زراعة خلايا الإنسان الظهارية الأنف في واجهة الهواء السائل

Loretta Müller; Luisa E. Brighton; Johnny L. Carson; William A. Fischer II; Ilona Jaspers

doi:10.3791/50646

يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

زراعة خلايا الإنسان الظهارية الأنف في واجهة الهواء السائل

37.9K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/50646

⸱

أكتوبر 8, 2013

Loretta Müller¹ , Luisa E. Brighton¹ , Johnny L. Carson¹^,² , William A. Fischer II¹^,³ , Ilona Jaspers¹^,²^,⁴

¹Center for Environmental Medicine, Asthma, and Lung Biology, The University of North Carolina at Chapel Hill, ²Department of Pediatrics, The University of North Carolina at Chapel Hill, ³Pulmonary Diseases and Critical Care, The University of North Carolina at Chapel Hill, ⁴Curriculum in Toxicology, The University of North Carolina at Chapel Hill

في هذه المقالة

ملخص

الخلايا الظهارية الأنفية، تم الحصول عليها من خلال كشط سطحية خزعة من متطوعين من البشر، يتم توسيع ونقل على إدراج زراعة الأنسجة. عند بلوغ confluency، وتزرع الخلايا في واجهة السائل الهواء، مما أسفر عن ثقافات خلايا مهدبة وغير مهدبة. متباينة الثقافات الخلايا الظهارية الأنف تقديم نماذج تجريبية قابلة للحياة لدراسة الغشاء المخاطي في الجهاز التنفسي.

الملخص

نماذج في المختبر باستخدام خلايا الظهارية الابتدائي الإنسان ضرورية في فهم المهام الرئيسية للظهارة التنفسية في سياق الالتهابات الميكروبية أو وكلاء استنشاقه. مقارنات مباشرة من الخلايا التي تم الحصول عليها من السكان المريضة تسمح لنا لتوصيف الظواهر المختلفة وتشريح الآليات الكامنة وراء التوسط تغييرات في وظيفة الخلايا الظهارية. زراعة الخلايا الظهارية من المنطقة رغامي قصبي الإنسان قد تم توثيقه جيدا، ولكن محدودة بسبب توافر أنسجة الرئة الإنسان أو الغازية المرتبطة الحصول على فرش الخزعات الشعب الهوائية. ويتم الحصول على الخلايا الظهارية من خلال الأنف أقل بكثير الغازية سطحية الخزعات كشط الأنف والموضوعات يمكن تحتاج فحص عدة مرات مع عدم وجود آثار جانبية كبيرة. بالإضافة إلى ذلك، والأنف هو نقطة الدخول إلى الجهاز التنفسي، وبالتالي واحدة من المواقع الأولى أن تتعرض إلى أي نوع من الضغوطات المحمولة جوا، مثل العوامل الميكروبية، والملوثات، أو المواد المسببة للحساسية.

لفترة وجيزة، يتم توسيع الخلايا الظهارية الأنف تم الحصول عليها من متطوعين من البشر على المغلفة لوحات زراعة الأنسجة، ثم نقل على إدراج ثقافة الخلية. عند بلوغ confluency، تستمر الخلايا المراد تربيتها في واجهة الهواء السائل (علي)، لعدة أسابيع، مما يخلق أكثر من الناحية الفسيولوجية الظروف ذات الصلة. يستخدم حالة الثقافة ALI سائل الإعلام المعرفة مما يؤدي إلى ظهارة متباينة التي يسلك الخصائص المورفولوجية والوظيفية مشابهة لظهارة الأنف البشري، مع كل من خلايا مهدبة والمخاط المنتجة. إدراج زراعة الأنسجة مع الخلايا الظهارية الأنف متباينة يمكن التلاعب بها في مجموعة متنوعة من الطرق اعتمادا على أسئلة البحث (العلاج مع وكلاء الدوائية، تنبيغ مع ناقلات lentiviral، والتعرض للغازات، أو العدوى الميكروبية مع وكلاء) وتحليل للعديد من نقاط النهاية مختلفة تتراوح بين مسارات الخلوية والجزيئية، الفصل الوظيفيفي نفس الفئة، مورفولوجيا، الخ

نماذج في المختبر من خلايا الظهارية البشرية المتباينة الأنف ستمكن المحققين لمعالجة الرواية وأسئلة بحثية هامة باستخدام نماذج تجريبية عضوي النمط التي تحاكي إلى حد كبير الظهارة الأنفية في الجسم الحي.

