Method Article

منهج في التثقيف الجنينية C. ايليجانس خلايا

DOI:

10.3791/50649

⸱

September 21st, 2013

 , 
1Department of Physiology and Biophysics, University of Miami

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن هنا وصف البروتوكول المنقح للثقافة واسعة النطاق من الجنينية C. ايليجانس الخلايا. الجنينية C. ايليجانس الخلايا المستزرعة في المختبر باستخدام هذا الأسلوب، ويبدو أن التفريق وألخص التعبير عن الجينات بطريقة معينة من الخلايا. التقنيات التي تتطلب الوصول المباشر إلى الخلايا أو عزل أنواع معينة من الخلايا من الأنسجة الأخرى يمكن تطبيقها على C. ايليجانس الخلايا المستزرعة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. ايليجانس هو نظام نموذجي قوية، حيث التقنيات الوراثية الجزيئية وقابلة للتطبيق بسهولة. حتى وقت قريب على الرغم من التقنيات التي تتطلب الوصول المباشر إلى الخلايا وعزل أنواع معينة من الخلايا، لا يمكن تطبيقها في C. ايليجانس. وكان يرجع ذلك إلى حقيقة أن تقتصر الأنسجة داخل بشرة الضغط الذي لا يهضم بسهولة عن طريق العلاج مع الانزيمات و / أو المنظفات هذا القيد. على أساس العمل الرائد في وقت مبكر عن طريق ليرد بلوم، كريستنسن وزملاؤه 1 وضعت طريقة قوية لزراعة C. ايليجانس الخلايا الجنينية في نطاق واسع. يتم عزل البيض من البالغين حامل عن طريق العلاج مع التبييض / هيدروكسيد الصوديوم وعلاجها في وقت لاحق مع كيتيناز لإزالة قشر البيض. ثم يتم فصل الخلايا الجنينية من قبل pipetting اليدوي ومطلي على الزجاج المغطاة الركيزة في وسائل الإعلام التخصيب المصل. في غضون 24 ساعة من زنازين العزل تبدأ في التفريق عن طريق تغيير التشكل وبالإعراب عن MARKE خلية معينةروبية. C. ايليجانس الخلايا مثقف باستخدام هذا الأسلوب البقاء على قيد الحياة لمدة تصل 2 أسابيع في المختبر، وكانت تستخدم للالكهربية، immunochemical، ويحلل التصوير، فضلا عن أنها تم فرزها واستخدامها لالتنميط ميكروأري.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

انواع معينة ايليجانس (C. ايليجانس) هو كائن نموذج قوي للتحقيق الأسس الجزيئية وظيفة الخلوية، والتمايز، والسلوك. بينما في الجينوم، الأيض، المسارات البنائية تشبه الفقاريات '، قابلية الإستطراق الوراثية والجزيئية التي هي أكبر بكثير 2. بين مزاياه وحجمها والتشريح بسيطة، ودورة الحياة السريع (3 أيام في 25 درجة مئوية)، فترة حياة قصيرة (2 أسابيع)، وعدد كبير من ذرية (> 200). نظرا لطبيعتها خنثوي ودورة حياة قصيرة، التلاعب الجزيئية والجينية هي واضحة في C. ايليجانس، بما في ذلك جيل من الحيوانات المعدلة وراثيا 3،4 وتطبيق تقنيات الجينات تدق إلى أسفل مثل تدخل الحمض النووي الريبي 5. C. الجسم ايليجانس وقشر البيض هي شفافة. لذا الخلايا يمكن تصور بسهولة في كل من الكبار والجنين باستخدام المجهر القياسية. في السنوات ال 40 الماضية، وC. ايليجانس وقد خلق مجتمع الموارد لا تقدر بثمن لC. البحث ايليجانس بما في ذلك مجموعة كبيرة من المسوخ، وبالضربة القاضية المعدلة وراثيا، وصفا مفصلا لعلم التشريح والتنمية 6،7، بما في ذلك إعادة كاملة للجهاز العصبي 8، والجينوم التسلسل تماما وهو مشروح بشكل جيد ومتاحة للمجتمع بأكمله ( www.wormbase.com ).

على الرغم من العديد من المزايا، وبعض المناهج التجريبية تم تحدي في C. ايليجانس. وتشمل هذه تلك التي تتطلب الوصول إلى غشاء البلازما من الخلايا والأنسجة أو عزل أنواع الخلايا. في الواقع C. تقتصر الأنسجة ايليجانس داخل هيكل عظمي الهيدروستاتيكي الضغط، والتي لا يتم هضمها بسهولة عن طريق العلاج الأنزيمية أو المنظفات. في نهاية 1990s ميريام غودمان وجانيت ريتشموند رائدة أساليب التسجيلات الكهربية من C. ايليجانسالخلايا العصبية والخلايا العضلية في الموقع 9،10. في حين أن هذه الأساليب قدم لنا معلومات هامة عن العصبية وظيفة العضلات في الجسم الحي، فهي صعبة وانخفاض الإنتاجية. وقد وضعت وسائل بديلة لدراسة وظيفة الخلايا في الجسم الحي، ومعظمهم لا سيما في مجال التصوير الكالسيوم الجسم الحي باستخدام أجهزة استشعار الكالسيوم مشفرة وراثيا مثل GCamP وCAMELEON 11-13. على الرغم من هذه الأساليب، لا تسمح باستخدام أدوات الدوائية لأنها تطبق على الحيوانات الحية سليمة.

