يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

زراعة خلايا الإنسان الظهارية الأنف في واجهة الهواء السائل

37.9K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/50646

⸱

أكتوبر 8, 2013

 ,  ,  ,  , 
1Center for Environmental Medicine, Asthma, and Lung Biology, The University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Pediatrics, The University of North Carolina at Chapel Hill, 3Pulmonary Diseases and Critical Care, The University of North Carolina at Chapel Hill, 4Curriculum in Toxicology, The University of North Carolina at Chapel Hill

في هذه المقالة

ملخص

الخلايا الظهارية الأنفية، تم الحصول عليها من خلال كشط سطحية خزعة من متطوعين من البشر، يتم توسيع ونقل على إدراج زراعة الأنسجة. عند بلوغ confluency، وتزرع الخلايا في واجهة السائل الهواء، مما أسفر عن ثقافات خلايا مهدبة وغير مهدبة. متباينة الثقافات الخلايا الظهارية الأنف تقديم نماذج تجريبية قابلة للحياة لدراسة الغشاء المخاطي في الجهاز التنفسي.

الملخص

نماذج في المختبر باستخدام خلايا الظهارية الابتدائي الإنسان ضرورية في فهم المهام الرئيسية للظهارة التنفسية في سياق الالتهابات الميكروبية أو وكلاء استنشاقه. مقارنات مباشرة من الخلايا التي تم الحصول عليها من السكان المريضة تسمح لنا لتوصيف الظواهر المختلفة وتشريح الآليات الكامنة وراء التوسط تغييرات في وظيفة الخلايا الظهارية. زراعة الخلايا الظهارية من المنطقة رغامي قصبي الإنسان قد تم توثيقه جيدا، ولكن محدودة بسبب توافر أنسجة الرئة الإنسان أو الغازية المرتبطة الحصول على فرش الخزعات الشعب الهوائية. ويتم الحصول على الخلايا الظهارية من خلال الأنف أقل بكثير الغازية سطحية الخزعات كشط الأنف والموضوعات يمكن تحتاج فحص عدة مرات مع عدم وجود آثار جانبية كبيرة. بالإضافة إلى ذلك، والأنف هو نقطة الدخول إلى الجهاز التنفسي، وبالتالي واحدة من المواقع الأولى أن تتعرض إلى أي نوع من الضغوطات المحمولة جوا، مثل العوامل الميكروبية، والملوثات، أو المواد المسببة للحساسية.

لفترة وجيزة، يتم توسيع الخلايا الظهارية الأنف تم الحصول عليها من متطوعين من البشر على المغلفة لوحات زراعة الأنسجة، ثم نقل على إدراج ثقافة الخلية. عند بلوغ confluency، تستمر الخلايا المراد تربيتها في واجهة الهواء السائل (علي)، لعدة أسابيع، مما يخلق أكثر من الناحية الفسيولوجية الظروف ذات الصلة. يستخدم حالة الثقافة ALI سائل الإعلام المعرفة مما يؤدي إلى ظهارة متباينة التي يسلك الخصائص المورفولوجية والوظيفية مشابهة لظهارة الأنف البشري، مع كل من خلايا مهدبة والمخاط المنتجة. إدراج زراعة الأنسجة مع الخلايا الظهارية الأنف متباينة يمكن التلاعب بها في مجموعة متنوعة من الطرق اعتمادا على أسئلة البحث (العلاج مع وكلاء الدوائية، تنبيغ مع ناقلات lentiviral، والتعرض للغازات، أو العدوى الميكروبية مع وكلاء) وتحليل للعديد من نقاط النهاية مختلفة تتراوح بين مسارات الخلوية والجزيئية، الفصل الوظيفيفي نفس الفئة، مورفولوجيا، الخ

نماذج في المختبر من خلايا الظهارية البشرية المتباينة الأنف ستمكن المحققين لمعالجة الرواية وأسئلة بحثية هامة باستخدام نماذج تجريبية عضوي النمط التي تحاكي إلى حد كبير الظهارة الأنفية في الجسم الحي.

المقدمة

الهدف من هذه التقنية

الخلايا الظهارية (ECS) في الشعب الهوائية هي من بين المواقع الأولى أن تتعرض مباشرة إلى الضغوطات البيئية المستنشقة، مثل مسببات الأمراض، والمواد المسببة للحساسية أو ملوثات الهواء. ECS أكثر من حاجز الهيكلية: وهي بمثابة لوحة مفاتيح لبدء وتنظيم الاستجابة المناعية في الجهاز التنفسي 1-3 عن طريق الافراج عن وسطاء للذوبان 4-6 والتعبير عن بروابط / المستقبلات على السطحية بهم 7-9. بينما خطوط الخلايا مخلد يمكن استخدامها كنماذج لدراسة الجهاز التنفسي ECS في المختبر، فإنها تفشل على التمايز إلى السكان الخلية غير متجانسة تتكون من خلايا مهدبة الاستقطاب والمخاط المنتجة، على غرار ما لوحظ في الجسم الحي. لألخص الخصائص المهمة للظهارة التنفسية لوحظت في الجسم الحي، ويمكن استخدام ECS الهوائية الأولية. وبالتالي، كان هدفنا لتحسين أسلوبنا استخدام الأنف ECS (NECS) تم الحصول عليها من متطوعين من البشر. يتم توسيع NECS وتربيتها في المختبر، مما أسفر عن ثقافة نموذج الخلية من NECS متباينة الذي يحاكي العديد من الميزات من الظهارة الأنفية ينظر في الجسم الحي.

