مقالة منهجية

النهج الوراثية إلى الأمام في

DOI:

10.3791/50636

⸱

أكتوبر 23, 2013

 , 
1Department of Molecular Genetics and Microbiology, Center for Microbial Pathogenesis, Duke University Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن تصف منهجية لإجراء تحليل وراثي في الكلاميديا ​​يعتمد على الطفرات الكيميائية وكامل تسلسل الجينوم. وبالإضافة إلى ذلك، يوصف نظام لتبادل الحمض النووي داخل الخلايا المصابة التي يمكن استخدامها لرسم الخرائط الوراثية. قد تكون هذه الطريقة المطبقة على نطاق واسع لأنظمة الميكروبية التي تفتقر إلى نظم التحول والأدوات الوراثية الجزيئية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكلاميديا، العامل المسبب للمرض من الأمراض التي تنتقل عن طريق الاتصال الجنسي والتهابات العين، لا تزال تتسم سيئة بسبب استعصاء الرامية إلى التحول التجريبية مع الحمض النووي المؤتلف. وضعنا نهجا لإجراء تحليل وراثي في C. المتدثرة على الرغم من عدم وجود الأدوات الوراثية الجزيئية. ينطوي على طريقتنا: أنا) الطفرات الكيميائية لتوليد بسرعة مكتبات شاملة من المسوخ وراثيا محددة مع الظواهر متميزة؛ الثاني) كامل تسلسل الجينوم (WGS) لتعيين الآفات الوراثية الكامنة وإيجاد الارتباط بين الجين المتحور (ق) و. النمط الظاهري المشتركة؛ الثالث) توليد سلالات المؤتلف من خلال المشاركة في إصابة خلايا الثدييات مع البكتيريا نوع متحولة والبرية. وفقا لذلك، كنا قادرين على إقامة علاقات سببية بين الأنماط الجينية والظواهر. اقتران كيميائيا التي يسببها اختلاف الجينات والفريق العامل المعني بالحالات في إنشاء جمعيات الوراثي، النمط الظاهري المتلازم شوتكون قابلة للتطبيق على نطاق واسع LD إلى قائمة كبيرة من الكائنات الحية الدقيقة طبيا وبيئيا هاما المستعصية حاليا للتحليل الجيني.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتلزم بين الخلايا بكتيريا الكلاميديا ​​حسابات لما يقدر بنحو 2.8 مليون التهابات المسالك التناسلية سنويا في الولايات المتحدة (مركز السيطرة على الأمراض) مع عقابيل المرتبطة بها مثل مرض التهاب الحوض، والحمل خارج الرحم، والعقم (1). الكلاميديا ​​SPP دينا فريدة من نوعها علم وظائف الأعضاء مع دورة التنموية ثنائي الطور تتكون من شكلين: الجسم الابتدائية المعدية ولكن غير المتماثل (EB) والجسم شبكي غير المعدية ولكن تنسخي (RB). تبدأ العدوى مع المرفق من EBS إلى الخلايا الظهارية تليها endoctyotosis (2). ضمن يطلق عليه فجوة غشاء محدد إدراج، EBS تفرق في شكل RB، الذي يعيد ثم بواسطة الانشطار الثنائي. في منتصف الدورة، والتحولات المكاتب الإقليمية مرة أخرى إلى EBS، التي يتم إطلاقها في الفضاء خارج الخلية لبدء جولات جديدة من حالات العدوى عند lyses الخلية المضيفة (3).

C. المتدثرة هوصهر للتلاعب الروتينية مع الأدوات الوراثية الجزيئية القياسية، مثل استبدال الجينات المستهدفة، الترانسبوزونات وفاجات transducing، والتي كانت محور معظم الدراسات في مجال علم الوراثة البكتيرية، وليس من الواضح إلى أي مدى تسهم جينات الكلاميديا ​​الفرد إلى التهرب من المناعة الفطرية ، واقتناء المواد الغذائية، والتحولات التنموية، أو غيرها من العمليات الهامة لبقاء الممرض ضمن مجموعة حقيقية النواة (4). وبناء على ذلك، لا يزال هذا الممرض تتميز سيئة على الرغم من أهميتها السريرية.

