مقالة منهجية

عزل خالية من التسمية والإثراء من خلال خلايا تلامس Dielectrophoresis

17.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/50634

⸱

سبتمبر 3, 2013

 ,  ,  , 
1School of Biomedical Engineering and Science, Virginia Tech, 2Department of Engineering Science and Mechanics, Virginia Tech

في هذه المقالة

ملخص

dielectrophoresis تماس (CDEP) يحقق الفرز وإثراء الجزيئات عبر خصائص عازلة الذاتية الخاصة بهم. قنوات القطب فلويديك استبدال الأقطاب المعدنية التقليدية لDEP، تناسب CDEP لعدم الإضرار-توصيف العقيمة والفرز من الجزيئات البيولوجية. ونحن لشرح كيفية إعداد microdevice CDEP وإجراء توصيف الخلايا والتجارب الفرز.

الملخص

Dielectrophoresis (DEP) هي الظاهرة التي الاستقطاب الجزيئات في مجال كهربائي غير موحدة تخضع حركة متعدية، ويمكن استخدامها لتوجيه حركة المجهرية الدقيقة في سطح علامة مستقلة الطريقة. تقليديا، وتشمل الأجهزة DEP الأقطاب المعدنية مستو منقوشة في القناة العينة. هذا النهج يمكن أن تكون مكلفة وتتطلب بيئة غرف الأبحاث المتخصصة. مؤخرا، تم تطوير نهج خالية من الاتصال يسمى dielectrophoresis تماس (CDEP). يستخدم هذا الأسلوب مبدأ الكلاسيكي DEP مع تجنب الاتصال المباشر بين الأقطاب وعينة من الزخرفة أقطاب فلويديك وقناة عينة من polydimethylsiloxane واحد (PDMS) الركيزة، ويحتوي التطبيق كاستراتيجية ميكروفلويديك السريع المصممة لفرز وإثراء المجهرية الدقيقة. فريدة من نوعها لهذا الأسلوب هو أن يتم إنشاء الحقل الكهربائي عبر قنوات القطب فلويديك تحتوي على السائل موصل للغاية، والتي يتم فصلها عنقناة عينة من حاجز رقيقة عازلة. لأن أقطاب معدنية عدم الاتصال مباشرة العينة، وتجنب التحليل الكهربائي، القطب التبطين، وتلوث العينة. بالإضافة إلى ذلك، وهذا يتيح عملية تلفيق غير مكلفة وبسيطة.

CDEP وبالتالي مناسبة تماما لمعالجة الجزيئات البيولوجية الحساسة. قوة dielectrophoretic بناء على الجزيئات لا يتوقف فقط على التدرجات المكانية للحقل الكهربائية المولدة حسب التصميم للتخصيص للهندسة الجهاز، ولكن الخصائص الفيزيائية الحيوية الجوهرية للخلية. على هذا النحو، CDEP هي تقنية خالية من التسمية التي يتجنب تبعا المؤشرات الحيوية، وأعرب سطح الجزيئية التي يمكن التعبير بنسب مختلفة ضمن مجموعة من السكان، في حين لا يزال يسمح توصيف، والإثراء، وفرز bioparticles.

هنا، ونحن لشرح أساسيات تصنيع والتجريب باستخدام CDEP. نفسر إعداد بسيطة من شريحة CDEP باستخدام الطباعة الحجرية الناعمةتقنيات ذ. نناقش الإجراء التجريبي لوصف تردد كروس من الجسيمات أو الخلية، والتردد الذي القوة dielectrophoretic هو صفر. أخيرا، علينا أن نظهر استخدام هذه التقنية لفرز خليط من خلايا سرطان المبيض والاستشعاع المجهرية (الخرز).

المقدمة

تخصيب عينة بيولوجية والجسيمات الفرز غالبا ما يكون ضروريا لتحليلها لاحقا. 1 على سبيل المثال، عزل الخلايا نادرة من سوائل الجسم لها تطبيقات مهمة في الكشف عن السرطان والطب فردية. 2،3 وتقنيات تخصيب الأكثر شيوعا هي فلوري خلية تنشيط الفرز (FACS ) 4 وتنشيط الخلايا الفرز المغناطيسي (MACS)، 5 والتي تعتمد على علامات سطح أعرب لتمييز الخلايا. وتشمل الاستراتيجيات الأخرى الهيدروديناميكية 6 أو بالقصور الذاتي 7،8 الفرز، ملاقط بصرية، 9 acoustophoresis و 10 و dielectrophoresis. 11،12 Dielectrophoresis هو حركة الجسيمات الاستقطاب في وجود حقل كهربائي غير موحدة. وقد استخدم 13 DEP ل مجموعة واسعة من التطبيقات، بما في ذلك الخلايا 2،14 الفرز على أساس الجدوى، 15 تميز خصائص bioelectrical من الخلايا، ونوع 16 جي على التغيرات المستحثة في الخصائص الفيزيائية الحيوية للخلايا. يستخدم 17،18 DEP التقليدية أقطاب مستو منقوشة داخل قناة ميكروفلويديك لتطبيق الجهد وإحداث 13 غير موحدة الحقل الكهربائي. في حين أن هذا هو أسلوب قوية، يمكن أن تنشأ التحديات، مثل التبطين والقطب الكهربائي. dielectrophoresis مقرها عازل (المعهد) 19 وقد تناولت تحديات قاذورات، القطب التبطين، والتدهور المكاني للمجال الكهربائي من خلال تنميط هياكل العازلة التي تحفز على عدم الإتساق في حقل كهربائي DC. وقد استخدم المعهد لفصل انتقائي خلايا البكتيريا الحية والميتة، 19 عزل الجراثيم البكتيرية و 20 و التلاعب الحمض النووي، و21 بين التطبيقات الأخرى. التدفئة الجول يمكن أن يشكل تحديا لأنه يمكن أن يحدث نتيجة لارتفاع الفولتية DC المطلوبة في كثير من الأحيان. لتحسين هذه التحديات، وضعت الأجهزة بالغة الصغر خالية من الاتصال DEP. 22-24