الأساس المنطقي

استخدام نماذج في المختبر مع ECS الابتدائي الإنسان في محاكاة الوضع الجسم الحي - كما هو موضح في هذه الدراسة - يعطي إمكانيات فريدة لدراسة الاختلافات مرض معين من ECS، المعلمات الفسيولوجية المرتبطة ظهارة الهوائية، أو التفاعلات بين ECS وأنواع الخلايا الأخرى، مثل الخلايا الجذعية 10، والخلايا القاتلة الطبيعية 11 أو الضامة. العديد من الأساليب القائمة الاستفادة ECS الشعب الهوائية، والتي يمكن الحصول عليها عبر خزعات جراحية فرشاة خلال bronchoscopies، أو خلاف ذلك من التخلص منها أنسجة الرئة 12-17. بالإضافة إلى ذلك، للحصول على مصادر تجارية متباينة تماما الهوائية الإنسان الثقافات الخلايا الظهارية وجود (نموذج EpiAirway من ماتيك، آشلاند، MA، Cloneticsمن ونزا، بازل، سويسرا، MucilAir من Epithelix سارس، جنيف سويسرا)، حيث يمكن للمحققين اختيار من مختلف الجهات المانحة. ومع ذلك، نظرا لمجموعة محدودة من الخلايا الظهارية المتاحة تجاريا، أو مجموعة محدودة من المعلمات المقررة، فإن التكلفة المرتبطة الحصول على تجاريا الهوائية الإنسان الأساسية ECS، ومحدودية فرص الحصول على التخلص من أنسجة الرئة أو التي تم الحصول عليها حديثا الأنسجة الخزعة القصبي الإنسان، وتحظر العديد من المحققين من إجراء دراسات في مجرى الهواء ECS الإنسان متباينة تماما. لذلك، شرعنا في تطوير تقنية من شأنها أن 1) الاستفادة NECS الإنسان الحصول عليها غير جراحية، 2) توفير بروتوكول الغلة ثقافات متباينة ظهارة الهوائية الإنسان، و 3) أن تكون قابلة للتكرار في معظم الإعدادات المختبر مع البنية التحتية القائمة زراعة الأنسجة.

المزايا على تقنيات موجودة / نماذج

الحصول على NECS جديدة، بالمقارنة مع الشعب الهوائية أو الشعب الهوائية الصغيرة ECS، هو أقل بكثير الغازية، الفرديةو يمكن تحتاج فحص عدة مرات مع عدم وجود آثار جانبية كبيرة، ويمكن أن تجرى سطحية الخزعات كشط الأنف في السكان المريضة التي لولاها لم يكن مؤهلا للحصول bronchoscopies البحوث ذات الصلة. موسع الخزعات كشط سطحي للحصول على NECS تسمح المحقق لوضع مواصفات المانحة بداهة، بما في ذلك السن والجنس والحالة المرضية، الخ وفقا لهدف البحث إلى أن يتحقق. وبالتالي، عند تصميم الدراسات البحثية المحققين لا تقتصر من قبل الأنسجة المتوفرة سريريا / عينة الظهارية، وشراء مكلفة متباينة نماذج ثقافة الخلية من الباعة التجارية، أو تصميم الدراسات القصبات الغازية. بالإضافة إلى ذلك، وسهولة الحصول على NECS يزيد من القدرة على إجراء التجارب في الخلايا من مختلف الجهات المانحة، مما يعزز من التحقق من صحة النتائج الإحصائية لوحظ. أخيرا، الأنف هي واحدة من المواقع الأولى أن تتعرض إلى أي نوع من الضغوطات المحمولة جوا. وبالتالي، وتوليد عضوي النمط فيالمختبر أنظمة محاكاة الثقافة الظهارة الأنفية هي مفيدة لدراسة استنشاق الجسيمات الفيروسية، والملوثات، حساسية، أو الغازات، وهو ما يمكن تحقيقه بسهولة باستخدام هذا النظام ثقافة الخلية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد بلاستيك وير: معطف بلايت

  1. إضافة 500 ميكرولتر PureCol (1:100 المخفف بالماء المعقم) إلى كل بئر من لوحة 12 جيدا.
  2. احتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة لمدة 30 دقيقة، وإزالة PureCol وشطف مع HBSS الحق قبل أن يتم إضافة خلايا لوحة (راجع الخطوة 3.1 أدناه).