المقدمة

الهدف من هذه التقنية

الخلايا الظهارية (ECS) في الشعب الهوائية هي من بين المواقع الأولى أن تتعرض مباشرة إلى الضغوطات البيئية المستنشقة، مثل مسببات الأمراض، والمواد المسببة للحساسية أو ملوثات الهواء. ECS أكثر من حاجز الهيكلية: وهي بمثابة لوحة مفاتيح لبدء وتنظيم الاستجابة المناعية في الجهاز التنفسي ^1-3 عن طريق الافراج عن وسطاء للذوبان ^4-6 والتعبير عن بروابط / المستقبلات على السطحية بهم ^7-9. بينما خطوط الخلايا مخلد يمكن استخدامها كنماذج لدراسة الجهاز التنفسي ECS في المختبر، فإنها تفشل على التمايز إلى السكان الخلية غير متجانسة....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد بلاستيك وير: معطف بلايت

إضافة 500 ميكرولتر PureCol (1:100 المخفف بالماء المعقم) إلى كل بئر من لوحة 12 جيدا.
احتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة لمدة 30 دقيقة، وإزالة PureCol وشطف مع HBSS الحق قبل أن يتم إضافة خلايا لوحة (راجع الخطوة 3.1 أدناه).

2. والحصول على خزعة من Pretreating NECS الإنسان

خزعة الأنف كشط

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

مثقف NECS بعد بروتوكول هنا وصفت إعادة التفريق، في طبقة غير متجانسة من ECS يتألف من خلايا مهدبة وغير مهدبة، ويمثل الوضع في الجسم الحي (الشكل 1). بعض NECS المتباينة هي المخاط إنتاج (خلايا تلطيخ في الزرقاء باستخدام AB / PAS، الشكل 1B). على الرغم من أن بروتوكول المعروضة هنا هو الأمثل، ويمكن التفريق تختلف فيما يتعلق بتوزيع السكان الخلية الكلي (أي نسب مختلفة من الخلايا المهدبة: الخلايا المنتجة للمخاط: خلايا غير مهدبة) أو حتى تسفر عن مز.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

توفير ECS الجهاز التنفسي ليس فقط حاجز مادي لحماية جسم الإنسان من مؤثرات خارجية ^20، ولكن أيضا بمثابة لوحة مفاتيح لبدء وتنظيم الاستجابات الدفاع المناعي الجهاز التنفسي ^1-3 عن طريق إفراز وسطاء للذوبان أو مستقبلات يجند المباشر التفاعلات خلية خلية. من أجل مواصلة دراسة دور ECS في الاستجابة المناعية، لدراسة الخلافات المحتملة بين ECS من السكان المريضة، أو لدراسة آثار الضغوطات الخارجية على ECS، فمن المهم أن ألخص الوضع في الجسم الحي. الشعب الهوائية الإنسان تحتو.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

فإن الكتاب أود أن أشكر ليزا دايلي للمدخلات مفيدة.

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (ES013611 وHL095163)، ومضيفات معهد البحوث الطبية (FAMRI)، وكالة حماية البيئة (CR83346301) وتعلن أي تضارب في المصالح. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة. وإن كان قد مولت البحث الموضحة في هذه المقالة في جزء من وكالة حماية البيئة في الولايات المتحدة من خلال التعاون CR83346301 اتفاق مع مركز الطب البيئي والربو وعلم الأحياء الرئة في جامعة نورث كارولينا، تشابل هيل، لم يخضع ل الوكالة نظير المطلوبة واستعراض ....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

