واستخدمت المصفوفات الليفين التي تحتوي على عوامل النمو للاحتفاظ الخلايا الجذعية العصبية المطعمة في مواقع كاملة transection الحبل الشوكي. الخلايا المطعمة شغلها تماما في تجويف الآفة ومتباينة إلى عدة أنواع الخلايا العصبية، بما في ذلك الخلايا العصبية التي امتدت إلى محاور المضيف الحبل الشوكي لمسافات طويلة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تعزيز بقاء وتمايز الخلايا الجذعية العصبية مع الليفين وعامل نمو الكوكتيلات بعد إصابة الحبل الشوكي الشديدة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) يمكن تجديد الذات والتمايز إلى خلايا عصبية والدبقية. يمكن NSCs زرع الخلايا العصبية المفقودة واستبدال الدبقية بعد إصابة الحبل الشوكي (النخاع الشوكي)، ويمكن أن تشكل التبديلات وظيفية لإعادة الاتصال شرائح الحبل الشوكي فوق وتحت الآفة. تم دراسات سابقة التطعيم الخلايا الجذعية العصبية محدودة بسبب بقاء الكسب غير المشروع غير مكتملة داخل تجويف آفة الحبل الشوكي. علاوة على ذلك، لم تتبع الأمثل للبقاء الخلية الكسب غير المشروع، والتمايز، وتمديد العملية. أخيرا، في الدراسات السابقة، تم الإبلاغ عن NSCs الفئران مثقف عادة على التمايز إلى الدبقية عندما المطعمة إلى الحبل الشوكي المصاب، بدلا من الخلايا العصبية، إلا إذا كان مدفوعا مصير لنوع من الخلايا المحددة. لمعالجة هذه القضايا، وضعنا أساليب جديدة لتحسين البقاء على قيد الحياة، والتكامل وتمايز NSCs لمواقع اصابات النخاع الشوكي حتى شديدة. NSCs تم عزل حديثا من الجنينية يوم 14 الحبل الشوكي (E14) من مستقر المعدلة وراثيا فيشر 344 خط معربا عن الفئران الخضراء فلوريداكانت جزءا لا يتجزأ uorescent البروتين (GFP) وإلى المصفوفة الليفين التي تحتوي على عوامل النمو؛ هذه الصيغة تهدف إلى الإبقاء على الخلايا المطعمة في تجويف الآفة ودعم بقاء الخلية. تم زرع NSCs في الليفين / عامل النمو كوكتيل بعد أسبوعين الصدري مستوى 3 (T3) كاملة transections الحبل الشوكي، وبالتالي تجنب فترات الذروة من الالتهابات. الطعوم الناتجة تملأ تجويف تماما الآفة ومتباينة في كل من الخلايا العصبية، الذي مدد محاور في الحبل الشوكي المضيف لمسافات طويلة بشكل ملحوظ، والدبقية. أدى الطعوم من NSCs الإنسان مثقف التعبير عن GFP في نتائج مماثلة. وبالتالي، يتم تعريف الأساليب لتحسين العصبية ترقيع الخلايا الجذعية والبقاء وتحليل النتائج في الجسم الحي.
المقدمة
إصابة الحبل الشوكي (النخاع الشوكي) غالبا ما يضر ليس فقط مساحات بيضاء المسألة التي تحمل إشارات من وإلى الدماغ، ولكن أيضا المادة الرمادية المركزية، مما تسبب في فقدان قطعي من interneurons والخلايا العصبية الحركية. نتيجة لاصابات النخاع الشوكي هو خسارة كل من المحرك وظيفة الحسية تحت الآفة. وللأسف، فإن الكبار الجهاز العصبي المركزي (CNS) لا تتجدد من تلقاء أنفسهم، مما أدى إلى عجز وظيفي دائم 1. وبالتالي، وإعادة بناء النخاع الشوكي المصاب الكبار وتحسين المحركات والحسية وظيفة اللاإرادي هو هدف مهم من البحوث اصابات النخاع الشوكي. الخلايا الجذعية العصبية (NSCs)، سواء كانت معزولة مباشرة من الجنينية أو الكبار CNS، هي خلايا مرشح مقنعة ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على جميع البروتوكولات الحيوانية VA-سان دييغو المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام اللجنة (IACUC). اتباع إرشادات المعاهد الوطنية للصحة لمختبر الرعاية الحيوانية وسلامة تامة. الحيوانات لديها حرية الوصول إلى الغذاء والماء طوال فترة الدراسة ويتم التعامل على نحو كاف لتقليل الألم والانزعاج.