ق = "jove_content"> هذه التقنية المعروضة هنا يستخدم تماس dielectrophoresis (CDEP)، سميت بذلك لعدم وجود اتصال مباشر بين الأقطاب المعدنية والقناة العينة. 22 فريدة من نوعها لهذه الاستراتيجية هو استبدال الأقطاب المعدنية مع قنوات القطب السوائل مليئة حل موصل للغاية. تقترن هذه الأقطاب السوائل سعويا عبر الحاجز رقيقة عازلة للقناة عينة عن طريق الجهد AC. القضاء على عينة اتصال مع أقطاب يقلل من القضايا المرتبطة على أساس أساليب DEP مثل التحليل الكهربائي وتشكيل فقاعة، وتلوث العينة، والقطب التبطين. ونتيجة لذلك، CDEP مفيد وخاصة بالنسبة للعينات البيولوجية لأنها تدعم بقاء الخلايا في العينة. الأهم من ذلك، يمكن CDEP الحفاظ على عينة العقم. رقاقة يمكن أن تكون على استعداد في غطاء خلية ثقافة ويمكن أن تجرى التجربة دون الحاجة إلى الاتصال عينة أقطاب معدنية أو التي تتطلب أن تكون العينة مفتوحة للenvironmeالإقليم الشمالي. خزان بسيطة يمكن ان تكون ثابتة إلى منفذ رقاقة لتسهيل الانتعاش العقيمة العينة. بالإضافة إلى ذلك، تلفيق أقطاب السائل من نفس مادة البوليمر حيويا (PDMS) كقناة عينة يقلل من التكلفة الباهظة التي تتكبدها مع الزخرفة المخصصة من الأقطاب الكهربائية المعدنية، والوقت اللازم لتصنيع، ويحد من الحاجة إلى معدات غرف الأبحاث المتخصصة إلى الزخرفة الأولية من الطوابع قابلة لإعادة الاستخدام رقاقة السيليكون.

حركة الجسيمات نتيجة لDEP يعتمد على خصائص الجسيمات والمتوسطة، فضلا عن التدرجات المكانية للمجال الكهربائي. وهناك عامل الجسيمات والتي تعتمد على التردد، ودعا عامل كلوسيوس-Mossotti (CM)، ويأخذ قيمة في نطاق -0.5 إلى 1، ويحدد اتجاه القوة DEP. ويسمى التردد الذي عامل CM هو بالضبط الصفر تردد كروس. هذه هي النقطة التي يمارس أي قوة dielectrophoretic على الجسيمات وعلامة التغييرات عامل CM. A قإنجل تردد كروس لالمجهرية الصلبة الخاملة يحدث عندما يتغير عامل CM من السلبية إلى الإيجابية 25 لخلايا الثدييات في البلدان المنخفضة عازلة الموصلية بناء على أمر من 0.01 S / م، وتردد كروس الأولى مما يدل على الانتقال من NDEP لpDEP موجود بالقرب من 10 - 100 كيلو هرتز، ويتأثر حجم والشكل والهيكل الخلوي، وخصائص غشاء الخلية. 26،27 وتردد كروس الثاني في التحول من نظام إلى pDEP NDEP هو بناء على أمر من 10 ميغاهرتز، ويتأثر نسبة النواة السيتوبلازم، السيتوبلازم الموصلية، والشبكة الإندوبلازمية. يمكن تطبيق 27 قوة DEP دون وجود تدفق السوائل، ولكن هنا نحن الاستفادة من السوائل المتدفقة لتحقيق الفرز مستمر من الجسيمات العالقة. التأثير المشترك لقوة dielectrophoretic وقوة السحب وستوكس تملي حركة متعدية من الجسيمات.

قمنا بتطوير أجهزة للعمل في نطاقين تردد. التردد العاليوقد عملت الأجهزة ذ (100-600 كيلو هرتز) باستخدام pDEP وحققت الفرز دفعة من الخلايا، مثل الخلايا السرطانية في البروستاتا بدء (التشنجات اللاإرادية)، الظهارية سطح المبيض (موسي) خلايا الفئران، MDA-MB-231 خلايا سرطان الثدي، أو العيش THP -1 الخلايا بشكل انتقائي من خلال محاصرة خلايا الفائدة على العزل المشاركات التي تقع في القناة العينة. 28-31 تردد السفلى (5-100 كيلو هرتز) الأجهزة تعمل بشكل مستمر، وعندما كانت تعمل على تردد واحد الذي يواجه السكان pDEP في حين أن الخبرات السكان الخلفية NDEP، يمكن إعادة توجيه مسارات الجسيمات لتحقيق الفرز. وقد استخدمت هذه الأجهزة 32-34 التردد المنخفض لفرز الخلايا السرطانية من خلايا الدم الحمراء، وتحديد التغيرات في خصائص عازلة من موسي خط الخلية تقدمية، وإلى إلقاء الضوء على آثار غير العلاجات الشحميات السفينغولية سامة على عكس خصائص عدوانية من الخلايا موسي العدوانية. بالإضافة إلى ذلك، الأجهزة بالغة الصغر CDEP يمكن تصميمها لتعمل على زيادة الإنتاجية، حاليا ما يصل إلى 1 مل / ساعةص. 31،35

كما هو موضح، والمرونة والتكلفة المنخفضة لعملية تلفيق تمكن هندستها جهاز مصمم خصيصا، والتي تسمح للإجراء التجريبي تقديمها لتكون ذات الصلة لمجموعة واسعة من التطبيقات. الهدف على المدى الطويل هو أن ندرك CDEP خالية من التسمية الفرز الخلية والتخصيب على مستوى السريرية، مع انتعاش عينة للثقافة أو معالجة لاحقة. تقنية المعروضة هنا هي طريقة بسيطة وغير مكلفة، من تلفيق لإجراء التجارب، مما يزيد من إمكانية الوصول إلى DEP. ونحن لشرح إعداد شريحة CDEP والبروتوكول التجريبي لتحقيق توصيف وإثراء خلايا سرطان المبيض من المجهرية الفلورسنت.

