركزي السليكوون (الغلة 20 مل من تعليق خلية / أنبوب). إضافة 25 مل من الكلوروفورم والميثانول 50 مل من كل أنبوب، لمرحلة واحدة بليغ-داير (كلوروفورم: الميثانول: الماء؛ 1:2:0.8 ت / ت) (الشكل 2). مزيج من قبل انقلاب واحتضان على RT ل> 20 دقيقة كاملة لضمان تحلل الخلية.
  10. أجهزة الطرد المركزي الخليط في 2،000 x ج لمدة 20 دقيقة. سوف LPS بيليه جنبا إلى جنب مع البروتينات والأحماض النووية (الشكل 2)، ومع ذلك، سوف الدهون الفوسفاتية والدهون isoprenyl، والببتيدات مسعور صغيرة تبقى في طاف. تجاهل طاف.
  11. غسل بيليه مع LPS ~ 100 مل مرحلة واحدة بليغ-داير الخليط. أجهزة الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 20 دقيقة. تجاهل طاف. عندما عزل الدهون A من E. كولاي أو السالمونيلا، مطلوب غسل واحد فقط، ولكن قد تكون هناك حاجة إلى خطوات غسل إضافية للحد من التلوث فوسفورية عندما عزل الدهون A من بعض الكائنات الحية.
  12. إضافة 27 مل من ميلحمض دينار عازلة المائي (50 ملي خلات الصوديوم، ودرجة الحموضة 4.5، 1٪ SDS، وانظر الخطوة 1.3) لLPS بيليه، ومزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا حتى تبقى فقط جزيئات صغيرة. يصوتن ل resuspend متجانس LPS بيليه في حل مع تلميح التحقيق sonicator في دورة العمل المستمر لمدة 20 ثانية في إخراج 50٪. تكرار صوتنة من 2X العينة (20 ثانية / انفجار، ~ 5 ثانية بين رشقات نارية).
  13. عينات يغلي في حمام مائي لمدة 30 دقيقة. تحذير: تأكد من قبعات ضيقة، ولكن ليس مختومة بالكامل. بعض الكائنات الحية، مثل ضمة الكوليرا (ضمة الكوليرا) تتطلب مرات حضانة أطول (1 ساعة) لزيادة العائد الكلي من الدهون A. إزالة زجاجات من الحمام المائي والسماح لتبرد العينة إلى RT قبل المتابعة.
  14. لاستخراج الدهون بعد التحلل، وتحويل الحل SDS إلى مرحلتين بليغ-داير (الشكل 2) خليط بإضافة 30 مل من الكلوروفورم والميثانول 30 مل من، لكلوروفورم: الميثانول: المياه (2:2:1.8، والخامس / ت) خليط. مزيج من قبل انقلاب وأجهزة الطرد المركزي العينة لمدة 10 دقيقة في 2،ز × 000. استخراج مرحلة انخفاض في السليكوون أنبوب الطرد المركزي نظيفة باستخدام ماصة الزجاج.
  15. إجراء استخراج الثانية بإضافة 30 مل من المرحلة الدنيا من قبل معايرتها مرحلتين بليغ-داير الخليط (الخطوة 1.2)، إلى المرحلة العليا من الخطوة 1.14. المزيج، ثم الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 10 دقيقة. استخراج مرحلة أقل، وتجمع مع المرحلة أقل باستخراج في الخطوة 1.14.
  16. غسل مراحل أقل المجمعة (60 مل الكل) بإضافة 114 مل من معايرتها قبل مرحلتين بليغ-داير المرحلة العليا (الخطوة 1.2) لإنشاء مرحلتين بليغ-داير خليط (كلوروفورم: الميثانول: الماء؛ 02:02: 1.8، ت / ت). المزيج. أجهزة الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 10 دقيقة.
  17. إزالة مرحلة أدنى إلى كوب نظيف الدوارة قارورة المبخر والعينة الجافة باستخدام التبخر الدوارة (الشكل 2).
  18. إضافة 5 مل من الكلوروفورم: الميثانول (4:1، ت / ت) إلى قارورة الدوارة، وحمام يصوتن (> 30 ثانية) للمساعدة في وقف الدهن من الجانبين من القارورة. استخدام ماصة نقل الزجاج لنقل الدهون لنظيفأنبوب زجاجي (13 × 100 مم أو أكبر) توج مع السليكوون اصطف الفينولية قبعات المسمار. عينة الجافة تحت تيار من النيتروجين باستخدام مجفف النيتروجين.
  19. في resuspend الدهون المجففة في 1 مل من الكلوروفورم: الميثانول (4:1، ت / ت). نقل إلى قارورة صغيرة عينة الزجاج (12 × 32 ملم) مع وجود قاعدة مدبب لمزيد من إعادة تعليق الكمي باستخدام كميات صغيرة (انظر الجدول المعدات / الكواشف). تجف باستخدام مجفف النيتروجين.
  20. ويمكن تخزين العينة المجففة في -20 درجة مئوية حتى لاحقة TLC (بروتوكول 2) أو MS تحليل (بروتوكول 3، 4، 5 أو). (ملاحظة: يقترح المبلغ من مادة معزولة واستخدامها في البروتوكولات اللاحقة على أساس ما هو كاف بالنسبة لمعظم الكائنات الحية يمكن استخدام نموذج الدهون في نفس البروتوكولات 2-5، مع ملاحظة المواد٪ إزالة انظر مناقشة لمزيد من التفاصيل.).