جينوم الكلاميديا ​​النيابة. هي صغيرة نسبيا (~ 1 ميغابايت) (5) مع أنواع متعددة ومتسلسلة biovars باستخدام تقنيات التسلسل التالي جيل. وقد وفرت تحليل الجينوم المقارن من قبل الفريق العامل المعني بالحالات رؤى فريدة حول تطور الأنواع الناجمة عن المتدثرة وتكيفها مع البشر (6-8) وإلى حد ما وقد وفرت بعض المعلومات عن وظيفة المحتملة للعوامل الفوعة (9، 10). Tكان التنوع الجيني المعروضة بواسطة العزلات السريرية لا يوفر القرار اللازم لتعيين منهجي وظيفة معظم عوامل الفوعة، ربما لأن الطفرات في هذه الجينات قد تم اختيارها بسهولة ضد. دون آثار الخلط من الانتقاء الطبيعي، المغير الناجم عن اختلاف الجينات، إلى جانب فحوصات محددة أن العيوب التدبير في الفوعة، يمكن توسيع الطيف من الطفرات التي يمكن شملها الاستطلاع. المطفرة الكيميائية، على وجه الخصوص، هي مفيدة لأنها يمكن أن تولد فارغة، مشروط، hypomorphic (وظيفة انخفاض)، وhypermorphic (كسب وظيفة) الأليلات. مع وصول تكنولوجيات الجينوم التسلسل قوية من الجيل التالي، مثل هذه الطفرات يمكن تحديدها بسهولة وتعيينها. بهذه الطريقة، يمكن جعل جمعيات قوية بين طفرات في الجينات الوراثية أو مسار والنمط الظاهري شيوعا، وتمكن من تطبيق النهج الوراثية إلى الأمام.

تسلسل جينوم سلالات السريرية كشفت الاصباغ بserovars إلى صف ومواضع من إعادة التركيب المتكرر (11). وقد تجلى الأدلة التجريبية من إعادة التركيب من خلال الرئيسين إصابة اثنين من مختلف السلالات المقاومة للمضادات الحيوية واختيار مزدوج ذرية المؤتلف مقاومة، الذي أنزل على ديها مساهمات الجينية من كلتا السلالتين (12، 13). وهكذا فإن التبادل الجيني بين نوع البرية وسلالات متحولة في إعداد العدوى المشتركة يسمح الفصل بين الطفرات التي يسببها كيميائيا لتحديد الجينات المتضررة أن يؤدي إلى النمط الظاهري المرصودة.

نحن هنا وصف منهجية لإجراء تحليل وراثي في الكلاميديا ​​يعتمد على الطفرات الكيميائية، الفريق العامل المعني بالحالات، ونظام لتبادل الحمض النووي داخل الخلايا المصابة (14) (الشكل 1).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الطفرات الكيميائية

ملاحظة: لقد وجدنا أن النموذج RB تنسخي هو أكثر استعدادا للالطفرات الكيميائية من شكل EB. في منتصف الدورة (بين 18 إلى 20 HPI)، المكاتب الإقليمية هي في أكبر عدد قبل RB-EB الانتقالية. لأن الكلاميديا ​​هو الممرض داخل الخلايا تلزم، ويمكن للآثار مطفر على صحة المضيفة الحد من الانتعاش البكتيرية. تم العثور على خلايا فيرو لتكون أكثر مقاومة للآثار السلبية لمستويات عالية من EMS من خطوط الخلايا الأخرى التي تم اختبارها.

الفصل بين الطفرات بواسطة إعادة التركيب يتطلب اختيار المضادات الحيوية ذرية المؤتلف مقاومة. نوصي باستخدام سلالات مقاومة للأدوية (مثل ريفامبين، السبيكتينوميسين، أو ميثوبريم) لتوليد المسوخ نظرا لقدرته على إجراء تحليل المؤتلف وعزل سلالات إسوي. وقد تم توليد سلالات مقاومة للمضادات الحيوية من خلال عملية اختيار متدرج (15، 16).

ليسE: الكلاميديا ​​(سلالة L2 / 434/Bu / آي تي سي سي VR902B) هو BSL2 الممرض. الرجوع إلى إجراءات التشغيل الموحدة المؤسسية (SOP) عن التعامل مع مثل هذه الكائنات الممرضة.