1. إعداد الليفين مكونات تحتوي على عامل نمو كوكتيل
- حل 25 ملغ الفئران الفيبرينوجين في 0.5 مل PBS الحصول على 50 ملغ / مل 2X محلول المخزون (انظر الجدول مواد). الفيبرينوجين من الصعب حل وي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يوضح وضع العلامات GFP immunohistological أن NSCs الفئران المطعمة معلق في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) (تفتقر إلى المصفوفة الليفين وعوامل النمو) نجا ضعيفا في الموقع transection T3، ربط فقط إلى الهامش الآفة / المضيف وترك معظم موقع الآفة فارغة دون الخلايا المطعمة (الشكل 2A). تحسين بقاء NSCs عندما شارك المطعمة مع المصفوفات الليفين وحدها، ولكن لم الكسب غير المشروع لا تملأ تماما حتى تجويف آفة كبيرة (لا تظهر البيانات). لذلك، نحن جزءا لا يتجزأ من NSCs في المصفوفات التي تح.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
واحدة من العقبات الرئيسية لمجلس الأمن القومي في زرع النخاع الشوكي المصاب هو البقاء على قيد الحياة الفقيرة في مركز الآفة. يمكن أي ثغرات أو تجاويف في موقع الآفة يحتمل أن تقلل أو تضعف تشكيل التبديلات العصبية الوظيفية بين محاور عصبية فوق الشوك وفصل شرائح الحبل الشوكي أسفل الإصابة. بالإضافة إلى ذلك، بقاء الفقراء من NSCs المطعمة قد تؤثر على اندماجهم مع الأنسجة المضيف، وبالتالي الحد من التواصل بين الخلايا العصبية مع الخلايا العصبية المطعمة المضيف. الآليات المحتملة لتفسير فقدان الخلية وتش.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدينا شيء في الكشف عنها.
شكر وتقدير
نشكر مركز بحوث الموارد الجرذ و، جامعة ميسوري، كولومبيا، ميزوري، لتوفير الفئران GFP؛ Neuralstem شركة لتوفير الخلايا الجذعية العصبية البشرية. وأيد هذا العمل من قبل إدارة المحاربين القدامى، المعاهد الوطنية للصحة (NS09881)، منظمة البحوث الشوكي الكندي، ومؤسسة نيلسون H. كريغ، وبرنارد والثقة آن سبيتزر الخيرية.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Fibrinogen (الفئران) | Sigma | F6755-25MG | 2 ساعة عند 37 & درجة; C إلى dissovle تركيز المخزون: 50 مجم / مل التركيز النهائي: 25 مجم / مل |
| ثرومبين (فأر) | Sigma | T5772-100UN | Dissovle في 10 ملي مولار CaCl 2< / sub> تركيز المخزون: 50 U / ml التركيز النهائي: 25 مجم / مل |
| bFGF (إنسان) | Sigma | F0291 (25 & # 956; ز) | تركيز المخزون: 200 نانوغرام /&مو ؛ l التركيز النهائي: 10 نانوغرام /&مو ؛ ل |
| EGF (مورين) | سيجما | E1257 (0.1 مجم) تركيز | المخزون: 200 نانوغرام /&مو ؛ l التركيز النهائي: 10 نانوغرام /&مو ؛ ل |
| BDNF (بشري) | Peprotech | 452-02 (1 مجم) | تركيز المخزون: 1,000 نانوغرام /&mu ؛ ل التركيز النهائي: 50 نانوغرام /&مو ؛ ل |