BEGM media< / strong >< / td > < TD >
10 & mu ؛ ل حمض الريتينويك (محلول العمل) < / Li >< / ul > < / TD > < TD >
خلايا البذر في القارورة (الممر 1 ؛ جزئيا) < / Li >< / Ul > < / TD > < / tr >
< td >< / td > < td >
يحافظ على الخلايا في القارورة < / li>< / ul >< / td> < / tr >
< td rowspan = "3" >BEGM ++ وسائط < / strong >< / td > < td >
50 مل Lonza ' s وسائط BEGM مع المكملات الغذائية < / li>< / ul > < / td >
< td >
250 مل BEGM بما في ذلك المكملات الغذائية < / li >< / ul > < / td > < / tr >
< td >
2 مل مستخلص الغدة النخامية البقري (محلول 12.5 مجم / مل) < / li>< / ul> < / td > < / tr>
< td >
75 & mu ؛ ل BSA (محلول 10 مجم / مل) < / ليش>< / ul > < / td > < / tr >
< td rowspan = "5" >< قوي > 200X محلول مخزون هيدروكورتيزون (96 & mu ؛ لتر / مل محل) < / قوي >< / TD > < TD >
200 & ل الهيدروكورتيزون المذاب < / Li > < / TD >
< td >
4250 & mu ؛ ل كلوريد الصوديوم المذاب < / ليثيوم >< / ul >< / TD > < / tr >
< td >
540 & mu ؛ ل ddH₂O
< td > محلول التصفية من خلال 0.22 & mu ؛ مرشح M ، محلول Aliquot وتخزينه عند -20 درجة ؛ C ، تجنب دورات التجميد / الذوبان الإضافية < / td > < / tr > < td rowspan = "3" >PneumaCult-ALI Complete Base Media< / strong>< / TD > < td >
450 مل PneumaCult-ALI Basal Medium < / li>< / ul > < / td > < td >
الوسط الأساسي لجميع وسائط PneumaCult-ALI الثلاثة < / li>< / ul >< / td > < / tr >
< td >
50 مل PneumaCult 10x مكمل غذائي < / li>< / ul>< / td > < td >
إن وسائط PneumaCult حساسة للضوء ، وبالتالي احتفظ بها دائما في الظلام < / li>< / ul> < / td > < / tr>
< TD> (هذا مستقر لمدة أسبوعين عند 2-8 درجة ؛ C أو لمدة تصل إلى 6 أشهر عند -20 درجة ؛ ج) < / td > < td >< / td > < / tr > < td rowspan = "4" > pneumaCult-ALI Maintenance Medium< / strong>< / td > < td > لكل 1 مل من PneumaCult-ALI Complete Base Medium إضافة: < / td > < td rowspan = "4" > ثقافة ALI على الإدخالات < / td > < / tr > < td >
10 & mu; ل PneumaCult 100x الصيانة< م > الملحق < / li>< / ul>< / td > < / tr >
< td >
2 & mu ؛ ل الهيبارين (من محلول مخزون 2 ملغ/مل)