  1. إعداد الخلايا المستزرعة والعدوى:
    1. بذور ما يقرب من 1 × 10 6 خلايا فيرو (آي تي سي سي سي سي-81) لكل 25 سم 2 (T25) قارورة في 3 مل من Dulbecco التعديل النسر متوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS). احتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2. ينبغي أن تشكل خلايا أحادي الطبقة متموجة في غضون 24 ساعة.
    2. نضح المتوسطة. تصيب متكدسة T25 قوارير من الخلايا فيرو مع الكلاميديا ​​في عدد وافر من العدوى (وزارة الداخلية) من 5 (~ 14 × 10 6) في إجمالي حجم 3 مل من المتوسط ​​(DMEM، 200 نانوغرام / مل cyclohexamide، و 10٪ FBS).
  2. تبدأ الطفرات في 18 ساعة إصابة آخر (HPI):
    1. إعداد 20 ملغ / مل EMS (الأثيل methanesulfonate) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) مع 0.9 ملم الكالسيومكلوريد و 0.49 ملي كلوريد المغنيسيوم في غطاء السلامة الكيميائية كما EMS هو سائل طيار.
      ملاحظة: EMS هو المغير قوية ومسرطنة. تحييد EMS النفايات وتطهير الانسكابات والبلاستيك والورق، والأواني الزجاجية مع 1 M هيدروكسيد الصوديوم.
    2. نضح المتوسطة وغسل خلايا مرة واحدة مع 3 مل من برنامج تلفزيوني / MgCl 2 / و CaCl 2. احتضان الخلايا مع 3 مل من 20 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني EMS / MgCl 2/2 و CaCl لمدة ساعة واحدة في غطاء الدخان في درجة حرارة الغرفة. خلايا فيرو قادرون على البقاء على قيد الحياة هذا التركيز من نظم الإدارة البيئية وظروف خارج الحاضنة لفترات قصيرة. تذكر أن تشمل العينة الضابطة التي لم يتم mutagenized.
    3. إزالة المتوسطة التي تحتوي على EMS ووضعه في وعاء من 1 M هيدروكسيد الصوديوم لإبطال نشاط المغير. غسل الخلايا المصابة 3 مرات في 3 مل PBS + MgCl 2/2 و CaCl لإزالة المغير المتبقية. إضافة 6 مل من FBS DMEM/10٪ مع 200 نانوغرام / مل cyclohexamide و 25 ميكروغرام / مل جنتاميسين، واحتضان عند 5٪ CO 2، 37 درجة مئوية لمدة 48-72 ساعة. مشتملات تظهر خالية من البكتيريا حوالي 36 ساعة بعد الطفرات. في 72 ساعة تمتلئ حوالي 10٪ من الادراج مع البكتيريا في حين أن بقية تبقى فارغة.
    4. استخراج EBS بواسطة تحلل منخفض التوتر: نضح تماما المتوسطة. إضافة 1.0 مل H 2 O والصخور لإزاحة الخلايا لمدة 10 دقيقة. ليز الخلايا عن طريق pipetting صعودا وهبوطا لمدة 10 مرات على الأقل. جمع المحللة في microfuge وإضافة 0.250 مل الفوسفات السكروز 5X العازلة الغلوتامات (SPG) للوصول بها إلى تركيز النهائي 1X. المحل في -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن تقييم مستوى الطفرات التي كتبها تحريض المقاومة ريفامبين. لفحص وتيرة المقاومة ريفامبين، لوحة 1 × 10 8 و 7 × التخفيفات التسلسلي 10 أضعاف من البكتيريا في وجود 200 نانوغرام / مل من ريفامبين. يتم تعريف وتيرة المقاومة ريفامبين حيث وصل عدد لويحات مقاومة ريفامبين مقسوما على العدد الكلي للبكتيريا مطلي. انظر أدناه للحصول على إرشادات لوحة.