2. التصور من الدهون وأنواع عبر طبقة رقيقة اللوني

  1. إعداد نظام الطور المتحرك TLC المذيبات (كلوروفورم: البريدين: حمض الفورميك 88٪: المياه؛ 50:50:16:5 ت / ت). COMBINه 200 مل من الكلوروفورم، 200 مل من البيريدين، 64 مل من حمض الفورميك 88٪، و 20 مل من الماء في زجاجة 1 لتر المذيب. زجاجة كأب، ومزيج من قبل انقلاب عدة مرات، وتنفيس.
  2. استخدام خزان TLC من شأنها أن تستوعب 20 × 20 سم لوحات. خط خزان TLC مع ~ الورق 40 سم اللوني.
  3. إلى خزان TLC إضافة 200 مل من الكلوروفورم: البريدين: 88٪ حمض الفورميك: المياه (50:50:16:5، ت / ت) خليط. السماح للدبابات إلى ما قبل تتوازن ل> 3 ساعة، وغالبا ما يفضل O / N وأكثر ملاءمة.
  4. إزالة الدهون عينات مجففة من الثلاجة (الخطوة 1.20) والسماح الحار RT.
  5. بشفرة الحلاقة إزالة السيليكا من الحافة العلوية من هلام السيليكا TLC 60 لوحة. باستخدام قلم رصاص مملة، ورسم خط مواز إلى أسفل لوحة، 2 سم من أسفل. هذا الخط هو الأصل لاكتشاف العينات. علامة بزيادة طول هذا الخط إشارة إلى بقعة عينات 1 سم عن بعضها البعض.
  6. تذوب الدهون المجففة من الخطوة 2.4 في 200 ميكرولتر من كلوروفورم: الميثانول (4:1، ت / ت)، دوامة ويصوتن (3X، ~ 15 ثانية لكل منهما)، والمحاصيل ~ 100 -500 نانوغرام / ميكرولتر الدهون المستخرجة من A إذا E. القولونية.
  7. باستخدام الماصة الزجاج microcapillary، بقعة واحد على عشرة من حجم (20 ميكرولتر) على لوحة TLC كما تميزت في الخطوة 2.5. تسمح عينات للهواء الجاف على TLC لوحة ل~ 15 دقيقة. (ملاحظة: العينات في قوارير زجاجية صغيرة يمكن أن تجفف باستخدام مجفف النيتروجين وتخزينها في -20 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا في بروتوكولات 3-5 يحيط علما مواد إزالة٪).
  8. وضع TLC لوحة تحتوي على عينات رصدت في خزان معايرتها مسبقا. بعد أن يصل جبهة المذيب الجزء العلوي من لوحة TLC (~ 2.5-3 ساعة)، وإزالة لوحة والهواء الجاف (> 60 دقيقة). بندقية الهواء البارد يمكن استخدامها لضمان جفاف كاملة.
  9. بينما لوحة يتم تجفيف، بدوره على طبق ساخن عند 250 درجة مئوية لمدة تفحيم.
  10. في التهوية غطاء الدخان الكيميائية، وإعداد 10٪ حمض الكبريتيك مزيج الإيثانول لتفحيم الدهون تحل على لوحة السيليكا TLC (حمض الكبريتيك المركز: الإيثانول بنسبة 100٪؛ 01:09 ت / ت). قياس 10 مل من حمض الكبريتيك وإضافة ببطء إلى 90 مل من الإيثانول بنسبة 100٪. رعايةمزيج بالكامل ونقلها إلى كوب الكروماتوغرافي كاشف رذاذ.
  11. في غطاء الدخان، واستخدام الزجاج الكروماتوغرافي كاشف رذاذ للرش لوحة TLC المجفف مع 10٪ الكبريتيك مزيج حمض الايثانول. رش الخليط بالتساوي في جميع أنحاء اللوحة.
  12. وضع لوحة TLC على 250 درجة مئوية لوحة الساخن حتى تظهر عينات الدهون متفحمة كما / بقع بنية اللون الأسود (<1 دقيقة). لا إفرط في التعريض لوحة، وهذا سوف يسبب لوحة كاملة لتحويل البني وجعل التصور من الأنواع الدهنية وصعبة.