| NT-3 (بشري) | Peprotech | 452-03 (1 مجم) تركيز | المخزون: 1,000 نانوغرام /&mu ؛ ل التركيز النهائي: 50 نانوغرام /&مو ؛ ل |
| GDNF (الفئران) | سيجما | G1401 (10 &# 956; ز) | تركيز المخزون: 200 نانوغرام /&مو ؛ l التركيز النهائي: 10 نانوغرام /&مو ؛ ل |
| منتدى إدارة الإنترنت-1 (الماوس) | سيجما | I8779 (50 μ ز) | تركيز المخزون: 200 نانوغرام /&مو ؛ l التركيز النهائي: 10 نانوغرام /&مو ؛ ل |
| aFGF (الإنسان) | سيجما | F5542 (25 &# 956; ز) | تركيز المخزون: 200 نانوغرام /&مو ؛ l التركيز النهائي: 10 نانوغرام /&مو ؛ ل |
| PDGF-AA (الإنسان) | سيجما | P3076 (10 &# 956; ز) | تركيز المخزون: 200 نانوغرام /&مو ؛ l التركيز النهائي: 10 نانوغرام /&مو ؛ ل |
| HGF (الإنسان) | سيجما | H9661 (5 &# 956; ز) | تركيز المخزون: 200 نانوغرام /&مو ؛ l التركيز النهائي: 10 نانوغرام /&مو ؛ ل |
| MDL28170 | سيجما | M6690 (25 مجم) | مخزون في DMSO تركيز المخزون: 1 ملم التركيز النهائي: 50 مو ؛ M |
| PBS | Millipore | BSS-1005-B | تركيز المخزون: 1x التركيز النهائي: 1x |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Ketamine Putney | 26637-411-01 | 40-80 مجم / كجم تركيز المخزون: 100 مجم / مل التركيز النهائي: 25 مجم / مل | |
| زيلازين | لويد | 0410 ، | 2.5-8 مجم / مل تركيز المخزون: 100 مجم / مل التركيز النهائي: 5.8 مجم / مل |
| Acepromazine | Butler | 003845 | 0.5-4 مجم / مل تركيز المخزون: 10 مجم / مل التركيز النهائي: 0.25 مجم / مل |
| بيتادين | هيلثبيتس | BET16OZ | |
| Ringers | Abbott | 04860-04-10 | 2-3 مل / بوصة |
| بانامين | شيرينج بلوغ | 0061-0851-03 | 2.5-5 مجم / كجم تركيز المخزون: 50 مجم / مل التركيز النهائي: 0.5 مجم / مل |
| أمبيسلين | ساندوز | 0781-3404-85 | 80-100 مجم / كجم التركيز النهائي: 50 مجم / مل |
| LH-RH | Sigma | L4513 | 200 & mu ؛ جم / كجم التركيز النهائي: 200 مو ؛ جم / مل |
| HBSS | Gibco | 14175-096 | |
| Trypsin | Gibco | 25200056 | تركيز المخزون: 0.25٪ التركيز النهائي: 0.125٪ |
| DMEM | Gibco | 11995073 | |
| FBS | Gibco | 16000044 | تركيز المخزون: 100٪ التركيز النهائي: 10٪ |
| نيوروبازال متوسط | جيبكو | 21103049 | |
| تركيز مخزون B27 | Gibco | 17504044 | : 100x التركيز النهائي: 1x |
| لاحظ ، استخدم الكواشف البشرية لطعوم الخلايا العصبية البشرية |
المراجع
- Ramon y Cajal, S. In Degeneration and regeneration of the nerve system. , New York: Hafner. (1991).
- Jakeman, L. B., Reier, P. J. Axonal projections between fetal spinal cord transplants and the adult rat spinal cord: a neuroanatomical tracing study of local i....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