2. العزلة نسيلي من الكلاميديا ​​المتدثرة سلالات متحولة بواسطة تنقية البلاك

  1. تعيين الطبقات الوحيدة متموجة من الخلايا فيرو في 6 لوحات جيدا: بذور ~ 0.4 × 10 6 خلايا في 3 مل DMEM/10٪ FBS لكل بئر. تسمح للخلايا لتشكيل أحادي الطبقة متجانسة أكثر من ال 24 ساعة القادمة.
  2. ذوبان الجليد محلول المخزون من الكلاميديا ​​mutagenized على الجليد. تنفيذ 6 × التخفيفات التسلسلي 10 أضعاف في حجم ما مجموعه 200 ميكرولتر لكل التخفيف في FBS DMEM/10٪ ومجموعة منهم على الجليد.
    ملاحظة: عيار البكتيرية في وحدات تشكيل إدراج (IFU) هو تقدير جيد من الوحدات المكونة لوحة (PFU). نهدف إلى لوحة 10، 100، و 1000 PFU.
  3. غسل الخلايا مرتين مع فيرو 3 مل PBS لكل بئر.
  4. إضافة 3 مل DMEM إلى كل بئر ل6 لوحات جيدا و 100 ميكرولتر من التخفيفات البكتيرية في مكررة. دوامة لوحة لضمان حتى الخليط.
  5. تدور لوحات المصابة في 2،700 x ج لمدة 30 دقيقة عند 15 درجة مئوية ثم احتضان عند 37 درجة مئوية في ترطيب،5٪ CO 2 الحاضنة لمدة 1-2 ساعة.
  6. إعداد 0.54٪ الاغاروز في DMEM (لمدة 6 آبار):
    1. إضافة المكونات التالية: 18.9 مل الباردة 2X DMEM، 4.2 مل FBS، 0.42 مل 100X NEAA، 0.042 مل 200 ميكروغرام / مل cyclohexamide، 0.021 مل 50mg/ml الجنتاميسين. تخلط جيدا.
    2. خلط في 18.9 مل من الملفات الساخنة العقيمة 1.2٪ الاغاروز / H 2 O، واثارة لمنع كتل. يجب أن يكون الخليط دافئ للمس. نضع في حمام مائي دافئ في درجة حرارة 55 مئوية قبل إضافة إلى الخلايا المصابة.
  7. نضح تعليق البكتيرية من الأطباق وتطبيق 6 مل 0.54٪ الاغاروز / DMEM لكل بئر. السماح لترسيخ agarose تماما في درجة حرارة الغرفة خارج غطاء محرك السيارة لمدة 15 دقيقة. تجف لوحات مع أغطية إزالتها، في هود للسلامة الأحيائية لمدة 15 دقيقة.
    ملاحظة: يمكن أن الاهتزاز من غطاء محرك السيارة الاحتواء البيولوجي تشويه الاغاروز التقويه.
  8. احتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO 2 لمدة 7-10 أيام. وينبغي أن تكون لويحات واضحة مع المعونة من مجهر تشريح. (REفر إلى الشكل 3 للحصول على صورة نموذجية لويحات.)
  9. قبل يوم من المسوخ عزل، والبذور 1 × 10 4 خلايا فيرو في 100 ميكرولتر لكل بئر في لوحة 96 جيدا. الخلايا سوف تكون متكدسة في غضون 24 ساعة.
  10. باستخدام مجهر تشريح، لويحات علامة ويمكن الحصول عليها. جمع المقابس لويحات باستخدام معقم 1.0 مل حاجز ماصة.
  11. لويحات resuspend في 100 ميكرولتر من DMEM تستكمل مع FBS 10٪، 400 نانوغرام / مل cyclohexamide، 50 ميكروغرام / مل جنتاميسين.
  12. لتوسيع سلالات متحولة، تراكب تعليق على الطبقات الوحيدة متموجة من الخلايا فيرو. تدور لوحات في 2،700 x ج، 15 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  13. احتضان عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2 في حاضنة مرطب. الحصاد EBS عندما يصاب> 50٪ من الخلايا، التي يمكن أن تحدث في وقت مبكر من 48 HPI ووقت متأخر من 14 يوما. هذه الكمية من الخلايا المصابة يسمح البكتيريا قادرة على البقاء بما فيه الكفاية ليتم تخزينها. سلالات متحولة تختلف في معدلات النمو والعدوى. تسمح إبطاء سلالات متزايدة لناتوراLLY إعادة تصيب الخلايا المجاورة حتى يصاب ما يكفي من خلايا.
  14. استخراج EBS بواسطة تحلل منخفض التوتر من الخلايا المصابة:
    1. نضح تماما المتوسطة.
    2. إضافة 160 ميكرولتر من الماء المعقم. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
    3. تعطيل الخلايا عن طريق pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات لضمان تحلل كامل، استخدم الحاجز نصائح لتجنب التلوث المتبادل.
    4. نقل 160 ميكرولتر من لست] إلى أنابيب microfuge.
    5. خلط في 40 ميكرولتر من SPG 5X. المحل في -80 درجة مئوية.
  15. فحص وشاشة المسوخ عن النمط الظاهري (ق) من الفائدة.