3. توصيف الهيكلية من الدهون A-TOF MALDI عبر الطيف الكتلي

  1. من الخطوة 1.20، (أو الخطوة 2.7) إزالة الدهون عينة من الفريزر والسماح الحار RT. في resuspend الدهون المجففة عينة في ~ 20 ميكرولتر كلوروفورم: الميثانول (4:1، ت / ت) ودوامة الحصول على ~ 1-5 ميكروغرام / ميكرولتر الدهون الحل إذا المستخرجة من E. القولونية. (ملاحظة: 10٪ أقل تركيزا إذا المواد المستخدمة من الخطوة 2.7).
  2. إعداد مكونات المصفوفة ATT. مشبعة 6 عزة-2-thiothymine في 50٪ أسيتونتريل: إضافة 500 ميكرولتر من المياه و 500 ميكرولتر من أسيتونتريل إلى 1.5 مل أنبوب microcentrifuge، ثم قم بإضافة> 10 ملغ 6 ازا-2-thiothymine بحيث أسيتونتريل 50٪ هو السوبر المشبعة. المشبعة ثلاثى سترات الأمونيوم الحل: إضافة> 1 ملغ إلى 500 ميكرولتر المياه، ينبغي أن يكون واضحا يعجل بسهولة. دوامة الطرد المركزي والحلول قبل الاستخدام، ويستخدم طاف المشبعة فقط.
  3. إعداد مصفوفة خليط ATT: المشبعة 6 ازا-2-thiothymine في 50٪ أسيتونتريل، سترات الأمونيوم المشبعة ثلاثى (20:01، ت / ت). خلط مكونات المصفوفة معا عن طريق إضافة 20 ميكرولتر من الحل ATT إلى 1 ميكرولتر المشبعة ثلاثى حل سيترات الأمونيوم في 500 ميكرولتر أنبوب microcentrifuge، دوامة خلط، وأجهزة الطرد المركزي قبل تطبيق لوحة MALDI.
  4. إعداد لوحة MALDI بإضافة 0.5 ميكرولتر مزيج calibrant إلى لوحة MALDI على بقعة قرب حيث سيتم إيداع العينات، لتوفير أدق الشامل تهمة / تقرير النسبة.
  5. إيداع 0.5 ميكرولترمن ATT مصفوفة على لوحة MALDI على كل بقعة حيث سيتم إيداع الدهون عينة.
  6. إيداع 0.5 ميكرولتر من العينة (2.5٪ من إجمالي العينة) على بقعة من ATT مصفوفة، لخلط على لوحة، والحصول على أطياف من قبل عينة المسح لإشارات أيون الأمثل (الشكل 3). ملاحظة: المبالغ لمعظم الأمثل MS إشارة يمكن أن تختلف مع الكائن الحي ويجب أن يتم تحديد تجريبيا. لإضافة المزيد من المواد يمكن للمرء أن بقعة 0.5 ميكرولتر عدة مرات السماح خليط رصدت لتجف بين إضافة المزيد من العينة. ويمكن أيضا أن تتركز العينة (الجافة وresuspend في حجم أصغر) أو تضعف عند الضرورة. ويمكن أيضا أكثر انطلاق المواد (حجم بدءا ثقافة الخلية) أن تستخدم (انظر مناقشة).

