نحن تصف استخدام اثنين من ratiometric، أجهزة الاستشعار المشفرة وراثيا، والتي تقوم على GFP، لرصد الميتوكوندريا الدولة الأكسدة ومستويات ATP في قرار التحت خلوية في الخلايا الحية الخميرة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
أجهزة الاستشعار التي تقيس Ratiometric الدولة الأكسدة الميتوكوندريا وATP في الخلايا الحية الخميرة
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الميتوكوندريا لها أدوار في العديد من العمليات الخلوية، من استقلاب الطاقة والكالسيوم للسيطرة الخلوية العمر وموت الخلية المبرمج. تؤثر هذه العمليات وتتأثر حالة الأكسدة من إنتاج ATP وبواسطة الميتوكوندريا. هنا، نحن تصف استخدام اثنين من ratiometric، أجهزة الاستشعار المشفرة وراثيا التي يمكن الكشف عن الميتوكوندريا الدولة الأكسدة ومستويات ATP في قرار التحت خلوية في الخلايا الحية الخميرة. يتم قياس حالة الأكسدة الميتوكوندريا باستخدام حساسة الأكسدة بروتين الفلورية الخضراء (roGFP) التي يتم تستهدف المصفوفة الميتوكوندريا. ميتو-roGFP يحتوي cysteines في مناصب 147 و 204 من GFP، التي تخضع الأكسدة عكسها والتي تعتمد على البيئة والحد، والذي بدوره يغير من الطيف الإثارة من البروتين. MitGO-ATeam هو صدى نقل الطاقة فورستر (الحنق) التحقيق فيها الوحيدات ε من F o غير محصورة F 1-ATP سينسيز بين الحنق المانحة ومتقبل FLUOالبروتينات rescent. ملزمة للاعبي التنس المحترفين لنتائج الوحيدات ε في التغييرات التشكل في البروتين التي تجلب الحنق المانحة ومتقبل في القرب والسماح للصدى مضان نقل الطاقة من الجهة المانحة إلى متقبل.
المقدمة
الميتوكوندريا هي عضيات ضرورية لإنتاج ATP، الحيوي من الأحماض الأمينية، والأحماض الدهنية، الهيم، الحديد كتل الكبريت والبريميدينات. الميتوكوندريا أيضا أن تلعب دورا محوريا في الكالسيوم، وتنظيم موت الخلايا المبرمج. 1 زيادة الروابط أدلة الميتوكوندريا إلى الشيخوخة، والمرتبط بالعمر الأمراض بما في ذلك مرض باركنسون ومرض الزهايمر والتصلب الوحشي الضموري، ومرض هنتنغتون. 2 بينما الأفراد يعيشون حياتهم كلها مع الطفرات في الميتوكوندريا البروتينات التي ترتبط مع أمراض الاعصاب، تحدث أعراض المرض في وقت لاحق فقط في الحياة. وهذا يدل على أن التغيرات تحدث في الميتوكوندريا مع التقدم في السن التي تسمح علم الأمراض في الظهور. في الواق....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. التحول من خلايا الخميرة مع أجهزة الاستشعار
- تحويل سلالة الخميرة المطلوب مع البلازميد تحمل ميتو-roGFP أو mitGO-ATeam2 باستخدام طريقة خلات ليثيوم 27.
- لتأكيد التحول مع جهاز الاستشعار البيولوجي التي تنقلها البلازميد ومنع فقدان البلازميد، حدد والحفاظ على transformants المتوسطة كاملة الاصطناعية انتقائية مناسبة (SC-أورا لميتو-roGFP، أو SC-LEU لmitGo-ATeam2). إذا كان قد تم subcloned التحقيق الفلورسنت في البلازميد تختلف عن تلك الموصوفة هنا، استخدم وسيلة انتقائية المناسبة. تصور transfor....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
قياس حالة الأكسدة الميتوكوندريا مع ميتو-roGFP
هنا، وتبين لنا أن ميتو-roGFP1 لديه مجموعة ديناميكية للكشف عن تغيرات في حالة الأكسدة الميتوكوندريا من تتأكسد تماما إلى انخفاض في الخلايا الحية الخميرة، دون أن يؤثر نمو الخلايا الخميرة أو التشكل الميتوكوندريا. أولا، نجد الخلايا معربا عن GFP الميتوكوندريا التي تستهدف وroGFP1 تنمو بمعدلات طبيعية (الشكل 1A). معدل النمو الأقصى، مقاسا أقصى المنحدر من منحنى النم.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هنا، نحن تصف أساليب لاستخدام ميتو-roGFP1 وmitGO-ATeam2 كما أجهزة الاستشعار لتقييم الميتوكوندريا الدولة الأكسدة ومستويات ATP في الخلايا الحية الخميرة. نجد أن التعبير التي تنقلها البلازميد ميتو-roGFP1 أو mitGO-ATeam النتائج في كمية استهداف الميتوكوندريا، دون أي تأثير واضح على التشكل الميتوكوندريا أو توزيع أو على معدلات النمو الخلوية. 3 يمكن ميتو-roGFP1 كشف عن تغيرات في حالة الأكسدة الميتوكوندريا من غاية تتأكسد إلى انخفاض كبير الدول. وبالمثل، يمكن mitGO-ATeam قياس التغيرات.