3. كامل تسلسل الجينوم من المسوخ الكلاميديا ​​مختارة

  1. استخراج الحمض النووي الجيني من التدرج المنقى EBS، التي تكون خالية إلى حد كبير من تلويث الحمض النووي المضيف. بروتوكولات للثقافة نطاق واسع من الكلاميديا ​​وتنقية EBS يمكن العثور عليها في المرجع. (17). استخدام الجيني مجموعات تنقية الحمض النووي التجارية (مثل QIAGEN القط. 69504) إلى تحويلةطلاق DNA من 2 × 10 9 البكتيريا باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
  2. استخدام مقياس التألق (و qubit، إينفيتروجن القط. Q32866) إلى قياس دقيق لكمية من الحمض النووي. مطلوب 1-5 ميكروغرام من الحمض النووي المنقى لمنصة التسلسل البورشيد.
    ملاحظة: العديد من منصات يمكن استخدامها لالجينوم البكتيري تسلسل، بما في ذلك نظم Illumina/Solexa- والمستندة إلى صلب. لقد اخترنا لاستخدام HiSeq (البورشيد) كما أنها تنتج كثافة عالية من القصير، ولكن التسلسل جودة عالية يقرأ. أصغر التعاقب الجينوم الحجم، مثل IonTorrent (لايف تكنولوجيز) وMySeq (البورشيد) هي مناسبة جدا وأكثر من كافية لهذه quencing الإرسال المتعدد لمدة تصل إلى 4 الجينوم الكلاميديا ​​في وقت واحد، وهو ما يتجاوز الحد الأدنى من التغطية من 25X لتجميع الجينوم كافية. موصوفة إعداد الحمض النووي المكتبات التسلسل لمنصة البورشيد أدناه.
  3. DNA جزء إلى الحجم المناسب (300-400 الزوج قاعدة لالبورشيد التسلسل) باستخدام التكيفية الصوتيات المركزة S220 فيstrument (Covaris) وفقا للإعدادات اقترح المصنعة. ملاحظة: تجزئة الحمض النووي عن طريق النتائج إرذاذ في أكبر خسارة من عينة بسبب استضباب من العينة.
  4. إعداد مكتبات التسلسل الجيني باستخدام مجموعات البناء التجاري (البورشيد FC-102-1001)، تنفيذا لتعليمات الشركة المصنعة. المكتبات يمكن فهرستها باستخدام بادئات barcoded (البورشيد FC-121-1003) بحيث عينات متعددة يمكن تجميع والتسلسل في وقت واحد.
  5. تشغيل تسلسل العينات. هذه الخطوة عادة ما يتم إجراء الخدمات التجارية أو المرافق الأساسية التي تديرها الموظفين التقنيين مخصص. اتبع الإجراءات وتوصياتهم.
  6. البورشيد الاستخدام (شكل FASTQ) يمكن تجميعها إلى الجينوم المرجعية باستخدام المستخدم ودية واجهة المستخدم الرسومية البرمجيات، مثل Geneious (Biomatters)، والتي يمكن استخدامها أيضا لSNP / تحديد الطفرات. إلى حدوث طفرات الخريطة، تعيين المعلمات إلى 90٪ للتردد متغير الحد الأدنى و50X لتغطية الحد الأدنى. فتح sourcويمكن أيضا ه المجمعات الجينوم، مثل MAQ (18) والتحالف (19)، ويمكن استخدامها.
  7. تأكيد الطفرات التي كتبها سانجر التسلسل: استخدام الحمض النووي الجيني كقالب لPCR التضخيم من 300-500 المناطق المحيطة BP الطفرات التي تم تحديدها وتسلسل تنقيته أو المخفف (1:20) منتجات PCR بواسطة سانجر التسلسل.

4. جيل من Recombinants الكلاميديا

ملاحظة: الكلاميديا ​​يمكن تبادل الحمض النووي خلال العدوى، والذي يسمح لتوليد سلالات المؤتلف (12، 13، 20). بعد العدوى المشتركة من الخلايا مع اثنين من السلالات المقاومة للمضادات الحيوية فريدة من نوعها، المؤتلف "ذرية" يمكن اختيارها لمقاومة المضادات الحيوية مزدوج (12، 13). ونحن قد استفادت من هذه الظاهرة للفصل بين الطفرات وتوليد سلالات المشترك إسوي. وبالتالي، تم إنشاؤها سلالات متحولة في الخلفية المقاومة للمضادات الحيوية (مثل ريفامبين المقاومة (ريف R) H471Y في CTL0567 (rpoB)) بحيث يمكن تجاوزه لنوع السلالة البرية bearinGA مختلفة أليل المقاومة للمضادات الحيوية (مثل مقاومة السبيكتينوميسين (SPC R)، G1197A في r01/r02 (16SRNA نسخ 1 و 2)). للحصول على تفاصيل بشأن تبادل الحمض النووي وإعادة التركيب في الكلاميديا، ارجع إلى مراجع (12، 13).