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
منظار الأنف	Welch Allyn	Model 22009	9 مم ، بولي برويلين قابل لإعادة الاستخدام
، منظار الأذن التشغيلي	Welch Allyn	Model 21700
كوفيت خلية مسبار وحيد	القرن Arlington Scientific	SY-96-092	ثني رأس الكوفيت أكثر بقليل
من ألواح الثقافة المكونة من 12 بئر Corning		3512
إدراج ثقافة الخلايا الغشائية Transwell	قارورة Corning	3460
لزراعة الأنسجة	Corning	430639 و 430641	T25 و T75 قارورة تنفيس
RPMI 1640 وسائط (مع L-Glutamine)	Gibco	11875
نمو الخلايا الظهارية القصبية / القصبة الهوائية تطبيقات الخلايا المتوسطة		511-500
BEGM نمو الخلايا الظهارية القصبية المتوسطة	Lonza	CC-3170	يأتي هذا كمجموعة من زجاجة واحدة متوسطة وقوارير مع المكملات الغذائية.
محلول بيكربونات الصوديوم 7.5٪	Gibco	25080	استخدم كما هو.
355104 استخدام NuSerum	BD Biosciences		كما هو.
BAMBANKER تجميد الوسائط	BAMBANKER	302-14681	استخدم كما هو.
CoolCell	Biocision	HTBCS-136	(حاوية تجميد الخلايا الخالية من الكحول CryoPrep)
PureCol	AdvancedBioMatrix	5005-B	تمييع 1: 100 بالماء المعقم (يجب أن يكون حوالي 0.03 مجم / مل) استخدم 500 مو ؛ لتر / بئر من لوحة HBSS ذات 12 بئر
مع Ca^{2< / sup> و Mg^{2 + < / sup>}}	Gibco	14025
DNAse 1	Sigma	DN25	تذوب عند 1.5 مجم / مل ، وهو محلول 100x ، أضف 10 & mu ؛ ل لكل مل من التربسين وسائل
الإعلام ، 0.25٪ ، 1x ، مع الفينول الأحمر	Gibco	25200-056	الاستخدام في ذلك هو
مثبط التربسين من فول الصويا (SBTI)	Sigma	T6522	استخدم المذاب في HBSS بتركيز 1 مجم / مل
حمض الريتينويك	سيجما	R7632	يجعله 100 & mu ؛ محلول مخزون M (انظر أدناه) ، مخفف إلى 10 مو ؛ م مع الكحول المطلق ، خذ 5 مو ؛ ل من هذا وأضفه إلى 1 مل من وسائط BEGM (حل العمل الخاص بنا). يحتوي الريتينول المتحول بالكامل على معامل انقراض يبلغ 52,480 في الإيثانول عند 325 نانومتر. يذوب 25 مجم في 50 مل من الإيثانول المطلق. يجب إجراء التخفيفات التسلسلية ، وتخفيف 50 مل من المخزون في 450 مل من الإيثانول المطلق ، وأخذ 50 مل من هذا ، وتخفيفه في 450 مل من الإيثانول المطلق ، وأخذ 50 مل من هذا ، وتخفيفه في 450 مل من الإيثانول المطلق ، ومرة أخرى خذ 50 مل من هذا ، وتخفيف 450 مل من الإيثانول المطلق ، خذ 100 مل من هذا وتخفيفه في 900 مل من الإيثانول المطلق واقرأ في مقياس الطيف الضوئي عند 325 نانومتر ، ثم يتم ضرب هذا الرقم في عامل التخفيف ، ثم مقسوما على معامل الانقراض 52,480 ، سيعطي هذا رقما بالملليمتر. اصنع مخزونا بحجم 100 ملي مولار (قم بتخزينه عند -20 درجة ؛ ج) ومن هذا المخزون يتم صنع 10 ملي مولار ، سيكون حمض الريتينويك اليومي المطلوب 5 مل من هذا 10 ملي مولار في 995 مل من وسائط ALI. مثال: قراءة 325 نانومتر هي 1.15. 1.15 × 10,000 (عامل التخفيف) / 52,480 = 0.219 = 219 ملي مولار ، اصنع مخزونا 100 ملي من هذا ، في الإيثانول المطلق.
DMEM نسبة عالية من الجلوكوز (1x) ، سائل ، مع L-glutamine وبيروفات الصوديوم	Gibco	11995
مستخلص الغدة النخامية البقري	Gibco	13028-014	المستخدمة في وسائط BEGM ALI.
نيستاتين	سيجما	N4014-50 مجم	اصنع محلول 3.3 مجم / مل.
ألبومين مصل الأبقار	فيشر Scientific	BP1600-100	اصنع محلولا من محلول 10 مجم / مل في ماء مللي كيو.
PneumaCult-ALI media	StemCell	5001	يأتي هذا كمجموعة من زجاجة واحدة من الوسط وقوارير مع المكملات الغذائية. لمزيد من التفاصيل انظر أدناه.
Hydrocortisone	StemCell	7904	قم بإذابة 2.4 مجم من الهيدروكورتيزون في 1 مل ddH _{2< / sub>O (يستخدم لصنع محلول مخزون الهيدروكورتيزون 200x) ملح}
الصوديوم الهيبارين في PBS (2 مجم / مل)	StemCell	7980	استخدم فيه.
قوارير فلتر (500 مل)	كورنينج	431097	0.22 مو ؛ م حجم المسام
أنابيب الترشيح (50 مل) ميليبور		SCGP00525	Steriflip ، 0.22 & m حجم المسام
نصائح الماصة - ART Barrier Tips	المنتجات الحيوية الجزيئية	2139RI ، 2069RI ، 2179RI
أنابيب مخروطية ، معقمة ، 15 مل و 50 مل
ddH _{2< / sub >O ، الإيثانول المطلق ، ثلج}
CO_{2< / sub> حاضنة}
الطرد
خزانة
(P2 ، P200 ، P1000) ، 9 في ماصات
قفازات
معطف مختبر مع أصفاد ضيقة
الوسائط والحلول المستخدمة: < / strong >< / td > < td > وصفة< / strong >< / td >	used for < / strong >< / td > < / tr >
500 مل BEGM خلية الوسائط التطبيق مع كمية واحدة من حمض الريتينويك < / li>< / ul > < / td >	(امزجها نصف النصف وقم بالفلف) < / td > < / tr >
500 مل BEGM Lonza مع كمية واحدة من المكملات أحادية الاقتباس < / li>< / ul>< / td >	< ul> هضم الخزعة< / li>< / ul> < / td> < / tr>
BEGM + media	50 مل وسائط BEGM < / li>< / ul>< / td>	الحفاظ على الخلايا على البلاستيك في الألواح (الممر 0) < / Li >< / ul >< / TD > < / tr >