2. والحصول على خزعة من Pretreating NECS الإنسان

  1. خزعة الأنف كشط
    1. الحصول ECS السطحية المبطنة للالمحارات الأنفية تحت الرؤية المباشرة من خلال 9 ملم قابلة لإعادة الاستخدام منظار الأنف البولي بروبلين (نموذج 22009) على منظار الأذن مع منظار التشغيل (نموذج 21700). يوفر هذا الجهاز التصور الأمثل للالمحارات الأنفية والمرونة في الحركة.
    2. إجراء الخزعات مع موضوع يجلس منتصبا على كرسي مستقيم المدعومة مع إمالة الرأس إلى الخلف قليلا أو الكذب في موقف ضعيف على طاولة الفحص.
    3. إدراج منظار منظار الأذن إلى الأنف وturbi أدنىتصور نيت مع الإضاءة.
    4. إدراج مجرفة بالحرارة معقمة من خلال منظار مع طرف مددت بشكل أقصى إلى الجزء الخلفي من المحارة.
    5. باستخدام ضغط لطيف على سطح السفلي من المحارة، يوجه مجرفة عبر 5X سطح الغشاء المخاطي وتراجع. وسوف استرجاع ناجحة من الخلايا المخاطية التي عقدها عمل شعري يكون واضحا في كوب من مجرفة.
  2. وضع العينة في أنبوب 15 مل المخروطية التي تحتوي على 8 مل من RPMI 1640، نقل على الجليد.
  3. استخدام ملقط لاسترداد التحقيق، طرد الأنسجة من وحيد القرن التحقيق مع ماصة-P 1000، تجاهل التحقيق
  4. أجهزة الطرد المركزي لتكوير (4 ° C، 400 x ج، 5 دقائق)، طاف نضح (انتباه: الحرص على عدم نضح بيليه).
  5. resuspend الكرية في 1 مل BEGM مع 10 ميكرولتر من الدناز 100X 1.
  6. احتضان عند RT لمدة 20 دقيقة.
  7. الطرد المركزي (4 ° C، 400 x ج، 5 دقائق)، لا NOT نضح طاف!

3. Sعيد على خلايا البلاستيك (يوم 0)

  1. إزالة PureCol من لوحة وشطف مع HBSS (انظر أيضا الخطوة 1.2).
  2. إضافة الحد الأدنى من حجم BEGM + + وسائل الاعلام (80-100 ميكرولتر، حتى يظهر الغضروف المفصلي وسائل الإعلام في وسط البئر) في الآبار 1-4 (اعتمادا على حجم خزعة) من لوحة المغلفة.
  3. استخدام ماصة P-1000 لإزالة بعناية بيليه من الأنسجة خزعة من الأنبوب، دون الشفط وسائل الإعلام أكثر من اللازم.
  4. نقل بيليه في منتصف الآبار، والحفاظ على خزعة معا كمجموعة من الخلايا، وليس لتفريق لجعل تعليق خلية واحدة. A غلة خزعة جيدة تصل إلى 4 الآبار التي يمكن المصنف. وضع لوحة في نسيج الثقافة الحاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2،> الرطوبة النسبية 90٪).
  5. تحقق بعد ساعتين للتأكد من أن هناك ما يكفي من وسائل الإعلام (من دون إزعاج الغضروف المفصلي).
  6. Day1، 24 ساعة بعد البذر: جمع كل الخلايا غير ملتصقة من جميع الآبار (لوحة الميل وجمع وسائل الإعلام مع الخلايا في P-1000، جollect جميع الآبار في 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي).
  7. الطرد المركزي (4 ° C، 400 x ج، 5 دقائق).
  8. بينما الطرد المركزي تعليق خلية: إضافة حوالي 250 ميكرولتر من BEGM + + و 250 ميكرولتر من BEGM + خليط سائل الإعلام إلى الخلايا المصنفة في اليوم 0.
  9. كرر الخطوات من 3،1-3،5 للخلايا غير ملتصقة.
  10. يوم 2-5: وسائل الإعلام تغيير الخلايا اليومية، إضافة 500 وسائل الاعلام ميكرولتر إلى كل بئر، والحد من كمية BEGM + + متدرج وسائل الإعلام (اليوم 2 بعد البذر: 125 ميكرولتر BEGM + + بالإضافة إلى 375 ميكرولتر BEGM +، DAY3 بعد البذر والأيام التالية: 73 ميكرولتر BEGM + + بالإضافة إلى 427 ميكرولتر BEGM +).

4. توسيع الخلايا في قوارير

  1. رصد خلايا يوميا؛ بمجرد أن وصلت إلى 80-90٪ confluency (عادة بعد 5-7 أيام من خزعة، إذا كانت تستغرق وقتا أطول فإنها لن تنمو بنجاح) خلايا رفع على النحو التالي: وسائل الإعلام نضح بعناية؛ إضافة 500 ميكرولتر من التربسين 0.25٪ لكل بئر، والاحتفاظ بها في 37 درجة مئوية حتى يتم فصل الخلايا (وعادة ما يستغرق 2-3 دقائق).
  2. إعداد الحاجةحجم الطبعه من فول الصويا التربسين المانع (SBTI) (750 ميكرولتر لكل 1 مل التربسين) في أنبوب 15 مل.
  3. إزاحة الخلايا مرارا وتكرارا من قبل pipetting صعودا وهبوطا في حل التربسين، ونقل خلايا منفصلة في أنبوب مخروطي 15 مل مع SBTI.
  4. شطف جميع الآبار في مجموع مع 1 مل HBSS، إضافة HBSS إلى أنبوب مع الخلايا.
  5. أجهزة الطرد المركزي لتكوير (4 ° C، 400 x ج، 5 دقائق)، ونضح وسائل الإعلام، resuspend في 1 مل BEGM + وسائل الإعلام ودوامة الأنبوب.
  6. توسيع الخلايا في T25 T75 قارورة أو اعتمادا على حجم بيليه (هذا هو P1؛ حوالي بئرين متموجة يذهب إلى واحد قارورة T75، متموجة واحد هو جيدا بما فيه الكفاية لT25 واحد، وعادة ما تسفر 2 الآبار متموجة T75 واحد).
    1. إضافة BEGM + لقوارير (5 مل كل لT75، 3 مل لكل لT25).
    2. إضافة تعليق الخلية إلى القوارير. نقل القوارير إلى حاضنة زراعة الأنسجة.
  7. 24 ساعة بعد قارورة-البذر: إضافة وسائل الاعلام إضافية BEGM + إلى قارورة (3 مل إلى T25، 10 مل إلى T75).
  8. الحفاظ على الخلايا في قوارير: إزالة وسائل الاعلام (نضح من الزاوية) وإضافة BEGM + وسائل الاعلام (5 ml/T25، 20 ml/T75). يحتاج الإعلام إلى تغيير كل 2-3 أيام. الحفاظ على الخلايا في قارورة حتى هم حوالي 80٪ متموجة (قد لا تكون confluency حتى في جميع أنحاء قارورة بأكمله؛ عادة ما يستغرق ما بين هذا 7-10 أيام، وإذا لم يتم متموجة بعد 10 يوما فإنها لن تنمو بنجاح).