  1. شارك في تصيب نوع البرية وسلالات متحولة النسيلي بواسطة centrifuging6 × 10 5 من كل سلالة البكتيريا على الطبقات الوحيدة متموجة من الخلايا فيرو نمت على 24 لوحة جيدا. في موازاة ذلك، تصيب الطبقات الوحيدة مع كل سلالة وحده.
  2. في 44 HPI، الحصاد EBS بواسطة تحلل منخفض التوتر من الخلايا المصابة:
    1. نضح تماما المتوسطة.
    2. إضافة 0.4 مل من الماء المعقم واسمحوا الوقوف لمدة 10 دقيقة.
    3. ليز الخلايا النشطة pipetting صعودا ونزولا لمدة 10 مرات على الأقل. نقل لست] إلى أنبوب microfuge.
    4. خلط في 0.1 مل من SPG 5X لتركيز النهائي من 1X SPG.
    5. لست] الخام يمكن استخدامها على الفور أو تخزينها في -80 درجة مئوية.
  3. لوحة 50 ميكرولتر من EB الخام محضرات علىد 5 × 1:10 التخفيفات التسلسلي في الاغاروز / DMEM تستكمل مع المضادات الحيوية المناسبة لاختيار لrecombinants. (انظر الجدول لتركيزات المضادات الحيوية نموذجية لاختيار recombinants.)
  4. لوحة تنقية وإثراء سلالات المؤتلف على النحو الوارد أعلاه. recombinants نقاط عن وجود أو عدم وجود النمط الظاهري المطلوب. استخراج الحمض النووي من سلالات المؤتلف عن طريق العلاج DNAzol (القسم التالي) لغرض التنميط الجيني لوجود أو عدم وجود الطفرات.
  5. ويمكن تكرار الصلبان مع السلالات الأخرى تحمل علامات مقاومة المضادات الحيوية لمواصلة عزل الطفرات، وتوليد سلالات إسوي. شارك في تصيب recombinants المحدد إلى نوع السلالة البرية أخرى تحمل علامة المضادات الحيوية المختلفة.

الجدول 1: تركيزات المضادات الحيوية لاختيار recombinants:

تركيز النهائي تعليمات إعداد
200 نانوغرام / مل ريفامبين جعل 25 ملغ / مل في الأسهم تخزين سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO). تعويض 200 ميكروغرام / مل حل العاملة عن طريق تمييع الأسهم تخزين مع H 2 O. تخزينها في -20 درجة مئوية في الظلام.
200 ميكروغرام / مل ميثوبريم جعل ملغ / مل الأسهم 100 في DMSO. تخزينها في -20 ° C
200 ميكروغرام / مل السبيكتينوميسين جعل ملغ / مل الأسهم 100 في الماء في 100 ميكرولتر مأخوذة. المحل في -20 درجة مئوية. تجنب تكرار تجميد ذوبان الجليد.

5. استخراج الحمض النووي الجينوم من سلالات المؤتلف التنميط الجيني لل

ملاحظة: يمكن أيضا مجموعات تنقية القائمة على عمود استخدامها. من حيث التكلفة ميزة استخراج الحمض النووي عن طريق العلاج DNAzol.