البروتوكول

1. افتعال جهاز النموذج CDEP ميكروفلويديك: نظرة عامة

  1. اتبع الإجراءات ذكرت سابقا 22 باستخدام مقاومة للضوء وديب رد الفعل ايون النقش (DRIE) لحفر قناة التصميم المطلوب (الشكل 1) في رقاقة السيليكون (الشكل 2). إيداع طبقة رقيقة من تفلون لتحسين الافراج عن microdevice من الرقاقة.

figure-protocol-1
الشكل 1. التخطيطي لتردد جهاز منخفض الفرز مستمرة. ترك أشواط قناة العينة إلى اليمين وعلى بعد 500 ميكرون واسع مع التشنج أسنان المنشار إلى 100 ​​ميكرومتر. أزواج اثنين من قنوات القطب فلويديك يؤلف الأقطاب المصدر والمصارف، على التوالي، ويتم فصلها عن قناة عينة من 20 ميكرون سميكة الجدار PDMS.

figure-protocol-2
الشكل 2. وFABRعملية ication من جهاز CDEP (أ) لمدة 60 ثانية، وعلى ضوء الأشعة فوق البنفسجية يتفاعل بشكل انتقائي مع مقاومة للضوء يتعرض من خلال نمط قناع للهندسة الجهاز CDEP. (ب) تتم إزالة الواقي الضوئي باستخدام المطور. (ج) رد الفعل العميق ايون النقش (DRIE) تستخدم لحفر 50 ميكرون ملامح عميق، و 5 دقائق من النقش الرطب من قبل هيدروكسيد رباعي ميثيل الأمونيوم (TMAH) 25٪ عند 70 درجة مئوية وتستخدم للحد من خشونة على الجدران الجانبية. (د) يتم إضافة طلاء تفلون لتحسين الإفراج الجهاز من الرقاقة. (ه) يتم سكب PDMS على إعادة استخدامها رقاقة ختم بعد إزالة الغازات ومملح لمدة 45 دقيقة في 100 ° F. (و) تتم إزالة PDMS من رقاقة. ويتعرض PDMS وشريحة زجاجية نظيفة لالبلازما الجوية لمدة 2 دقيقة والمستعبدين معا.

  1. التفاف رقاقة مع رقائق الألومنيوم لمنع امتداد. مزيج polydimethylsiloxane (PDMS) في 10:01 نسبة المطاط الصناعي لعلاج وكيل والغاز دي لحوالي 20 دقيقة، وتصب على الرقاقة. الحرارة لمدة 45 دقيقة في 100 درجة مئوية لتجنب إتلاف طلاء تفلون من الطوابع. ودع الجهاز حتى يبرد.
  2. بعد التبريد، وإزالة رقائق الألومنيوم، وتقليم PDMS باستخدام شفرة جراحية، ولكمة ثقوب في الوصول قناة مدخل / مخرج باستخدام الناخس حادة مناسبة لحجم الأنابيب. هنا، يتم استخدام 1.5 مم الناخس حادة.
  3. تنظيف شريحة المجهر والزجاج باستخدام شطف من الصابون والماء، والإيثانول والماء DI، والتجفيف بالهواء، على التوالي. تنظيف الجهاز PDMS باستخدام الشريط سكوتش ماجيك. فحص تحت المجهر للتأكد من قنوات نظيفة. تعرض الشريحة والجهاز PDMS البلازما الجوية لمدة 2 دقيقة. اضغط بحزم الجانب قناة الجهاز لشريحة زجاجية، وتجنب تشكيل فقاعات الهواء بين الجهاز والشريحة (الشكل 3).

figure-protocol-3
الرقم 3. (أ) تستخدم لقناع ضوئيه خلال ختم تصنيع رقاقة السيليكون، و (ب) الانتهاء الجهاز PDMS من الزجاج مع العينة وقنوات القطب السوائل مليئة الأخضر والأحمر تلوين الطعام، على التوالي. انظر الشكل 1 لأبعاد. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

2. إعداد تعليق خلية في DEP العازلة

  1. إعداد الموصلية المنخفضة (100 ميكروثانية / سم) العازلة، والتي سوف يتم الإشارة إليها باسم "المخزن المؤقت DEP" (8.5٪ سكروز [ث / ت]، 0.3٪ الجلوكوز [ث / ت]، 0.725٪ RPMI [ث / ت]) 16
  2. تعليق الخلايا في المخزن DEP في 3 × 10 6 خلية / مل. هنا، يتم استخدام سرطانية وقت متأخر من مرحلة الماوس سطح المبيض الظهاري (موسي-L) الخلايا.

ملاحظة: تحليل الجدوى خلية من التريبان الأزرق الإقصاء طريقة صبغ أظهرت انخفاضا طفيفا في الجدوى(95،1-91،6٪) من المرحلة المبكرة موسي (موسي-E) الخلايا علقت في المخزن DEP في درجة حرارة الغرفة بعد 5 ساعة. ومن المتوقع أن انخفاضا طفيفا مماثلا في جدوى يحدث للخلايا موسي-L، مشيرا إلى أن الخلايا لا ينبغي خزنها في DEP العازلة على المدى الطويل.

  1. صبغ الخلايا باستخدام غشاء نفاذية صبغة الفلورسنت، مثل تنشيط إنزيمي-Calcein AM.
  2. قياس الموصلية من تعليق خلية مصبوغ. يجب أن تكون الموصلية حوالي 100 ميكروثانية / سم. إذا كان قياس الموصلية عالية جدا، وتدور العينة إلى أسفل، resuspend في المخزن المؤقت DEP في 3 × 10 6 خلية / مل وتكرار قياس الموصلية.