5. بذر خلايا في الأنسجة الثقافة إدراجات

  1. إزالة وسائل الإعلام من القارورة وإضافة التربسين (3 مل لT25، T75 4 مل قارورة).
  2. احتضان عند 37 درجة مئوية حتى يتم فصل الخلايا (حوالي 2-3 دقائق).
  3. إعداد SBTI (750 ميكرولتر لكل 1 مل التربسين> 2.25 مل T25، T75 3 مل ل) في أنبوب 15 مل.
  4. إزاحة الخلايا عن طريق تسجيل القارورة وpipetting صعودا وهبوطا، ونقل إلى أنبوب مخروطي مع SBTI.
  5. شطف القارورة مع HBSS (1 مل T25، T75 2 مل ل)، إضافة HBSS إلى أنبوب 15 مل.
  6. أجهزة الطرد المركزيلتكوير (4 ° C، 400 x ج، 5 دقيقة)، وإزالة طاف بعناية.
  7. إعداد لوحات: تحديد كيفية العديد من لوحات ستكون المصنفة، تسمية لوحات مع نموذج التعليمات البرمجية والعدد، عدد مرور (أي P2) والتاريخ. إضافة 700 ميكرولتر BEGM + وسائل الإعلام إلى غرفة القاعدية.
  8. resuspend الكرية خلية في 1 مل سائل الإعلام BEGM ALI من قبل vortexing الأنبوب.
  9. عد الخلايا مع عدادة الكريات (أ T25 عادة ما تنتج حوالي 4 ملايين الخلايا؛ لT75 يمكن أن يصل إلى 20 مليون خلية اعتمادا على جزيرة، واستخدام 1-2000000 الخلايا لمدة 12 لوحة جيدا) وتمييع تعليق الخلية مع وسائل الإعلام BEGM ALI إلى الحجم الكلي اللازم لكمية من لوحات التي ينبغي المصنفة (1.2 × 10 6 خلايا في 2.5 مل سائل الإعلام في لوحة) (ملاحظة: إذا كان جزء من الخلايا تريد أن تكون مجمدة، تسمية أنبوب وإزالة الخلايا هنا: نحن عادة تجميد 2 × 10 6 خلايا في 2 مل من تجميد وسائل الاعلام)
  10. إضافة 200 ميكرولتر تعليق خلية إلى الجانب قمية كل خلية كورنينج 12well غير المصقولإدراج (> هذا سيكون حوالي 80،000-150،000 الخلايا / إدراج؛ 12 ملم مع 0.4 ميكرومتر transwells البوليستر المسام (البولي ايثيلين تيريفثاليت (PET)) إدراج غشاء)؛ نقل في نسيج الثقافة الحاضنة.
  11. بعد 24 ساعة، وتغيير وسائل الإعلام القمي (200 ميكرولتر المتوسطة التوسع).
  12. الحفاظ على الثقافات الخلية: تغيير وسائل الإعلام (BEGM ALI سائل الإعلام؛ 700 ميكرولتر basolateral و200 قمية ميكرولتر) كل يوم. إدراج يجب الحفاظ المغمور حتى الخلايا هي متكدسة تماما (عدم وجود ثقوب في أحادي الطبقة مرئية). اعتمادا على عدد الخلايا هذا عادة ما يستغرق ما بين 2-6 أيام، وإذا كان يستغرق وقتا أطول فإن الخلايا الأرجح لن تكون قابلة للحياة.

6. إنشاء واجهة الهواء السائل مرة واحدة في الخلايا هي مندمج تماما (عندما خلايا في Transwells هي تماما مندمج)

  1. مرة واحدة في الخلايا هي متكدسة تماما تحل محل كل وسائل الإعلام وقمية basolateral مع وسائل الاعلام BEGM ALI تستكمل مع 500nM حمض الريتينويك لمدة 48 ساعة.
  2. 48 ساعة بعد إضافة حمض الريتينويك تستكمل BEGM ALI سائل الإعلام: إعداد PneumaCult-ALI الصيانة متوسطة (تعليمات الشركة التالية و): احسب حجم المتوسطة اللازمة (لوحة واحدة عادة 8.5 مل لمقصورات القاعدية)، ويضاف لكل 1 مل PneumaCult كاملة قاعدة متوسطة :

    10 ميكرولتر PneumaCult 100X الملحق الصيانة
    2 ميكرولتر الهيبارين (من محلول المخزون 2 ملغ / مل)
    5 ميكرولتر هيدروكورتيزون (من محلول المخزون 96 ميكرولتر / مل).