  1. تصيب 1.2 × 10 5 متدثرات على الطبقات الوحيدة من خلايا فيرو نمت على لوحات ال 12 جيدا.
  2. في 36-48 HPI، نضح المتوسطة وإضافة 0.375 مل من DNAzol (إينفيتروجن 10503-027). تستنهض الهمم بلطف الخلايا والماصة LYSATES إلى 1.5 مل microfuge أنبوب.
  3. الحمض النووي يعجل من خلال إضافة 0.188 مل من الإيثانول بنسبة 100٪. مزيج من قبل انقلاب.
  4. استخراج الحمض النووي عن طريق التخزين المؤقت مع طرف ماصة ووضعه في أنبوب نظيفة. بدلا من ذلك، بيليه الحمض النووي عن طريق الطرد المركزي في سرعة قصوى لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أو 4 درجات مئوية، وطاف صب.
  5. غسل الحمض النووي يعجل مرتين مع 1.0 مل من الإيثانول بنسبة 75٪.
  6. DNA الهواء الجاف بعد إزالة الإيثانول لمدة 15 ثانية.
  7. ذوبان الحمض النووي مع 0.2 مل 8 ملم هيدروكسيد الصوديوم ثم تحييد لدرجة الحموضة 8.0 مع 20.2 ميكرولتر من 0.1 M HEPES. جلب ما يصل إلى الحجم النهائي من 0.5 مل مع الماء أو TE. بدلا من ذلك، resuspend الحمض النووي في TE العازلة (DNA بيليه لن solubilized تماما).
  8. استخدام الحمض النووي المستخرج DNAzol-كقالب لPCR التضخيم من 300-500 المناطق المحيطة BP الطفرات التي تم تحديدها. تسلسل تنقيته أو المخفف (1:20) منتجات PCR بواسطة سانجر التسلسل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التعرض لالمغير يؤدي إلى مشتملات التي تظهر خالية من البكتيريا، يفترض أن يعود إلى موت الخلايا البكتيرية. عادة، سوف ضرب مصلي LGV-L2 ليز الخلايا المصابة تماما في غضون 48 ساعة إصابة آخر، ولكن العلاج مع المطفرة يمكن أن تمتد هذه الدورة ل> 90 ساعة. ومن المتوقع لاسترداد ما يقرب من 10٪ من الادراج. في تجاربنا، وخلايا فيرو المصابة تعامل مع 20 ملغ / مل EMS أدى إلى انخفاض 99٪ في التعافي من ذرية المعدية مقارنة مع الضوابط غير المعالجة. أدى العلاج المغير أيضا إلى ظهور لويحات مع الأشكال التضاريس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذه المنهجية يلبي المتطلبات الأساسية للتحليل الجيني كما أنها تضع الربط بين الأنماط الجينية والظواهر. الأهم من ذلك، ويتحقق هذا بدون مساعدة من الأدوات الجزيئية التقليدية للتحول الحمض النووي المؤتلف وتعطيل غرزي من الجينات في البكتيريا، والتي غالبا ما يكون معدل الحد خطوة في تحليل وظيفة الجين في الميكروبات غير النموذجية.

واحد خطوة حاسمة في ضمان قابلية التنسيل من المسوخ البلاك-تنقيته. التلوث المتبادل مع نوع البرية أو ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس هناك شيء في الكشف عنها.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
دولبيكو s Modified Eagle Medium (DMEM)Life Technologies11995-073
مصل الأبقار الجنينية (FBS) Cellgro35-010-CV
إيثيل ميثان سلفونات (EMS) سيجماM0880
CyclohexamideSigmaC4859-1ML
Gentamicin Life Technologies15750-060
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)Life Technologies14190-144
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) مع 0.493 ملي مولار MgCl2< / sub> و 0.901 ملي مولار CaCl2< / sub> (PBS + MgCl2< / sub> / CaCl 2< / sub>) LifeTechnologies14040-133
1 M NaOH
5x SPG buffer (1.25 M سكروز ، 50 ملي فوسفات الصوديوم ، 25 ملي مولار حمض الجلوتاميك)
SPG عازل (0.25 م سكروز ، 10 ملي فوسفات الصوديوم ، 5 ملي مولار حمض الجلوتاميك) ماء
(معقم ، درجة زراعة الأنسجة)
2x DMEM (محضر من مسحوق ، مخزن ب 7.4 جم / لتر بيكربونات الصوديومSigmaD7777
الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA) تقنياتالحياة11140-050
1.2٪ GTG Agarose ، أطقمتعقيم Lonzo50070
مجموعات تنقية الحمض النووي الجينوميQiagen69504
DNAzolLife Technologies10503-027
الإيثانول (درجة البيولوجيا الجزيئية)
8 ملي مولار هيدروكسيد الصوديوم
0.1 م هيبس (4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1- بيبيرازين إيثان سلفونيك حمض ) عازلة
25 سم 2 قوارير لزراعة الأنسجة (قوارير T25)
لوحات زراعة الأنسجة 6 آبار لوحات
زراعة الأنسجة 12 بئر لوحات
زراعة
غطاء أمان
بيولوجي غطاء
> أجهزة الطرد المركزي والمحولات لألواح
الدوارة > مقياس الفلور المجهر
(كيوبت)InvitrogenQ32866
الصوتيات المركزة التكيفية S220Covaris
الأنسجة 96 بئركيميائي الأمان الأنسجةالتشريح