3. تحميل ميكروفلويديك رقاقة CDEP

  1. وضع رقاقة ميكروفلويديك تحت فراغ لمدة 30 دقيقة.
  2. وفي الوقت نفسه، وقطع قطعة من أنابيب مرنة تمتد المسافة من ضخ حقنة لمرحلة المجهر حيث سيتم تقع رقاقة ميكروفلويديك. هنا، بطول 6 بوصة من الأنابيبهو مطلوب. أنابيب يصلح لإبرة طرف على حقنة.
  3. ويقدر طول المطلوبة لمنفذ أنابيب بقسمة حجم العينة المستهدفة التي تم جمعها من قبل منطقة مستعرضة من الأنبوب. تتطلب قطع طول الأنبوب.
  4. رسم تعليق خلية في حقنة. تأكد من أن عدم وجود فقاعات تقع في أنابيب أو حقنة.
  5. عند إزالة رقاقة من فراغ، إدراج أنابيب مخرج ورئيس قناة عينة بسرعة لتجنب فقاعات الهواء المحبوس في القنوات. بلطف اضغط على حقنة عندما فتيلة لتجنب تمزق رقيقة (20 ميكرون) حاجز العزل، على الرغم من فقد لوحظ أن الجدار يمكن أن تحمل إنتاجية عالية ثابتة بالقرب من 5 مل / ساعة دون تمزق.
  6. إلى رئيس قنوات القطب، ضع بسرعة نصائح ماصة فارغة في منفذ واحد من كل قناة القطب فلويديك. ماصة 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على كمية صغيرة من رودامين B والاستفادة بلطف لإدخال السوائل في الطرف الآخر من القناة القطب. الحفاظ على ضغط لطيفحتى برنامج تلفزيوني مع رودامين B تقدم واضح حتى غيض من غيض ماصة فارغة. تكرار لكل قناة القطب. يستخدم رودامين B فقط لتصور fluorescently قنوات القطب فلويديك.
  7. بعد فتيلة، وملء الخزان كل طرف ماصة مع برنامج تلفزيوني مع رودامين B. تشكيل فقاعة تجنب في الخزانات ماصة الحافة، وإزالة أي فقاعة مرئية من قبل pipetting بلطف صعودا ونزولا. فصل الأنابيب منفذ وتجاهل بشكل مناسب، ثم تضاف خزان منفذ أنابيب جديدة لجمع وحدة التخزين الهدف.

4. تميز تردد كروس من الخلايا باستخدام رقاقة CDEP

  1. وضع رقاقة على مرحلة مجهر مقلوب مجهزة الكاميرا الرقمية (الشكل 4).

figure-protocol-4
الشكل 4. (أ) الإعداد التجريبية عموما للتجارب CDEP. يقع رقاقة CDEP على منصة المجهر المقلوب. كاميرا ترسل الصور إلى الكمبيوتر للتسجيل. يحافظ على ضخ حقنة تدفق مدخل ثابتة. المولد وظيفة يولد إشارة التي صعدت من مكبر للصوت عالية الجهد ومتصلا رقاقة CDEP بواسطة أقطاب الأسلاك. الذبذبات تراقب إشارة إرسالها إلى رقاقة. (ب) عرض التفاصيل من الشريحة CDEP واتصالات فلويديك والإلكترونية. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

  1. جبل على ضخ حقنة حقنة وإدراج الأقطاب الكهربائية الأسلاك في فلويديك الخزانات قناة القطب.
  2. ضخ السوائل من خلال في 1 مل / ساعة لضمان اتصال جيد بين ضخ حقنة وحقنة. بصريا تفتيش طول القناة لضمان تدفق دون عوائق من الخلايا وعدم وجود فقاعات أو تسرب. أحمرمعدل التدفق فوسي إلى 0.005 مل / ساعة.
    ملاحظة: لقد تم تحقيق إنتاجية عالية تصل إلى 1 مل / ساعة 31،35 في الأجهزة وهندستها أخرى.
  3. للسلامة، اختبار للإلكترونيات بنسبة المحرك على مولد وظيفة، ومكبر للصوت عالية الجهد، والذبذبات، والتكيف مع الجهد المطلوب والتردد. هنا هذه المعايير هي 200 V و 20 كيلوهرتز. على التحقق من أداء مقبول، خارج السلطة. ربط الأقطاب إلى مكبر للصوت عالية الجهد.
    ملاحظة: لاحظ إجراءات ملائمة السلامة الكهربائية عند تشغيل الأجهزة الإلكترونية في الفولتية العالية المستخدمة في هذه التجارب.
  4. على تحقيق تدفق مستمر، وتطبيق الجهد المطلوب في التردد المطلوب. في هذه التجربة، والجهد هو 200 V RMS على ترددات بين 5-60 كيلو هرتز.
  5. سجل ملفات الفيديو من استجابة الخلية مع تقنيات معالجة الصور (خطوة 5) لتحديد توزيع خلية في القناة وتميز تردد كروس. للقيام بذلك،الحفاظ على الجهد المستمر وتختلف وتيرة منتظمة. في بداية ونهاية التجربة، وكذلك عشوائيا بين أشواط تجريبية، تسجيل توزيع الخلايا السيطرة، وتوزيع الخلايا دون تطبيق أي حقل كهربائي. تقدير كمية الوقت اللازم للخلايا في التدفق من المدخل إلى موقع رصد (هنا، 5 دقائق). بعد وضع تردد جديد، انتظر هذا المبلغ من الزمن، ثم يبدأ تسجيل (هنا، فيديو 2 دقيقة التوزيع الخلية).

5. تجهيز صورة لوصف كروس التردد

  1. باستخدام برنامج نصي الحسابية، وتحليل كل إطار الفيديو الإطار لتحديد الوضع النسبي ص (حيث اتجاه زي هو عمق العمودي للقناة، ص الاتجاه هو عرض القناة، والأشعة الاتجاه هو طول قناة) كل خلية الاستشعاع أو الجسيمات في تحديد الإحداثي س المصب من منطقة القوة DEP عالية في القناة. إنشاء رسم بياني للديس النسبيةtribution.
  2. مقارنة الوسط للتوزيع في كل الجهد والتردد مع محور لتوزيع السيطرة. لجهد معين وترددات مختلفة، وتحديد تردد كروس، حيث يطابق محور ص موقف السيطرة.

6. متفاوتة التجربة لإجراء الفرز الخلية أو الإثراء

  1. تعليق الخليط المطلوب في المخزن DEP بتركيز مجموعه 3 × 10 6 الجسيمات / مل. هنا، وهذا الخليط هو خلايا موسي-L مع 4 حبات ميكرون الاستشعاع في المخزن DEP. تنفيذ الخطوات المذكورة سابقا لإعداد جهاز CDEP.
  2. لفرز أو إثراء خلايا من خليط، وتحديد الترددات كروس من الخلايا المستهدفة والجسيمات الخلفية كما هو موضح سابقا. تعمل التجربة على تردد بين اثنين من ترددات كروس من الخلايا المستهدفة والجسيمات الخلفية بحيث أن السكان اثنين من جزيئات تواجه القوات DEP في د المعاكسirections. لفرز الخلايا موسي-L و 4 ميكرومتر الخرز، وتعمل على microdevice أعلاه 11.90 ± 0.63 كيلو هرتز. تردد كروس الأولى من الخلايا موسي-L ذكرت مؤخرا من قبل Salmanzadeh وآخرون 33
  3. لجمع محتويات عينة فرزها، وإزالة الأنابيب منفذ على جمع وحدة التخزين الهدف، من خلال وضع الإصبع القفازات خلال افتتاح منفذ وبلطف الجر على الأنبوب. صب حجم المستهدف جمعها في خزان لمزيد من التحليل لاحظ: يمكن أن تشمل أساليب استرداد عينة أخرى ربط خزان دائم للرقاقة وإزالة عينة بسيطة من قبل pipetting.