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل من قبل جوائز من HHMI 56006760 لJDV، والمعاهد الوطنية للصحة (NIH) (2 TL1 RR 24158-6) إلى DMAW، وعن المؤسسة الطبية إليسون (AG-SS-2465)، والمعاهد الوطنية للصحة (GM45735، GM45735S1 وGM096445) ليرة لبنانية. صدر GM45735S1 من المعاهد الوطنية للصحة تحت الأميركي لإنعاش الاقتصاد وإعادة الاستثمار قانون عام 2009. وقد أيد المجاهر المستخدمة في هذه الدراسات جزئيا من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة / NCI (5 P30 CA13696).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي > كواشف < / قوي > | |||
| Antimycin A | Sigma-Aldrich (سانت لويس ، ميزوري) | 1397-94-0 | مذاب في الإيثانول إلى محلول مخزون 2 مجم / مل. |
| SGlyc (القائم على الجلسرين الاصطناعي) وسط نمو الخميرة * حذف SGlyc-Ura ** حذف ل SGlyc-Leu | تذوب في H2< / sub>O. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 5.5 باستخدام NaHCO3< / sub>. الأوتوكلاف. المكونات: < / em>0.67٪ قاعدة نيتروجين خميرة بدون أحماض أمينية 3٪ جلسرين 0.05٪ جلوكوز 2 مجم / مل أدينين 2 مجم / مل يوراسيل * 1 مجم / مل L-arginine 1 مجم / مل L-histidine 1 مجم / مل L-leucine ** 3 مجم / مل L-lysine 2 مجم / مل L-methionine 4 مجم / مل L-phenylalanine 2 مجم / مل L-tryptophan 3 مجم / مل L-tyrosine | ||
| SC (الاصطناعية الكاملة ، القائمة على الجلوكوز) وسط نمو الخميرة * حذف SGlyc-Ura ** حذف ل SGlyc-Leu | تذوب في H2< / sub>O. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 5.5 باستخدام NaHCO3< / sub>. الأوتوكلاف. المكونات: < / م > 0.67٪ قاعدة نيتروجين خميرة بدون أحماض أمينية 3٪ جلوكوز 2 مجم / مل الأدينين 2 مجم / مل يوراسيل * 1 مجم / مل L-arginine 1 مجم / مل L-histidine 1 مجم / مل L-leucine ** 3 مجم / مل L-lysine 2 مجم / مل L-methionine 4 ملغ / مل L-فينيل ألانين 2 مجم / مل L-tryptophan 3 مجم / مل L-tyrosine | ||
| Valap | امزج المكونات بنسبة 1: 1: 1 (w: w: w). تذوب عن طريق الغمر في 70 درجة ؛ C H2< / sub>O حمام. Aliquot في أطباق بتري الزجاجية. يحفظ في درجة حرارة الغرفة. المكونات: < / em > الفازلين ، البارافين الصلب ، اللانولين | ||
| ؛ | <قوي > المعدات والبرمجيات < / قوي > | ||
| منظف مسبقا ختم الذهب طقوس الشرائح الصغيرة توماس | Scientific (سويدسبورو ، نيوجيرسي) | 3050 | الحجم: 25 × 75 مم ؛ السماكة: 0.93 إلى 1.05 مم |
| أغطية عالية الأداء ، رقم 1.5 ، 18 × 18 مم | زايس (ثورنوود، نيويورك) | 474030-9000-000 | هذه أقل تغيرا في السماكة (170 & plusmn; 5 & مو م) من الأغطية القياسية ، مما يقلل من الانحراف الكروي ويحسن أداء التصوير ثلاثي الأبعاد |
| Fisherbrand Microscope Cover Glass ، رقم 1.5 | فيشر Scientific (بيتسبرغ ، بنسلفانيا) | 12-545E | الحجم: 22 × 22 مم ، سمك رقم 1.5 (170 & mu ؛ م) |
| مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر A1 مع كاشف طيفي وهدف 100x / 1.49 NA Apo-TIRF | نيكون (ميلفيل ، نيويورك) | ؛ | |
| مجهر AxioObserver.Z1 مجهز بهدف 100x / 1.3NA EC Plan-Neofluar (Zeiss) وكاميرا CCD مبردة Orca ER (Hamamatsu) ويتم التحكم فيها بواسطة برنامج Axiovision | Zeiss (ثورنوود, نيويورك); هاماماتسو (مدينة هاماماتسو ، اليابان) | ؛ | |
| برنامج تحليل الصور 3D Volocity | Perkin Elmer (Waltham ، MA) وحدة | استعادة للتفكك ؛ وحدة القياس الكمي لحساب النسبة وقياسها | |
| برنامج ImageJ | المعاهد الوطنية للصحة (بيثيسدا ، دكتوراه في الطب) | < href = "http://rsb.info.nih.gov/ij/" الهدف = "_blank" >http://rsb.info.nih.gov/ij/< / أ> |
المراجع
- Rizzuto, R., De Stefani, D., Raffaello, A., Mammucari, C. Mitochondria as sensors and regulators of calcium signalling. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 13 (9), 566-578 (2012).
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6),....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