4. قداس الطيف Electrospray التأين وتصادم المستحثة تفكك الدهون و

  1. إعداد الكلوروفورم: الميثانول خليط المذيبات (1:1، ت / ت) عن طريق خلط مخزون 200 ميكرولتر من HPLC الصف الميثانول مع 200 مل HPLC الصف الكلوروفورم في سول الزجاجتنفيس زجاجة.
  2. نقل 200 ميكرولتر من كلوروفورم: الميثانول خليط المذيبات إلى القارورة مع الدهون A (على سبيل المثال من الخطوة 1.20، 2.7، أو المجففة بعد بروتوكول 3) ويصوتن الدهون حل لمدة 5 دقائق أو حتى يذوب جميع المواد.
  3. إعداد مطياف الكتلة لوضع السلبية التأين electrospray.
  4. باستخدام حقنة 250 ميكرولتر وضخ حقنة، ولبث مباشرة الدهون المخففة عينة بمعدل تدفق 2،0-3،5 ميكرولتر / دقيقة.
  5. تحسين وتعزيز الدهون إشارة أيون عن طريق ضبط البصريات أيون. ويمكن الآن لكامل الطيف الكتلي يتم جمعها من الدهون والأنواع (الشكل 4).
  6. عزل وتفعيل الهدف الدهون A عن طريق تحديد CID كأسلوب MS / MS.
  7. زيادة الجهد CID (أو طاقة الاصطدام تطبيع، NCE) حتى الدهون السلائف والأنواع هي الوفرة النسبية حوالي 10٪ مقارنة مع أعلى ايون المنتج.
  8. اكتساب ومتوسط ​​الأطياف حتى يتحقق يكفي الإشارة إلى الضوضاء عن الالأيونات المنتجات الإلكترونية. عدد بالاشعة حاجة تعتمد على كثافة إشارة من السلائف الأصلي ويمكن أن تتراوح 3-300 بالاشعة (الشكل 5A).

5. MS / MS على الدهن بواسطة الأشعة فوق البنفسجية الإنحلال الضوئي

  1. تحضير العينة ومطياف الكتلة كما في الخطوات 4،1-4،5.
  2. بدوره على الليزر ربطه إلى مطياف الكتلة. تم تجهيزه مطياف الكتلة مع 193 نانومتر الهيجان الليزر وتعديلها لتسمح للأشعة فوق البنفسجية في تفعيل الخلية HCD الصك. تم تنفيذ الإنحلال الضوئي بطريقة مماثلة لتلك التي سبق وصفها 35. نستخدم متعددة فراغ تعديل مع نافذة البصرية الكاف 2 لنقل الفوتونات في الطاقة أعلى C-فخ التفكك (HCD) الخلية. يتم تشغيل الليزر خلال MS / MS من خلال منطق الترانزستور الترانزستور (TTL) إشارة من مطياف الكتلة لمولد النبض / تأخير.
  3. إعداد البرنامج أداة بحيث الليزر سوف يؤدي يزر عندماالأيونات دخول الخلية HCD. وهذا يتطلب تعديل متواضعة من البرنامج.
  4. تشغيل مولد النبض مثل أن الليزر هو نابض كل 2 ميللي ثانية (500 هرتز).
  5. عزل الدهون A أيون السلائف من خلال تحديد HCD كطريقة MS / MS وضبط الطاقة الاصطدامية إلى 1٪ NCE. وهذا يسمح للعزل أيونات أولية لتفارق فوق البنفسجية داخل الخلية HCD. على الرغم من أن يتم استخدام الخلايا HCD، يتم تعديل البرنامج لأداء UVPD خلال هذه الفترة.
  6. تفعيل الدهون معزولة A أيون عن طريق زيادة طاقة الليزر وضبط عدد من نبضات الليزر. سيتم تنفيذ تجربة نموذجية باستخدام عشرة UVPD 6 مل البقول.
  7. كما في الخطوة 4.8، والحصول على متوسط ​​الأطياف حتى يتحقق الضوضاء إشارة إلى ما يكفي لأيونات المنتج UVPD. عدد بالاشعة حاجة تعتمد على كثافة إشارة من السلائف الأصلي ويمكن أن تتراوح 3-300 بالاشعة (الشكل 5B).