النتائج

DEP ينبغي مراعاة النوعية في القناة عينة لتأكيد الجهاز جاهز للعمل عندما يكون الحقل الكهربائي موجودا. أسلوب واحد لاختبار وجود DEP هو لضبط التردد لقيم بعيدة عن تردد كروس حيث من المتوقع pDEP قوية وNDEP (تقريبا> 40 كيلو هرتز لمراقبة pDEP و<10 كيلو هرتز لمراقبة NDEP لمعظم الخلايا السرطانية الثديية في العازلة مع الموصلية من 100 ميكروثانية / سم). تجدر الإشارة إلى أن المجهرية الخاملة يحمل pDEP أدناه تردد كروس وNDEP أعلاه تردد كروس بهم. للهندسة ميزة أسنان المنشار المعروضة هنا، ينبغي أن ينظر pDEP للخلايا في ارتفاع وتيرة الاختبار، يتبين من وقوع اللؤلؤ تسلسل وتركيز الخلايا أو الجزيئات على حافة مسننة ميزة للقناة، بينما في انخفاض وتيرة الاختبار، NDEP يجب أن يكون واضحا كما يتم تقييد الخلايا إلى المنطقة أقرب إلى حافة مستقيمة للقناة. في هذه الترددات المنخفضة، قد خلايا ليزقد تظهر بسبب ه التثقيب الكهربائي، وبالتالي فإن العينة تحتوي على خلايا أقل، وتلك التي قد تظهر واضحة أو ضبابية الموسع إذا باستخدام صبغة الاستشعاع تنشيط إنزيمي. التحقق من الترددات التي pDEP وNDEP تحدث يسمح للتحديد وتيرة التبادل كما هو موضح في البروتوكول. عن الخلايا السرطانية الثديية، مثل موسي-L المستخدمة هنا، لاحظنا NDEP في 5 كيلو هرتز (الشكل 5A) وpDEP قوية عند 60 كيلو هرتز (الشكل 5B). كان الخلايا موسي-L يبلغ قطرها 17.7 ± 3.3 ميكرومتر (ن = 268 الخلايا) والخرز ويبلغ قطرها الاسمي 4 ميكرون. تحليل كامل من خصائص عازلة للخلايا موسي-L مقارنة مع الخلايا موسي في المراحل المبكرة من تطور يمكن العثور عليها في الأعمال الأخيرة التي كتبها Salmanzadeh وآخرون 33

إن لم يكن لوحظ pDEP وNDEP في هذين النقيضين، مختلف المشاكل يمكن الحدوث. قد يكون عينة الموصلية عالية جدا وذلك بسبب الملوثات أو lysing الخلية. Insufficieقد يتم إنشاء الحقل الكهربائي الإقليم الشمالي بسبب فقاعات المحاصرين في قنوات القطب السوائل، والتي تمنع توصيل التيار إلى الجزء من القنوات المطلة على قناة العينة. قد يكون سبب تدفق متقلب بواسطة فقاعة المحاصرين في حقنة أو مدخل أنابيب، فقاعات الناتجة عن عدم حفظ الجهاز تحت فراغ لفترة كافية أم لا بسرعة ملء الجهاز على إزالة من فراغ، والتسرب بسبب التبطين من PDMS سيئة المستعبدين ل شريحة زجاجية، بذلت الدموع في الغشاء الحاجز بسبب القوة المفرطة عند ملء القنوات، أو معدلات التدفق في اقصى نطاق التشغيل المضخة.

بالإضافة إلى تحديد وتيرة انتقال من الخلايا، هذه التقنية يمكن استخدامها لفرز خليط، ويتضح هنا من خلال مزيج من الخلايا موسي-L والخرز. هذا المثال يستفيد من dielectrophoresis السلبية (NDEP) التي أظهرتها 4 ميكرومتر الخرز على ترددات الخلايا حيث تواجه موسي-L dielectrophoresis إيجابية (pDEP). نحن سperated الجهاز على 200 V RMS و 10 كيلو هرتز (الشكل 6A)، ولاحظ أن كلا من الخلايا والخرز كانت مختلطة كما شهدت NDEP. في 50 كيلوهرتز لاحظنا حركة الخلايا موسي-L إلى قمة القناة، في حين اقتصرت الخرز إلى الجزء السفلي من القناة، وتمكين فصل الخليط في مكونين (الشكل 6B).

figure-results-1
الرقم 5. يتم التلاعب موقف الخلايا موسي-L عن طريق تغيير وتيرة تطبيق الحقل الكهربائي. تؤخذ الصور في ميزة أسنان المنشار النهائية في القناة عينة وتقع الأقطاب فلويديك في زوايا على الجانب الأيمن. أنها مليئة PBS تحتوي رودامين B، والتي تتفلور لتصور القنوات. (أ) الخلايا موسي-L تجربة NDEP في 200 V RMS و5 كيلو هرتز (ب) الخلايا موسي-L تجربة تسلسل اللؤلؤ وpDEP في 200 V RMS و 60 كيلوهرتز. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

figure-results-2
الرقم 6. مزيج من الخلايا موسي-L (الخضراء) و 4 ميكرومتر الخرز (الحمراء) تتدفق من خلال ميزة أسنان المنشار النهائية في القناة عينة من جهاز منخفض CDEP التردد. (أ) في 200 V ويتم خلط 10 كيلو هرتز الخلايا والخرز. تشير الأسهم إلى الظهور بضعف الخلايا التي يحتمل لقوا حتفهم بسبب الظروف التردد المنخفض. (ب) في 200 V و 50 كيلو هرتز الخلايا تجربة pDEP والانتقال إلى حافة ميزة للقناة، في حين حبات تجربة NDEP وتبقى محصورة في المنطقة أقرب حافة مستقيمة.p_upload/50634/50634fig6highres.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لعرض أكبر شخصية.