بذر الخلايا الطازجة في صفيحة 12 بئرا على البلاستيك < / li>< / ul > < / td > < / tr>
1 مل ثنائي الكربوهيدرات الصوديوم < / li>< / ul> < / td >	الحفاظ على الخلايا في الألواح على البلاستيك (passage0 ؛ جزئيا فقط) < / li>< / ul> < / td > < tr>
2.5 مل NuSerum < / li>< / ul > < / td > < td > خلايا البذر في القارورة (passage1 ؛ جزئيا) < / li>< / ul> < / td > < / tr>
BEGM ALI media	250 مل DMEM-H < / li>< / ul>< / td>	الحفاظ على الخلايا على الواجهة قبل أن تذهب ALI< / li>< / ul> < / td> < / tr >


	1 مل Nystatin (محلول 3.3 مجم / مل) < / li>< / ul > < / td > < / tr >

كمكمل ل PneumaCult-ALI Complete Base Medium لليوم الأخير في القارورة وعندما تكون الخلايا على إدراج < / li>< / ul > < / td > < / tr >


	10 & mu; ل الإيثانول المطلق < / Li >< / ul > < / TD > < / tr >

5 & mu; ل هيدروكورتيزون (من 96 & مو ؛ لتر / مل محلول مخزون) < / ليثيوم >< / ul >< / TD > < / TR > < / tbody > < / table>

المركزي المبردماصات السلامة البيولوجيةزجاجية< TD Colspan = "4" > < حدود الجدول = "1" > < tbody > < td colspan = "3" > ملاحظة عامة: قم دائما بتسخين الوسائط إلى درجة حرارة الغرفة < / td > < / tr > < td rowspan = "2" >

المراجع

Swamy, M., Jamora, C., Havran, W., Hayday, A. Epithelial decision makers: in search of the 'epimmunome. Nat. Immunol. 11, 656-665 (2010).
Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. The airway epithelium: soldier in the fight against respiratory viruses. C....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

مزارع الواجهة الجوية والسائلة وحواضن المزارع الخلوية وأطباق زراعة الأنسجة وخزعة كشط الأنف ووسط BEGM Plus واستزراع Transwell والتمايز المخاطي الهدبي وبصمة ويسترن.

زراعة خلايا الإنسان الظهارية الأنف في واجهة الهواء السائل