6 32 P-صفهامن الدهن والعزلة اللاحقة

  1. تطعيم 5 مل من وسائل الإعلام (مرق لوريا أو وسائل الإعلام الأخرى) من مستعمرة واحدة. تنمو O / N عند 37 درجة مئوية أو على درجة الحرارة المطلوبة.
  2. في اليوم التالي، وقياس OD 600 واستخدام الثقافة O / N لتطعيم 7 مل من ثقافة إلى OD بدءا من 600 ~ 0.05، ونمت في معيار 20 × 150 ملم الزجاج القابل للتصرف أنبوب الثقافة. إضافة 2.5 μCi / مل من غير العضوية 32 P. تنمو الخلايا حتى يتم OD يتم التوصل إلى 600 من 0.8-1.0. يرجى اتباع الاتحادية وحكومات الولايات، و / أو المبادئ التوجيهية المؤسسية لأمان المناولة والسليم للمواد المشعة.
  3. خلايا الحصاد في 16 × 125 ملم أنابيب الطرد المركزي الزجاج مع السليكوون اصطف غطاء باستخدام أجهزة الطرد المركزي السريرية زاوية ثابتة في 1،500 x ج لمدة 10 دقيقة. إزالة طاف في حاوية النفايات المشعة المناسبة. يجب التخلص من جميع النفايات المشعة (مثل السائل والزجاج واقية) ولدت في الخطوات اللاحقة وفقا للدولة اتحادية، و / أو واجهة المستخدم الرسومية المؤسسيةdelines.
  4. غسل بيليه الخلية مع 5 مل من الفوسفات مخزنة المالحة 1X (PBS). أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 1،500 ز س. تجاهل طاف.
  5. خلايا resuspend في 5 مل من مرحلة واحدة بليغ-داير خليط (الشكل 2)، ويتألف من كلوروفورم: الميثانول: المياه (1:2:0.8، ت / ت). دوامة لخلط، واحتضان على RT ل> 20 دقيقة كاملة لضمان تحلل الخلية.
  6. أجهزة الطرد المركزي في أجهزة الطرد المركزي السريرية في 1،500 x ج لمدة 20 دقيقة. تصب بلطف طاف، والذي يحتوي على الدهون الفوسفاتية والدهون isoprenyl.
  7. resuspend الكرية LPS في 1.8 مل من 50 ملي خلات الصوديوم، ودرجة الحموضة 4.5، 1٪ SDS العازلة من قبل vortexing. يصوتن العينة باستخدام sonicator حمام حتى يتم فرقت بالتساوي بيليه (~ 30 ثانية).
  8. احتضان العينة لمدة 30 دقيقة في حمام ماء يغلي. جعل متأكد من قبعات ضيقة ولكن ليس مختومة.
  9. إزالة من حمام الماء والسماح لتبريد العينة على RT لمدة 5-10 دقيقة.
  10. تحويل الحل إلى مرحلتين بليغ-داير الخليط بإضافة 2 مل من الكلوروفورم و 2 مل منالميثانول، مما أسفر عن الكلوروفورم: الميثانول: مائي (2:2:1.8 ت / ت) خليط. دوامة لخلط، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في أجهزة الطرد المركزي السريرية في 1،500 x ج لمراحل منفصلة.
  11. استخراج مرحلة انخفاض في أنبوب زجاجي نظيف الطرد المركزي باستخدام ماصة الزجاج (استخراج أول).
  12. إجراء استخراج الثانية على العينة بإضافة 2 مل من معايرتها قبل مرحلتين بليغ-داير المرحلة الدنيا (أعد كما في الخطوة 1.2) إلى المرحلة العليا المتبقية من الخطوة 11. دوامة وأجهزة الطرد المركزي 10 دقيقة. إزالة المرحلة الدنيا وتتحد مع المرحلة أقل من استخراج الأولى.
  13. إلى انخفاض مرحلة تجميع (~ 4 مل الحجم الكلي)، إضافة 7.6 مل من قبل معايرتها المرحلة العليا (الخطوة 1.2)، مما أسفر عن مرحلتين بليغ-داير حل (كلوروفورم: الميثانول: الماء؛ 2:2:1.8، والخامس / ت). دوامة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة.
  14. إزالة مرحلة أدنى إلى أنبوب زجاجي نظيفة وجافة باستخدام مجفف النيتروجين. ويمكن تخزين العينات المجففة في -20 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.

7. Visualiاالنترنت من 32 ف المسمى الدهن الأنواع عبر طبقة رقيقة اللوني

  1. إعداد 32 ف المسمى الدهون عينة، خزان TLC، وألواح TLC كما هو موضح في الخطوات 2،1-2،8.
  2. حل 32 ف المسمى عينة في 500 ميكرولتر 4:1 كلوروفورم الميثانول (ت / ت). دوامة وحمام يصوتن لإذابة الدهون تماما المواد. إضافة 5 ميكرولتر من عينة لالتلألؤ قارورة تحتوي على 5 مل من التلألؤ كوكتيل. عد في عداد التلألؤ وحساب التهم الكل / دقيقة من العينة.
  3. عندما تصور أنواع الدهون رديولبلد، 10 × 20 سم أو 20 × 20 سم لوحات TLC يمكن استخدامها. لوحات 10X20 سم، ينبغي أن رصدت عينات على طول المنشأ ملحوظ في الخطوة 2.5 بحيث أطول لوحة البعد هو العمودي (أي عينات رصدت في الأصل علامة 2 سم فوق 10 سم الحافة).
  4. باستخدام ماصة microcapillary، بقعة 10،000-20،000 نسخة في الدقيقة / عينة على لوحة والسماح لتجف البقع (> 15 دقيقة). قد تحتاج العينات إلى التركز من خلال تجفيف تحتالنيتروجين ومعلق في حجم مناسب، لتحقيق 10،000-20،000 التهم / دقيقة / بقعة (2 ميكرولتر ميكرولتر أو 2 في وقت ل<10 ميكرولتر المجموع).
  5. وضع TLC لوحة تحتوي على عينات رديولبلد في خزان معايرتها مسبقا. بعد أن يصل جبهة المذيب الجزء العلوي من لوحة TLC (~ 3 ساعة)، وإزالة لوحة والهواء الجاف (> 60 دقيقة). الحذر: لوحات TLC تشغيل في وجود البيريدين يجب أن تجفف جيدا في غطاء الدخان الكيميائية، وكميات ضئيلة من البريدين يمكن أن تلحق الضرر شاشات phosphorimaging. بندقية الهواء البارد يمكن استخدامها لضمان جفاف كاملة.
  6. التفاف لوحة في غلاف بلاستيكي وفضح لشاشة phosphorImager في تصوير الإشعاع الذاتي كاسيت O / N. في صباح اليوم التالي، مسح الشاشة للحصول على الصورة (الشكل 6). باستخدام صورة برمجيات تحليل كثافة، ويسمح هذا الأسلوب للدقيقة، الكمي النسبية للأنواع الدهون A.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