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Haggerty, C. L., et al. Risk of sequelae after Chlamydia trachomatis genital infection in women. J Infect Dis. 201, Suppl 2. S134-S155 (2010).
  2. Dautry-Varsat, A., Subtil, A., Hackstadt, T. Recent insights into the mechanisms of Chlamydia entry. Cell Microbiol. 7 (12), 1714-1722 (2005).
  3. Hybiske, K., Stephens, R. S. Mechanisms of Chlamydia trachomatis entry into nonphagocytic cells. Infect Immun. 75 (8), 3925-3934 (2007).
  4. Heuer, D., Kneip, C., Maurer, A. P., Meyer, T. F. Tackling the intractable - approaching the genetics of Chlamydiales. Int J Med Microbiol. 297 (7-8), 569-576 (2007).
  5. Stephens, R. S., et al. Genome sequence of an obligate intracellular pathogen of humans, Chlamydia trachomatis. Science. 282 (5389), 754-759 (1998).
  6. Thomson, N. R., et al. Chlamydia trachomatis, genome sequence analysis of lymphogranuloma venereum isolates. Genome Res. 18 (1), 161-171 (2008).
  7. Harris, S. R., et al. Whole-genome analysis of diverse Chlamydia trachomatis strains identifies phylogenetic relationships masked by current clinical typing. Nat Genet. 44 (4), 413-419 (2012).
  8. Somboonna, N., et al. Hypervirulent Chlamydia trachomatis clinical strain is a recombinant between lymphogranuloma venereum (L(2)) and D lineages. MBio. 2 (3), e00045-00011(2011).
  9. Voigt, A., Schofl, G., Saluz, H. P. The Chlamydia psittaci genome, a comparative analysis of intracellular pathogens. PLoS One. 7 (4), e35097(2012).
  10. Jeffrey, B. M., et al. Genome sequencing of recent clinical Chlamydia trachomatis strains identifies loci associated with tissue tropism and regions of apparent recombination. Infect Immun. 78 (6), 2544-2553 (2010).
  11. Gomes, J. P., et al. Evolution of Chlamydia trachomatis diversity occurs by widespread interstrain recombination involving hotspots. Genome Res. 17 (1), 50-60 (2007).
  12. DeMars, R., Weinfurter, J. Interstrain gene transfer in Chlamydia trachomatis in vitro, mechanism and significance. J Bacteriol. 190 (5), 1605-1614 (2008).
  13. Demars, R., Weinfurter, J., Guex, E., Lin, J., Potucek, Y. Lateral gene transfer in vitro in the intracellular pathogen Chlamydia trachomatis. J Bacteriol. 189 (3), 991-1003 (2007).
  14. Nguyen, B. D., Valdivia, R. H. Virulence determinants in the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis revealed by forward genetic approaches. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1263-1268 (2012).
  15. Tipples, G., McClarty, G. Isolation and initial characterization of a series of Chlamydia trachomatis isolates selected for hydroxyurea resistance by a stepwise procedure. J Bacteriol. 173 (16), 4932-4940 (1991).
  16. Wang, L. L., Henson, E., McClarty, G. Characterization of trimethoprim- and sulphisoxazole-resistant Chlamydia trachomatis. Mol Microbiol. 14 (2), 271-281 (1994).
  17. Scidmore, M. A. Cultivation and Laboratory Maintenance of Chlamydia trachomatis. Curr Protoc Microbiol. Chapter 11, Unit 11A 11(2005).
  18. Li, H., Ruan, J., Durbin, R. Mapping short DNA sequencing reads and calling variants using mapping quality scores. Genome Res. 18 (11), 1851-1858 (2008).
  19. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
  20. Suchland, R. J., Sandoz, K. M., Jeffrey, B. M., Stamm, W. E., Rockey, D. D. Horizontal transfer of tetracycline resistance among Chlamydia spp. in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 53 (11), 4604-4611 (2009).
  21. Sladek, F. M., Melian, A., Howard-Flanders, P. Incision by UvrABC excinuclease is a step in the path to mutagenesis by psoralen crosslinks in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (11), 3982-3986 (1989).
  22. Wang, Y., et al. Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis, restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector. PLoS Pathog. 7 (9), e1002258(2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

EMS Vero

مقالات ذات صلة