  3. إزالة جميع وسائل الإعلام وإضافة 700 ميكرولتر PneumaCult-ALI سائل الإعلام الصيانة إلى الجانب basolateral فقط (وليس المتوسطة على الجانب القمي).
  4. الحفاظ على مزارع الخلايا لمدة 4 أسابيع في ALI:
    1. تغيير وسائل الإعلام كل يوم (الاثنين والأربعاء والجمعة الجدول الزمني يعمل بشكل جيد بالنسبة لنا).
    2. بعد أسبوع واحد على ALI، مرة واحدة في الأسبوع (الأربعاء) يتم شطف السطح القمي: إضافة 200 ميكرولتر HBSS إلى الجانب القمي، والاحتفاظ بها لمدة 10 دقيقة في الحاضنة، نضح بعنايةHBSS (استخدام 9 في الزجاج ماصة تعلق على فخ الفراغ في خزانة السلامة البيولوجية، واستخدام 200 ميكرولتر نصائح على غيض من ماصة لشفط قبالة HBSS).

ملاحظة: تغيير نصائح بين لوحات، وكذلك تغيير نصائح عند الانتقال من سطح قمية مقابل basolateral. بعد حوالي 2 أسابيع في ALI، تبدأ الخلايا على التمايز وتظهر أهداب. مزارع الخلايا تصل إلى التمايز كامل بعد حوالي 4 أسابيع في ALI.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

مثقف NECS بعد بروتوكول هنا وصفت إعادة التفريق، في طبقة غير متجانسة من ECS يتألف من خلايا مهدبة وغير مهدبة، ويمثل الوضع في الجسم الحي (الشكل 1). بعض NECS المتباينة هي المخاط إنتاج (خلايا تلطيخ في الزرقاء باستخدام AB / PAS، الشكل 1B). على الرغم من أن بروتوكول المعروضة هنا هو الأمثل، ويمكن التفريق تختلف فيما يتعلق بتوزيع السكان الخلية الكلي (أي نسب مختلفة من الخلايا المهدبة: الخلايا المنتجة للمخاط: خلايا غير مهدبة) أو حتى تسفر عن مز...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

توفير ECS الجهاز التنفسي ليس فقط حاجز مادي لحماية جسم الإنسان من مؤثرات خارجية 20، ولكن أيضا بمثابة لوحة مفاتيح لبدء وتنظيم الاستجابات الدفاع المناعي الجهاز التنفسي 1-3 عن طريق إفراز وسطاء للذوبان أو مستقبلات يجند المباشر التفاعلات خلية خلية. من أجل مواصلة دراسة دور ECS في الاستجابة المناعية، لدراسة الخلافات المحتملة بين ECS من السكان المريضة، أو لدراسة آثار الضغوطات الخارجية على ECS، فمن المهم أن ألخص الوضع في الجسم الحي. الشعب الهوائية الإنسان تحتو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

فإن الكتاب أود أن أشكر ليزا دايلي للمدخلات مفيدة.

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (ES013611 وHL095163)، ومضيفات معهد البحوث الطبية (FAMRI)، وكالة حماية البيئة (CR83346301) وتعلن أي تضارب في المصالح. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة. وإن كان قد مولت البحث الموضحة في هذه المقالة في جزء من وكالة حماية البيئة في الولايات المتحدة من خلال التعاون CR83346301 اتفاق مع مركز الطب البيئي والربو وعلم الأحياء الرئة في جامعة نورث كارولينا، تشابل هيل، لم يخضع ل الوكالة نظير المطلوبة واستعراض السياسات وبالتالي لا تعكس بالضرورة وجهة نظر الوكالة، وليس موافقة رسمية يجب أن يكون تفسيره. يذكر سالأسماء التجارية و أو المنتجات التجارية لا يشكل موافقة أو توصية للاستخدام. ويدعم وريتا مولر من قبل مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية بمنحة الشخصية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