الكنسي الدهون ألف من E. كولاي والسالمونيلا الملهبة للضرب مصلي التيفية الفأرية هو ديساكهارايد-acylated سداسي الجلوكوزامين مع مجموعات الفوسفات في 1 - 4 و'المواقف. خلال النمو في وسائل الإعلام الغنية (مثل لوريا مرق) جزء من الدهون ويحتوي على مجموعة بيروفوسفات في موقف 1 مما أسفر عن الأنواع تريس فسفرته 36 (الشكل 1). KDO (3-ديوكسي-D-مانو octulosonic حامض)، ويرد على الهيدروكسيل-6'وبمثابة جسر لربط الدهون والكربوهيدرات إ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذا البروتوكول قمنا المفصل عزلة هناك أنواع الدهون من الخلايا كاملة من البكتيريا، ووصف TLC أو الأساليب التحليلية القائمة على MS لتوصيف هذه المواد كيميائيا معزولة. جنبا إلى جنب مطياف الكتلة هو استراتيجية قوية لدي نوفو توصيف الهيكلية من المركبات البيولوجية، ولا تقدر بثمن لتوصيف الكيميائية للغطاء واق من جزيئات الدهون لوحظت في الطبيعة. CID وUVPD طريقتان تفعيل التكميلية التي تخلق أنواع مختلفة من أيونات المنتجات التي توفر بصمات الرئيسية للدهون والجزيئات. MS / MS تجزئة باستخدا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

أعلن عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل عن طريق منح AI064184 وAI76322 من المعاهد الوطنية للصحة (NIH) وغرانت 61789-MA-MUR من مكتب أبحاث الجيش للبحوث MST كان مدعوما أيضا من قبل مؤسسة ولش منحة المعاهد الوطنية للصحة منح F1155 وR01GM103655 إلى JSB

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الكلوروفورمالحرارية فيشر العلميةC607HPLC الصف
الميثانولالحرارية فيشر العلميةA452HPLC الصف
تفلون FEP زجاجات الطرد المركزيالحرارية فيشر العلمية05-562-21
هلام السيليكا 60 لوحة TLCEMD Biosciences5626-6
الصف رقم 3 مم ورق الكروماتوغرافياواتمان3030700
Orbitrap EliteThermo Fisher مطياف
الكتلة
ExciStar XS Excimer LasrerCoherent Inc.
بواعث PicoTip Nanospray ESINew Obectives&# 8805; 30 & mu; م لتقليل الانسداد
موديل 505 مولد النبض / التأخيرBerkeley Nucleonics Corporation
Hot Plate Thermoylne 2200Barnstead / ThermolyneHPA2235MQ
16x125 mm GPI 15-415 أنابيب ثقافة البورسليكات الملولبة التي يمكن التخلص منها CorningPyrex99449-16X
أغطية لولبية PTFE الخيوط القابلة لإعادة الاستخدام GPI 45-415Corning9999-152
نظام التصوير الجزيئي الشخصي (فوسفوريجر)BioRad170-9400
كاسيت التصويرالذاتي ثيرمو فيشر العلميFBCS810
الفوسفور SO230طقم معايير كتلة الببتيد كوداك
SequazymeP2-3143-00
Sonifier S250-Aبرانسون101063196
1.5 مل 12x32 مم مدبب قاعدة برغي الموضوع قارورةالحرارية فيشر العلميةC4000-V1
العلمي