المناقشة

DEP هي تقنية قوية لتحديد خصائص عازلة من الجزيئات والجسيمات توجيه الحركة نحو فرز الطلبات، والعزلة، أو التخصيب. ويرجع ذلك إلى تأثير ضار للاتصال المباشر مع القطب عينة، اتخذت الآخرين نهج مماثلة لطريقة عرض في وقت سابق لتجنب الاتصال. على سبيل المثال، البشير وآخرون. وضعت الأجهزة DEP خالية من الاتصال باستخدام جهاز PDMS ميكروفلويديك فصلها عن المطبوعة أقطاب لوحات الدارات الكهربائية بواسطة ساترة الزجاج رقيقة، ويتم إجراء هذه التقنية متوفرة أيضا في شكل شريط فيديو. 23،36

هنا، لقد أظهرنا تصنيع رقاقة CDEP وأقطاب فلويديك باستخدام الركيزة PDMS واحد، وبروتوكول تجريبي لفصل خلايا سرطان المبيض من خليط من الخلايا والخرز الفلورسنت. وقد استخدمت هذه التقنية بنجاح لعرض مجموعة متنوعة من التطبيقات الأكثر تعقيدا وذات الصلة من الناحية الفسيولوجية، بما في ذلك فرز ليفالخلايا الإلكترونية والأموات، 28 ورم الخلايا بدء من خلايا سرطان البروستاتا، 30 الخلايا السرطانية من الخلايا تمييع الدم الحمراء، والتفريق بين 31،32 مراحل سرطان الثدي وسرطان المبيض 37 29 CDEP كما تم استخدامها لخلط الجسيمات. هذه 38 وتشير التطبيقات التي باستخدام تقنية بسيطة قدمت، وأغراض متنوعة يمكن تحقيق ذلك ببساطة عن طريق تغيير تصميم هندسة القناة.

. DEP مفيد على الميكروسكيل للتلاعب من الجزيئات 13 للجسيمات كروية، وقوة dielectrophoretic متعدية يعتمد على حجم والكهربائية خصائص الجسيمات والمتوسطة تعليق لها، فضلا عن التدرج الحقل الكهربائي التربيعية:

figure-discussion-1
حيث ε م هو السماحية للتعليق المتوسطة، r هو نصف قطرهامن الجسيمات، والصليب الأحمر [ك (ω)] هو الجزء الحقيقي للعامل كلوسيوس-Mossotti (CM). عامل CM هو مقياس من الاستقطاب النسبية للجسيمات مقارنة المتوسطة بتوقيف ويحدد اتجاه القوة dielectrophoretic. ما توصف بأنها

figure-discussion-2
حيث figure-discussion-3 و figure-discussion-4 هي permittivities معقدة من الجسيمات والمتوسطة، على التوالي. السماحية معقدة، figure-discussion-5 ، يعتمد على (σ) الموصلية و(ω) تردد. عامل CM من جسيمات كروية ونظريا ملزمة بين -0.5 و 1. إذا كان عامل CM هو سلبي، والجزيئات تجربة NDEP لأن المتوسط ​​هو أكثر قطوب من الجسيمات، لذلك جسيمات تتحرك بعيدا عن مناطقالتدرجات الحقل الكهربائي عالية. إذا كان عامل CM هو إيجابي، والجزيئات هي أكثر قطوب من المتوسط ​​وكانت تجربة pDEP التي تتحرك نحو مناطق التدرجات الحقل الكهربائي عالية.

للجزيئات البيولوجية التي هي nonhomogeneous في الهيكل، مثل الخلايا، يمكن تحديد عامل كلوسيوس-Mossotti من القيمة الفعالة للالسماحية الجسيمات:

figure-discussion-6
حيث figure-discussion-7 و figure-discussion-8 هي السماحية المعقدة للالسماحية المعقدة فعالة الداخلية للخلية، مثل السيتوبلازم، وغشاء البلازما، على التوالي؛ r هو نصف قطر الخلية، ود هو سمك غشاء البلازما 26

عندما يحدث DEP مع الجسيمات العالقة فيالسوائل، فإن حركة الجسيمات المتعلقة السائل توليد قوة جر على الجسيمات. يجب النظر في هذا قوة السحب عند تحديد القوة الشاملة تعمل على الجسيمات. لحالات من الاهتمام هنا، قوى اللزوجة الهيمنة ويفترض جسيمات كروية، والصغيرة، وتتحرك مع سرعة منخفضة نسبيا، لذلك ينص القانون السحب ستوكس تقريب جيد لقوة السحب:

figure-discussion-9
حيث η هو اللزوجة من السوائل، ش ع هي سرعة الجسيم، وو ش هي سرعة السائل، والتي يمكن أيضا أن تتحرك. نظرا لقوة dielectrophoretic، المعروف السوائل وخصائص الجسيمات، وسرعة تدفق معروفة، يمكن حلها التوازن بين قوة السحب وقوة dielectrophoretic لتقدير سرعة الجسيمات. معدل القص التي ينبغي أن تكون تجربة الخلايا تحت العتبة التي جيمكن أن يحدث الذراع lysing.

توصيف الخصائص الكهربائية للجزيئات من الضروري التنبؤ والسيطرة على الكيفية التي سيستجيب تحت DEP لهم. في هذا العمل، ونحن تستخدم خصيصا منخفضة التردد CDEP مع الخلايا موسي-L للتدليل على بروتوكول لتحديد تردد كروس أول من الخلايا، ثم أظهر الفرز مستمرة من الخرز البوليسترين والخلايا موسي-L على أساس معارضة ردودهم DEP.