BEGM media< / strong >< / td > < TD >
  • 10 & mu ؛ ل حمض الريتينويك (محلول العمل) < / Li >< / ul > < / TD > < TD >
    • خلايا البذر في القارورة (الممر 1 ؛ جزئيا) < / Li >< / Ul > < / TD > < / tr >
< td >< / td > < td >
  • يحافظ على الخلايا في القارورة < / li>< / ul >< / td> < / tr >
< td rowspan = "3" >BEGM ++ وسائط < / strong >< / td > < td >
  • 50 مل Lonza ' s وسائط BEGM مع المكملات الغذائية < / li>< / ul > < / td >
< td >
  • 250 مل BEGM بما في ذلك المكملات الغذائية < / li >< / ul > < / td > < / tr >
< td >
  • 2 مل مستخلص الغدة النخامية البقري (محلول 12.5 مجم / مل) < / li>< / ul> < / td > < / tr>
< td >
  • 75 & mu ؛ ل BSA (محلول 10 مجم / مل) < / ليش>< / ul > < / td > < / tr >
< td rowspan = "5" >< قوي > 200X محلول مخزون هيدروكورتيزون (96 & mu ؛ لتر / مل محل) < / قوي >< / TD > < TD >
  • 200 & ل الهيدروكورتيزون المذاب < / Li > < / TD >
< td >
  • 4250 & mu ؛ ل كلوريد الصوديوم المذاب < / ليثيوم >< / ul >< / TD > < / tr >
< td >
  • 540 & mu ؛ ل ddH2O
 < td > محلول التصفية من خلال 0.22 & mu ؛ مرشح M ، محلول Aliquot وتخزينه عند -20 درجة ؛ C ، تجنب دورات التجميد / الذوبان الإضافية < / td > < / tr > < td rowspan = "3" >PneumaCult-ALI Complete Base Media< / strong>< / TD > < td >
  • 450 مل PneumaCult-ALI Basal Medium < / li>< / ul > < / td > < td >
    • الوسط الأساسي لجميع وسائط PneumaCult-ALI الثلاثة < / li>< / ul >< / td > < / tr >
< td >
  • 50 مل PneumaCult 10x مكمل غذائي < / li>< / ul>< / td > < td >
    • إن وسائط PneumaCult حساسة للضوء ، وبالتالي احتفظ بها دائما في الظلام < / li>< / ul> < / td > < / tr>
< TD> (هذا مستقر لمدة أسبوعين عند 2-8 درجة ؛ C أو لمدة تصل إلى 6 أشهر عند -20 درجة ؛ ج) < / td > < td >< / td > < / tr > < td rowspan = "4" > pneumaCult-ALI Maintenance Medium< / strong>< / td > < td > لكل 1 مل من PneumaCult-ALI Complete Base Medium إضافة: < / td > < td rowspan = "4" > ثقافة ALI على الإدخالات < / td > < / tr > < td >
  • 10 & mu; ل PneumaCult 100x الصيانة< م > الملحق < / li>< / ul>< / td > < / tr >
< td >
  • 2 & mu ؛ ل الهيبارين (من محلول مخزون 2 ملغ/مل)
قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
منظار الأنفWelch AllynModel 220099 مم ، بولي برويلين قابل لإعادة الاستخدام
، منظار الأذن التشغيليWelch AllynModel 21700
كوفيت خلية مسبار وحيدالقرن Arlington ScientificSY-96-092ثني رأس الكوفيت أكثر بقليل
من ألواح الثقافة المكونة من 12 بئر Corning3512
إدراج ثقافة الخلايا الغشائية Transwellقارورة Corning3460
لزراعة الأنسجة Corning430639 و 430641T25 و T75 قارورة تنفيس
RPMI 1640 وسائط (مع L-Glutamine)Gibco11875
نمو الخلايا الظهارية القصبية / القصبة الهوائية تطبيقات الخلايا المتوسطة511-500
BEGM نمو الخلايا الظهارية القصبية المتوسطةLonzaCC-3170يأتي هذا كمجموعة من زجاجة واحدة متوسطة وقوارير مع المكملات الغذائية.
محلول بيكربونات الصوديوم 7.5٪Gibco25080استخدم كما هو.
355104 استخدام NuSerumBD Biosciencesكما هو.
BAMBANKER تجميد الوسائطBAMBANKER302-14681استخدم كما هو.
CoolCell BiocisionHTBCS-136(حاوية تجميد الخلايا الخالية من الكحول CryoPrep)
PureColAdvancedBioMatrix5005-Bتمييع 1: 100 بالماء المعقم (يجب أن يكون حوالي 0.03 مجم / مل) استخدم 500 مو ؛ لتر / بئر من لوحة HBSS ذات 12 بئر
مع Ca2< / sup> و Mg2 + < / sup>Gibco14025
DNAse 1SigmaDN25تذوب عند 1.5 مجم / مل ، وهو محلول 100x ، أضف 10 & mu ؛ ل لكل مل من التربسين وسائل
الإعلام ، 0.25٪ ، 1x ، مع الفينول الأحمرGibco25200-056الاستخدام في ذلك هو
مثبط التربسين من فول الصويا (SBTI)SigmaT6522استخدم المذاب في HBSS بتركيز 1 مجم / مل
حمض الريتينويكسيجماR7632يجعله 100 & mu ؛ محلول مخزون M (انظر أدناه) ، مخفف إلى 10 مو ؛ م مع الكحول المطلق ، خذ 5 مو ؛ ل من هذا وأضفه إلى 1 مل من وسائط BEGM (حل العمل الخاص بنا).