المراجع

  1. Trent, M. S., Stead, C. M., Tran, A. X., Hankins, J. V. Diversity of endotoxin and its impact on pathogenesis. Journal of endotoxin research. 12, 205-223 (2006).
  2. Raetz, C. R., Whitfield, C. Lipopolysaccharide endotoxins. Annu Rev. Biochem. 71, 635-700 (2002).
  3. Raetz, C. R., Reynolds, C. M., Trent, M. S., Bishop, R. E. Lipid A Modification Systems in Gram-Negative Bacteria. Annu. Rev. Biochem. 76, 295-329 (2007).
  4. Kim, H. M., et al. Crystal structure of the TLR4-MD-2 complex with bound endotoxin antagonist Eritoran. Cell. 130, 906-917 (2007).
  5. Rietschel, E. T., et al. Bacterial endotoxin: molecular relationships of structure to activity and function. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 8, 217-225 (1994).
  6. Medzhitov, R., Janeway, C. Innate immunity. The New England journal of medicine. 343, 338-344 (2000).
  7. Dinarello, C. A. Interleukin-1 and interleukin-1 antagonism. Blood. 77, 1627-1652 (1991).
  8. Guo, L., et al. Lipid A acylation and bacterial resistance against vertebrate antimicrobial peptides. Cell. 95, 189-198 (1998).
  9. Yi, E. C., Hackett, M. Rapid isolation method for lipopolysaccharide and lipid A from gram-negative bacteria. The Analyst. 125, 651-656 (2000).
  10. Westphal, O. aJ., K, Bacterial Lipopolysaccharide. Extraction with phenol-water and further application of the procedure. Methods Carbohydr. Chem. 5, 83-91 (1965).
  11. Galanos, C., Luderitz, O., Westphal, O. A new method for the extraction of R lipopolysaccharides. European journal of biochemistry / FEBS. 9, 245-249 (1969).
  12. Raetz, C. R., Purcell, S., Meyer, M. V., Qureshi, N., Takayama, K. Isolation and characterization of eight lipid A precursors from a 3-deoxy-D-manno-octylosonic acid-deficient mutant of Salmonella typhimurium. The Journal of biological chemistry. 260, 16080-16088 (1985).
  13. Caroff, M., Deprun, C., Karibian, D., Szabo, L. Analysis of unmodified endotoxin preparations by 252Cf plasma desorption mass spectrometry. Determination of molecular masses of the constituent native lipopolysaccharides. The Journal of biological chemistry. 266, 18543-18549 (1991).
  14. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian journal of biochemistry and physiology. 37, 911-917 (1959).
  15. Zhou, Z., Ribeiro, A. A., Raetz, C. R. High-resolution NMR spectroscopy of lipid A molecules containing 4-amino-4-deoxy-L-arabinose and phosphoethanolamine substituents. Different attachment sites on lipid A molecules from NH4VO3-treated Escherichia coli versus kdsA mutants of Salmonella typhimurium. The Journal of biological chemistry. 275, 13542-13551 (2000).
  16. Wang, X., et al. Structure and biosynthesis of free lipid A molecules that replace lipopolysaccharide in Francisella tularensis subsp. novicida. Biochemistry. 45, 14427-14440 (2006).
  17. Strain, S. M., et al. Location of polar substituents and fatty acyl chains on lipid A precursors from a 3-deoxy-D-manno-octulosonic acid-deficient mutant of Salmonella typhimurium. Studies by 1H, 13C, and 31P nuclear magnetic resonance. The Journal of biological chemistry. 260, 16089-16098 (1985).
  18. Madsen, J. A., Cullen, T. W., Trent, M. S., Brodbelt, J. S. IR and UV Photodissociation as Analytical Tools for Characterizing Lipid A Structures. Analytical Chemistry (Washington, DC, United States. 83, 5107-5113 (2011).
  19. Banoub, J. H., El Aneed, A., Cohen, A. M., Joly, N. Structural investigation of bacterial lipopolysaccharides by mass spectrometry and tandem mass spectrometry. Mass Spectrom. Rev. 29, 606-650 (2010).
  20. Hankins, J. V., Trent, M. S. Secondary acylation of Vibrio cholerae lipopolysaccharide requires phosphorylation of Kdo. The Journal of biological chemistry. 284, 25804-25812 (2009).
  21. Hankins, J. V., et al. Elucidation of a novel Vibrio cholerae lipid A secondary hydroxy-acyltransferase and its role in innate immune recognition. Molecular Microbiology. 81, 1313-1329 (2011).
  22. Chan, S., Reinhold, V. N. Detailed structural characterization of lipid A: electrospray ionization coupled with tandem mass spectrometry. Anal. Biochem. 218, 63-73 (1994).
  23. Boue, S. M., Cole, R. B. Confirmation of the structure of lipid A from Enterobacter agglomerans by electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 35, 361-368 (2000).