تغيير وهندسة الجهاز CDEP تغيير التدرجات المكانية للمجال الكهربائي، مما يسمح لأجهزة مصممة لتكون ذات تردد عال أو منخفضة التردد العملية، وانتقائية عالية وكفاءة الفرز لنوع من الخلايا المحددة. بالإضافة إلى ذلك، وأجهزة إنتاجية عالية يمكن تطويرها عن طريق افتعال قنوات أوسع، 30 قناة في موازاة ذلك، 30 أو عن طريق تلفيق متعدد الطبقات 35، والتي هي مكدسة قنوات القطب عموديا فوق وتحت عميق نسبياقناة العينة. أغشية رقيقة تشكل حاجزا بين الطبقات. اختبار مبدئي مع الأجهزة ملفقة في ميثاأكريلات (PMMA) والبولي أظهرت (PC) أفلام رقيقة من الخلايا استجابة DEP موسي-L. تجري الجهود الحالية لتحسين متعدد الطبقات الأجهزة عالية الإنتاجية وتحسين نظام الطرفية في نهاية المطاف نحو منصة التوصيل واللعب. لتوسيع من تقنية تجريبية الأساسية المقدمة، التطبيقات ومواصفات الجهاز يمكن أن تكون مصممة لتناسب مطالب معينة، مثل الفرز مقابل التوصيف، أو إضافة خزانات نموذج ونظام شبه الآلي إلى الجهاز.

الإفصاحات

الدكتور رافائيل دافالوس لديه براءات الاختراع في انتظار لتماس dielectrophoresis.

شكر وتقدير

وقد تم دعم هذا العمل بدعم جزئي من قبل مؤسسة العلوم الوطنية في إطار منحة رقم 0938047 EFRI، ومعهد تكنولوجيا فرجينيا للتكنولوجيا الحرجة والعلوم التطبيقية (ICTAS). فإن الكتاب أود أن أعرب عن تقديري للدكتور إيفا Schmelz والدكتور بول روبرتس لهديتهم نوع من الخلايا موسي-L. المؤلفين الاعتراف انجيلا اندرسون لمساعدتها مع خلية ثقافة، Caitlan Swaffar لها المساعدة في تحرير هذه الوثيقة وإعداد التجارب، وجميع أعضاء مختبر نظم Bioelectromechanical.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Polydimethylsiloxane (PDMS)داو كورنينج ، ميدلاند ، ميشيغان ، الولايات المتحدة الأمريكيةسيلجارد 184
شريحة زجاجية مستودع المجهر760792 × 3 بوصة حواف أرضية
Microjore PTFE TubingCole-Parmer Instrument Co ، Vernon Hills ، IL ، الولايات المتحدة الأمريكيةEW-06417-31مقياس 20 رقيق الجدران ، 0.032 "معرف × 0.056" OD ، 100 قدم / لفة
محاقن بلاستيكية Luer-slipScientific شركةS7510-1
طرف إبرةهوارد الأدوات الإلكترونيةJG20-1.020 مقياس 1.0 "، معرف = 0.025" OD = 0.036 "
D (+) - سكروزفيشر Scientific ، Fair Lawn ، NJS3-500
D (+) - الجلوكوز ، الكاشف ACS ، اللامائيAcros Organics NV ، Fair Lawn ، NJAC410955000
RPMI-1640 MediumQuality Biological Inc.112-025-101
Calcein AM ، Molecular PropesInvitrogen Corp. (تقنيات الحياة) ، كارلسباد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكيةC3100MPالطول الموجي للإثارة 488 / الطول الموجي للانبعاث 516
Rhodamine B ، OScience LabSLR1465-100Gالطول الموجي للإثارة 540 / الطول الموجي للانبعاث 625
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (10X)Gbiosciences ، سانت لويس ، MORC-147
Leica ، مجهر الضوء المقلوب Leica Microsystems ، بانوكبيرن ، إلينوي ، الولايات المتحدة الأمريكيةLeica DMI 6000B
Leica DFC420 ، الكاميرا الملونةLeica Microsystems ، Bannockburn ، IL ، الولايات المتحدة الأمريكيةLeica DFC420
مولد وظيفة GW Instek ، تايبيه ، تايوانGFG-3015
مضخم طاقة واسع Amp-Line Corp. ، حدائق أوكلاند ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكيةAL-50HF-A
HFHV الإخراج محولAL-T50-V25 / 300-F100K-600K
مضخم الجهد العاليTrekModel 2205
USB راسم الذبذبات المعياري ، 100 ميجاهرتزAgilentTechnologiesU2701A
منظف البلازما الموسعهاريك بلازماPDC-001/002 (115 / 230 فولت)البلازما الهوائية
سكوتش الشريط السحري3Mأي عرض متاح يكفي
1.5 ملم لكمة هاريس أحادي النواةZ708836-25EA.25
٪ Trypsin-EDTAInvitrogen25200-056
FluoSpheres كبريتات المجهريةInvitrogenF88584.0 & م ، فلورسنت أحمر (الطول الموجي للإثارة 580 / الطول الموجي للانبعاث 605)
AZ 9260 مقاوم للضوء AZ المواد
AZ 400 K المطورAZ المواد
رباعي ميثيل الأمونيوم هيدروكسيد (TMAH) 25٪ مقدمة من
طلاءTech المطبق باستخدام آلة DRIE
السيليكون رقاقةجامعة رقاقة452قطر 100 مم ، 500 مو ؛ سمك م ، جانب واحد مصقول (SSP)
نقش أيوني تفاعلي عميق (DRIE)AlcatrelAMS SDE 100
National النطاق الإلكترونيةالإلكترونية تفلون غرف الأبحاث Virginia