يحتوي الريتينول المتحول بالكامل على معامل انقراض يبلغ 52,480 في الإيثانول عند 325 نانومتر. يذوب 25 مجم في 50 مل من الإيثانول المطلق. يجب إجراء التخفيفات التسلسلية ، وتخفيف 50 مل من المخزون في 450 مل من الإيثانول المطلق ، وأخذ 50 مل من هذا ، وتخفيفه في 450 مل من الإيثانول المطلق ، وأخذ 50 مل من هذا ، وتخفيفه في 450 مل من الإيثانول المطلق ، ومرة أخرى خذ 50 مل من هذا ، وتخفيف 450 مل من الإيثانول المطلق ، خذ 100 مل من هذا وتخفيفه في 900 مل من الإيثانول المطلق واقرأ في مقياس الطيف الضوئي عند 325 نانومتر ، ثم يتم ضرب هذا الرقم في عامل التخفيف ، ثم مقسوما على معامل الانقراض 52,480 ، سيعطي هذا رقما بالملليمتر. اصنع مخزونا بحجم 100 ملي مولار (قم بتخزينه عند -20 درجة ؛ ج) ومن هذا المخزون يتم صنع 10 ملي مولار ، سيكون حمض الريتينويك اليومي المطلوب 5 مل من هذا 10 ملي مولار في 995 مل من وسائط ALI. مثال: قراءة 325 نانومتر هي 1.15. 1.15 × 10,000 (عامل التخفيف) / 52,480 = 0.219 = 219 ملي مولار ، اصنع مخزونا 100 ملي من هذا ، في الإيثانول المطلق.
DMEM نسبة عالية من الجلوكوز (1x) ، سائل ، مع L-glutamine وبيروفات الصوديومGibco11995
مستخلص الغدة النخامية البقريGibco13028-014المستخدمة في وسائط BEGM ALI.
نيستاتينسيجماN4014-50 مجماصنع محلول 3.3 مجم / مل.
ألبومين مصل الأبقارفيشر ScientificBP1600-100اصنع محلولا من محلول 10 مجم / مل في ماء مللي كيو.
PneumaCult-ALI mediaStemCell5001يأتي هذا كمجموعة من زجاجة واحدة من الوسط وقوارير مع المكملات الغذائية. لمزيد من التفاصيل انظر أدناه.
Hydrocortisone StemCell7904قم بإذابة 2.4 مجم من الهيدروكورتيزون في 1 مل ddH 2< / sub>O (يستخدم لصنع محلول مخزون الهيدروكورتيزون 200x) ملح
الصوديوم الهيبارين في PBS (2 مجم / مل)StemCell7980استخدم فيه.
قوارير فلتر (500 مل)كورنينج4310970.22 مو ؛ م حجم المسام
أنابيب الترشيح (50 مل) ميليبورSCGP00525Steriflip ، 0.22 & m حجم المسام
نصائح الماصة - ART Barrier Tipsالمنتجات الحيوية الجزيئية2139RI ، 2069RI ، 2179RI
أنابيب مخروطية ، معقمة ، 15 مل و 50 مل
ddH 2< / sub >O ، الإيثانول المطلق ، ثلج
CO2< / sub> حاضنة
الطرد
خزانة
(P2 ، P200 ، P1000) ، 9 في ماصات
قفازات
معطف مختبر مع أصفاد ضيقة
الوسائط والحلول المستخدمة: < / strong >< / td > < td > وصفة< / strong >< / td > used for < / strong >< / td > < / tr >
  • 500 مل BEGM خلية الوسائط التطبيق مع كمية واحدة من حمض الريتينويك < / li>< / ul > < / td >
(امزجها نصف النصف وقم بالفلف) < / td > < / tr >
  • 500 مل BEGM Lonza مع كمية واحدة من المكملات أحادية الاقتباس < / li>< / ul>< / td >
< ul>
  • هضم الخزعة< / li>< / ul> < / td> < / tr>
    • BEGM + media
    • 50 مل وسائط BEGM < / li>< / ul>< / td>
    • الحفاظ على الخلايا على البلاستيك في الألواح (الممر 0) < / Li >< / ul >< / TD > < / tr >
    • بذر الخلايا الطازجة في صفيحة 12 بئرا على البلاستيك < / li>< / ul > < / td > < / tr>
    • 1 مل ثنائي الكربوهيدرات الصوديوم < / li>< / ul> < / td >
    • الحفاظ على الخلايا في الألواح على البلاستيك (passage0 ؛ جزئيا فقط) < / li>< / ul> < / td > < tr>
    • 2.5 مل NuSerum < / li>< / ul > < / td > < td >
      • خلايا البذر في القارورة (passage1 ؛ جزئيا) < / li>< / ul> < / td > < / tr>
    BEGM ALI media
    • 250 مل DMEM-H < / li>< / ul>< / td>
    • الحفاظ على الخلايا على الواجهة قبل أن تذهب ALI< / li>< / ul> < / td> < / tr >
    • 1 مل Nystatin (محلول 3.3 مجم / مل) < / li>< / ul > < / td > < / tr >
    • كمكمل ل PneumaCult-ALI Complete Base Medium لليوم الأخير في القارورة وعندما تكون الخلايا على إدراج < / li>< / ul > < / td > < / tr >
    • 10 & mu; ل الإيثانول المطلق < / Li >< / ul > < / TD > < / tr >
    • 5 & mu; ل هيدروكورتيزون (من 96 & مو ؛ لتر / مل محلول مخزون) < / ليثيوم >< / ul >< / TD > < / TR > < / tbody > < / table>
    المركزي المبردماصات السلامة البيولوجيةزجاجية< TD Colspan = "4" > < حدود الجدول = "1" > < tbody > < td colspan = "3" > ملاحظة عامة: قم دائما بتسخين الوسائط إلى درجة حرارة الغرفة < / td > < / tr > < td rowspan = "2" >