  24. Kussak, A., Weintraub, A. Quadrupole ion-trap mass spectrometry to locate fatty acids on lipid A from Gram-negative bacteria. Anal. Biochem. 307, 131-137 (2002).
  25. El-Aneed, A., Banoub, J. Elucidation of the molecular structure of lipid A isolated from both a rough mutant and a wild strain of Aeromonas salmonicida lipopolysaccharides using electrospray ionization quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 19, 1683-1695 (2005).
  26. Murphy, R. C., Raetz, C. R. H., Reynolds, C. M., Barkley, R. M. Mass spectrometry advances in lipidomica: collision-induced decomposition of Kdo2-lipid A. Prostaglandins Other Lipid Mediators. 77, 131-140 (2005).
  27. Lee, C. -S., Kim, Y. -G., Joo, H. -S., Kim, B. -G. Structural analysis of lipid A from Escherichia coli O157:H7:K- using thin-layer chromatography and ion-trap mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 39, 514-525 (2004).
  28. Wang, Z., Li, J., Altman, E. Structural characterization of the lipid A region of Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida lipopolysaccharide. Carbohydr. Res. 341, 2816-2825 (2006).
  29. Mikhail, I., Yildirim, H. H., Lindahl, E. C. H., Schweda, E. K. H. Structural characterization of lipid A from nontypeable and type f Haemophilus influenzae: variability of fatty acid substitution. Anal. Biochem. 340, 303-316 (2005).
  30. Madalinski, G., Fournier, F., Wind, F. -L., Afonso, C., Tabet, J. -C. Gram-negative bacterial lipid A analysis by negative electrospray ion trap mass spectrometry: Stepwise dissociations of deprotonated species under low energy CID conditions. Int. J. Mass Spectrom. 249, 77-92 (2006).
  31. Silipo, A., et al. Structural characterizations of lipids A by MS/MS of doubly charged ions on a hybrid linear ion trap/orbitrap mass spectrometer. J. Mass Spectrom. 43, 478-484 (2008).
  32. Jones, J. W., Shaffer, S. A., Ernst, R. K., Goodlett, D. R., Turecek, F. Determination of pyrophosphorylated forms of lipid A in gram-negative bacteria using a multivaried mass spectrometric approach. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 105, 12742-12747 (2008).
  33. Jones, J. W., Cohen, ie, Turecek, F., Goodlett, D. R., Ernst, R. K. Comprehensive structure characterization of lipid A extracted from Yersinia pestis for determination of its phosphorylation configuration. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 21, 785-799 (2010).
  34. Hankins, J. V., Madsen, J. A., Giles, D. K., Brodbelt, J. S., Trent, M. S. Amino acid addition to Vibrio cholerae LPS establishes a link between surface remodeling in gram-positive and gram-negative bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 8722-8727 (2012).
  35. Han, S. W., et al. Tyrosine sulfation in a Gram-negative bacterium. Nature. 3, 1153-1110 (2012).
  36. Touze, T., Tran, A. X., Hankins, J. V., Mengin-Lecreulx, D., Trent, M. S. Periplasmic phosphorylation of lipid A is linked to the synthesis of undecaprenyl phosphate. Mol. Microbiol. 67, 264-277 (2008).
  37. Galloway, S. M., Raetz, C. R. A mutant of Escherichia coli defective in the first step of endotoxin biosynthesis. The Journal of biological chemistry. , 265-6394 (1990).
  38. Trent, M. S., et al. Accumulation of a polyisoprene-linked amino sugar in polymyxin-resistant Salmonella typhimurium and Escherichia coli: structural characterization and transfer to lipid A in the periplasm. The Journal of biological chemistry. 276, 43132-43144 (2001).
  39. Chung, H. S., Raetz, C. R. Dioxygenases in Burkholderia ambifaria and Yersinia pestis that hydroxylate the outer Kdo unit of lipopolysaccharide. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 510-515 (2011).
  40. Zhou, Z., Lin, S., Cotter, R. J., Raetz, C. R. Lipid A modifications characteristic of Salmonella typhimurium are induced by NH4VO3 in Escherichia coli K12. Detection of 4-amino-4-deoxy-L-arabinose, phosphoethanolamine and palmitate. The Journal of biological chemistry. 274, 18503-18514 (1999).
  41. Raetz, C. R., et al. Kdo2-Lipid A of Escherichia coli, a defined endotoxin that activates macrophages via TLR-4. Journal of lipid research. 47, 1097-1111 (2006).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Lipid A MALDI TOF ESI MS MS

مقالات ذات صلة