المراجع

  1. Butler, M. Cell culture and upstream processing. , Taylor & Francis. (2007).
  2. Pratt, E. D., Huang, C., Hawkins, B. G., Gleghorn, J. P., Kirby, B. J. Rare Cell Capture in Microfluidic Devices. Chemical Engineering Science. 66, 1508-1522 (2011).
  3. Salmanzadeh, A. D., Davalos, R. V. Isolation of rare cells through their dielectrophoretic signature. Journal of Membrane Science and Technology. 3, e112(2013).
  4. Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A. Fluorescence activated cell sorting. The Review of Scientific Instruments. 43, 404-409 (1972).
  5. Adams, J. D., Kim, U., Soh, H. T. Multitarget magnetic activated cell sorter. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 18165-18170 (2008).
  6. Chabert, M., Viovy, J. L. Microfluidic high-throughput encapsulation and hydrodynamic self-sorting of single cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3191-3196 (2008).
  7. Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 18892-18897 (2007).
  8. Di Carlo, D. Inertial microfluidics. Lab Chip. 9, 3038-3046 (2009).
  9. Grover, S. C., Skirtach, A. G., Gauthier, R. C., Grover, C. P. Automated single-cell sorting system based on optical trapping. J. Biomed. Opt. 6, 14-22 (2001).
  10. Lin, S. C. S., Mao, X. L., Huang, T. J. Surface acoustic wave (SAW) acoustophoresis: now and beyond. Lab Chip. 12, 2766-2770 (2012).
  11. Pethig, R. Review Article-Dielectrophoresis: Status of the theory, technology, and applications. Biomicrofluidics. 4, (2010).
  12. Gascoyne, P. R. C., Wang, X. B., Huang, Y., Becker, F. F. Dielectrophoretic separation of cancer cells from blood. Ieee T. Ind. Appl. 33, 670-678 (1997).
  13. Pohl, H. A. Dielectrophoresis : the behavior of neutral matter in nonuniform electric fields. , Cambridge University Press. (1978).
  14. Salmanzadeh, A., Davalos, R. V. Isolation of rare cells through their dielectrophoretic signature. Journal of Membrane Science. , Under-review (2012).
  15. Markx, G. H., Talary, M. S., Pethig, R. Separation of Viable and Nonviable Yeast Using Dielectrophoresis. J. Biotechnol. 32 (94), 29-37 (1994).
  16. Flanagan, L. A., et al. Unique dielectric properties distinguish stem cells and their differentiated progeny. Stem Cells. 26, 656-665 (2008).
  17. Labeed, F. H., Coley, H. M., Thomas, H., Hughes, M. P. Assessment of multidrug resistance reversal using dielectrophoresis and flow cytometry. Biophys. J. 85, 2028-2034 (2003).
  18. Hoettges, K. F., et al. Dielectrophoresis-activated multiwell plate for label-free high-throughput drug assessment. Anal. Chem. 80, 2063-2068 (2008).
  19. Lapizco-Encinas, B. H., Simmons, B. A., Cummings, E. B., Fintschenko, Y. Insulator-based dielectrophoresis for the selective concentration and separation of live bacteria in water. Electrophoresis. 25, 1695-1704 (2004).
  20. Davalos, R. V., et al. Performance impact of dynamic surface coatings on polymeric insulator-based dielectrophoretic particle separators. Anal. Bioanal. Chem. 390, 847-855 (2008).
  21. Gallo-Villanueva, R. C., Rodriguez-Lopez, C. E., Diaz-De-La-Garza, R. I., Reyes-Betanzo, C., Lapizco-Encinas, B. H. DNA manipulation by means of insulator-based dielectrophoresis employing direct current electric fields. Electrophoresis. 30, 4195-4205 (2009).
  22. Shafiee, H., Caldwell, J. L., Sano, M. B., Davalos, R. V. Contactless dielectrophoresis: a new technique for cell manipulation. Biomed Microdevices. 11, 997-1006 (2009).
  23. Park, K., Suk, H. J., Akin, D., Bashir, R. Dielectrophoresis-based cell manipulation using electrodes on a reusable printed circuit board. Lab Chip. 9, 2224-2229 (2009).
  24. Jen, C. P., Maslov, N. A., Shih, H. Y., Lee, Y. C., Hsiao, F. B. Particle focusing in a contactless dielectrophoretic microfluidic chip with insulating structures. Microsyst Technol. 18, 1879-1886 (2012).
  25. Hughes, M. P. AC electrokinetics: applications for nanotechnology. Nanotechnology. 11, 124-132 (2000).
  26. Pethig, R. Dielectrophoresis: Status of the theory, technology, and applications. Biomicrofluidics. 4, 022811(2010).
  27. Pethig, R. Ch. 4. BioMEMS and Biomedical Nanotechnology. Ferrari, M. auro, Ozkan, M. ihrimah, Heller, M. ichael J. . 4, Springer. US. 103-126 (2007).
  28. Shafiee, H., Sano, M. B., Henslee, E. A., Caldwell, J. L., Davalos, R. V. Selective isolation of live/dead cells using contactless dielectrophoresis (cDEP). Lab Chip. 10, 438-445 (2010).
  29. Salmanzadeh, A., et al. Dielectrophoretic differentiation of mouse ovarian surface epithelial cells, macrophages, and fibroblasts using contactless dielectrophoresis. Biomicrofluidics. 6, (2012).
  30. Salmanzadeh, A., et al. Isolation of prostate tumor initiating cells (TICs) through their dielectrophoretic signature. Lab Chip. 12, 182-189 (2012).
  31. Salmanzadeh, A., Sano, M. B., Shafiee, H., Stremler, M., Davalos, R. V. Isolation of Rare Cancer Cells from Blood Cells Using Dielectrophoresis. EMBC 2012., Annual International IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, Aug 28-Sep 1, San Diego, , (2012).
  32. Sano, M. B., Caldwell, J. L., Davalos, R. V. Modeling and development of a low frequency contactless dielectrophoresis (cDEP) platform to sort cancer cells from dilute whole blood samples. Biosens. Bioelectron. 30, 13-20 (2011).
  33. Salmanzadeh, A., et al. Investigating Dielectric Properties of Different Stages of Syngeneic Murine Ovarian Cancer Cells. Biomicrofluidics. , (2013).
  34. Salmanzadeh, A., Sano, M. B., Shafiee, H., Stremler, M. A., Davalos, R. V. Engineering in Medicine and Biology Society (EMBC), 2012 Annual International Conference of the IEEE, , 590-593 (2012).
  35. Sano, M. B., Salmanzadeh, A., Davalos, R. V. Multilayer contactless dielectrophoresis: Theoretical considerations. Electrophoresis. 33, 1938-1946 (2012).
  36. Millet, L. J., Park, K., Watkins, N. N., Hsia, K. J., Bashir, R. Separating beads and cells in multi-channel microfluidic devices using dielectrophoresis and laminar. J. Vis. Exp. (48), e2545(2011).
  37. Henslee, E. A., Sano, M. B., Rojas, A. D., Schmelz, E. M., Davalos, R. V. Selective concentration of human cancer cells using contactless dielectrophoresis. Electrophoresis. 32, 2523-2529 (2011).
  38. Salmanzadeh, A., Shafiee, H., Davalos, R. V., Stremler, M. A. Microfluidic mixing using contactless dielectrophoresis. Electrophoresis. 32, 2569-2578 (2011).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

عزل خالية من التسمية والإثراء من خلال خلايا تلامس Dielectrophoresis
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.