    المراجع

    1. Swamy, M., Jamora, C., Havran, W., Hayday, A. Epithelial decision makers: in search of the 'epimmunome. Nat. Immunol. 11, 656-665 (2010).
    2. Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. The airway epithelium: soldier in the fight against respiratory viruses. Clin. Microbiol Rev. 24, 210-229 (2011).
    3. Muller, L., Jaspers, I. Epithelial cells, the "switchboard" of respiratory immune defense responses: Effects of air pollutants. Swiss Med. Wkly. , (2012).
    4. Sanders, C. J., Doherty, P. C., Thomas, P. G. Respiratory epithelial cells in innate immunity to influenza virus infection. Cell Tissue Res. 343, 13-21 (2011).
    5. Robertson, M. J. Role of chemokines in the biology of natural killer cells. J. Leukoc. Biol. 71, 173-183 (2002).
    6. Adachi, M., Matsukura, S., Tokunaga, H., Kokubu, F. Expression of cytokines on human bronchial epithelial cells induced by influenza virus. A. Int. Arch. Allergy Immunol. 113, 307-311 (1997).
    7. Borchers, M. T., Harris, N. L., Wesselkamper, S. C., Vitucci, M., Cosman, D. NKG2D ligands are expressed on stressed human airway epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 291, L222-L231 (2006).
    8. Groh, V., et al. Costimulation of CD8alphabeta T cells by NKG2D via engagement by MIC induced on virus-infected cells. Nat. Immunol. 2, 255-260 (2001).
    9. Obeidy, P., Sharland, A. F. NKG2D and its ligands. Int J. Biochem. Cell Biol. 41, 2364-2367 (2009).
    10. Horvath, K. M., Brighton, L. E., Zhang, W., Carson, J. L., Jaspers, I. Epithelial Cells From Smokers Modify Dendritic Cell Responses in the Context of Influenza Infection 1. Am. J. Resp. Cell. , (2010).
    11. Muller, L., Brighton, L. E., Jaspers, I. Ozone exposed epithelial cells modify co-cultured natural killer cells. AJP Lung. , (2013).
    12. Turi, J. L. Oxidative stress activates anion exchange protein 2 and AP-1 in airway epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, 791-798 (2002).
    13. Zimmermann, G. S., Neurohr, C., Villena-Hermoza, H., Hatz, R., Behr, J. Anti-inflammatory effects of antibacterials on human Bronchial epithelial cells. Respir. Res. 10, 89(2009).
    14. Lopez-Souza, N., Avila, P. C., Widdicombe, J. H. Polarized cultures of human airway epithelium from nasal scrapings and bronchial brushings. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 39 (2003), 266-269 (2003).
    15. Gray, T. E., Guzman, K., Davis, C. W., Abdullah, L. H., Nettesheim, P. Mucociliary differentiation of serially passaged normal human tracheobronchial epithelial cells. Am. J. Respir. Cell Mo.l Biol. 14, 104-112 (1996).
    16. Adler, K. B., Schwarz, J. E., Whitcutt, M. J., Wu, R. A New Chamber System for Maintaining Differentiated Guinea-Pig Respiratory Epithelial-Cells between Air and Liquid-Phases. Biotechniques. 5, 462(1987).
    17. Whitcutt, M. J., Adler, K. B., Wu, R. A biphasic chamber system for maintaining polarity of differentiation of cultured respiratory tract epithelial cells. In Vitro Cell. Dev. Biol. 24, 420-428 (1988).
    18. Jaspers, I. Reduced expression of IRF7 in nasal epithelial cells from smokers after infection with influenza. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 43, 368-375 (2010).
    19. Muller, L., Brighton, L. E., Jaspers, I. Ozone exposed epithelial cells modify cocultured natural killer cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 304, 332-341 (2013).
    20. Ochs, M., Weibel, E. R. Fishman's Pulmoary Diseases and Disorders. Fishmanetal, A. P., et al. 4, Mc Graw Hill. New York, NY. 23-69 (2008).
    21. Kesic, M. J., Meyer, M., Bauer, R., Jaspers, I. Exposure to Ozone Modulates Human Airway Protease/Antiprotease Balance Contributing to Increased Influenza A Infection. PLoS ONE. 7, e35108(2012).
    22. Jaspers, I. Diesel exhaust enhances influenza virus infections in respiratory epithelial cells. Toxicol. Sci. 85, 990-1002 (2005).
    23. Jaspers, I., Flescher, E., Chen, L. C. Ozone-induced IL-8 expression and transcription factor binding in respiratory epithelial cells. Am. J. Physiol. 272, L504-L511 (1997).
    24. Blume, C., et al. Barrier responses of human bronchial epithelial cells to grass pollen exposure. Eur. Respir. J. , (2012).
    25. Bauer, R. N. Influenza enhances caspase-1 in bronchial epithelial cells from asthmatic volunteers and is associated with pathogenesis. J. Allergy Clin. Immunol. 130, 958-967 (2012).
    26. Ostrowski, L. E., Stewart, D., Hazucha, M. Interferon gamma stimulates accumulation of gas phase nitric oxide in differentiated cultures of normal and cystic fibrosis airway epithelial cells. Lung. 190, 563-571 (2012).
    27. Jardim, M. J., Fry, R. C., Jaspers, I., Dailey, L., Diaz-Sanchez, D. Disruption of microRNA expression in human airway cells by diesel exhaust particles is linked to tumorigenesis-associated pathways. Environ. Health Perspect. 117, 1745-1751 (2009).
    28. Horvath, K. M., Brighton, L. E., Herbst, M., Noah, T. L., Jaspers, I. Live Attenuated Influenza Virus (LAIV) induces different mucosal T cell function in nonsmokers and smokers. Clin. Immunol. 142, 232-236 (2012).
    29. Horvath, K. M. Nasal lavage natural killer cell function is suppressed in smokers after live attenuated influenza virus. Respir. Res. 12, 102(2011).
    30. Noah, T. L. Tobacco smoke exposure and altered nasal responses to live attenuated influenza virus. Environ. Health Perspect. 119, 78-83 (2011).

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    إعادة الطباعة والأذونات

    استكشف المزيد من المقالات

    مزارع الواجهة الجوية والسائلةوحواضن المزارع الخلويةوأطباق زراعة الأنسجةوخزعة كشط الأنفووسط BEGM Plusواستزراع Transwellوالتمايز المخاطي الهدبيوبصمة ويسترن.
    زراعة خلايا الإنسان الظهارية الأنف في واجهة الهواء السائل
    تواصل معنا
    أوصِ به للمكتبة

    الخصوصية

    شروط الاستخدام

    السياسات

    حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.