المحاولة الأولى في زراعة C. وقدم الخلايا ايليجانس في المختبر في نطاق واسع من قبل ليرد بلوم أثناء إعداد أطروحة الدكتوراه 14. للأسف، واجه صعوبات مع التصاق الفقراء من الخلايا إلى الركيزة، وسوء تمايز الخلايا والبقاء على قيد الحياة حالت دون قيام هذا البروتوكول في وقت مبكر باعتبارها طريقة قوية ثقافة الخلية. في عام 1995 نشرت إدغار وزملاؤه إجراءللتحقيق في انقسام الخلايا والتشكل من خلال العزلة وثقافة C واحد. ايليجانس أجنة 15. الخلايا الجنينية التي حصل عليها الهضم من قشر البيض مع مزيج من العلاج الأنزيمية والتفكك دليل، واصلت لتتكاثر، وتنتج ما يصل الى 500 ~ 15 الخلايا. في وقت لاحق، ليونج وزملاء العمل مثقف أعداد صغيرة من لدراسة التشكل عن Blastomeres المعوية. أنها أظهرت أن واحدا في المختبر معزولة E قسيم أرومي إنتاج الخلايا المعوية الاستقطاب التي خلقت بنية مشابهة لمعة الأمعاء من خلال التفاعل مع بعضهم البعض من خلال تقاطعات الملتصقة القمي 16. كما ذكرت بخنر وزملاؤه طريقة مماثلة لزراعة C. ايليجانس الخلايا الجنينية في المختبر 17.

على أساس هذا العمل في وقت مبكر، وضعت كريستنسن وزملاؤه بروتوكول قوية لزراعة الجنينية C. ايليجانس الخلايا في المختبر 1. همأظهرت أن معزولة C. ايليجانس الخلايا يمكن أن تفرق في أنواع الخلايا المختلفة، والمحافظة على الميزات التي يمتلكها في الجسم الحي، بما في ذلك التعبير عن علامات خلية محددة. العديد من التقنيات التي تشكل تحديا في الجسم الحي، ويمكن تطبيقها على معزولة C. ايليجانس الخلايا الجنينية. وتشمل هذه الكهربية 1،18 19، والتصوير، وتقنيات immunochemical 20،21، وكذلك عزل أنواع معينة من الخلايا عن طريق خلية نيون المنشط الفرز (FACS) لبناء مكتبات [كدنا] خلية محددة 22،23. تقنيات الجينات ضربة قاضية مثل تدخل الحمض النووي الريبي (رني) يمكن تطبيقها على مثقف C. ايليجانس الخلايا 1 ورواية أسلوب وضع العلامات الأيضية باستخدام Azido السكر كأداة لاكتشاف بروتين سكري تم تطويرها مؤخرا للمثقف في المختبر C. ايليجانس الخلايا 24.

في الختام، يوسع طريقة زراعة الخلايا المصفوفة ستقنيات و التي يمكن تطبيقها على C. ايليجانس نموذج في محاولة فك وظيفة الجين في سياق كائن حي. نحن هنا وصف بروتوكول لزراعة C. ايليجانس الخلايا الجنينية في المختبر، والتي تقوم أساسا على البروتوكول وصف لأول مرة من قبل كريستيانسن و1 الزملاء.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العلامات النجمية (*) تشير إلى خطوات جديدة أو معدلة بالمقارنة مع كريستنسن وآخرون. 1

1. إعداد المواد

  1. يتطلب إجراء زراعة الخلايا كميات كبيرة من البيض معزولة عن البالغين حامل. تنمو C. ايليجانس على 8P لوحات أجار المصنف مع NA22 (المتاحة من خلال كونسورتيوم الوراثية C. ايليجانس - CGC) لعزل البكتيريا كميات كبيرة من البيض. في هذه اللوحات كمية ببتون المستخدمة هي 8 أضعاف المبلغ الذي يستخدم عادة لوحات NGM. تركيز أعلى ببتون يحافظ على نمو البكتيريا NA22 أكثر كفاءة، والتي تتعارض مع OP50، تنمو في طبقات سميكة.

8P لوحات وصفة:

حل 3 غرام كلوريد الصوديوم، 20 غراما Bacto-ببتون، 25 غراما أجار في 1 لتر من الماء المعقم المقطر والأوتوكلاف لمدة 30 دقيقة. اسمحوا بارد في المتوسط ​​55 درجة مئوية ثم قم بإضافة تصفيتها العقيمة-1 مل من الكولسترول (5 ملغ / مل في ETOH)، 1 مل من 1 MgCl 2، 1 مل من MgSO 4 و 25 مل من العازلة KP (الأسهم من 500 مل: 5 ز K 2 هبو 4، 30 غ KH 2 PO 4، ودرجة الحموضة 6.00). صب السائل أجار المتوسطة إلى 10 سم أطباق بتري (25 مل / لوحة).

  1. نشر في اليوم التالي السطح كله من كل المخصب ببتون وحة آغار مع 1 مل من NA22 E. القولونية بين عشية وضحاها مثقف في وسائل الإعلام 2XYT (16 ز تريبتون، استخراج 10 ز الخميرة، 5 ز كلوريد الصوديوم في 1 لتر من الماء المعقم، ودرجة الحموضة 7.0) في 37 درجة مئوية. تشكل هذه البكتيريا مصدر الغذاء وفيرة من شأنها أن تشكل طبقة سميكة دعم نمو كميات كبيرة من البالغين حامل. ترك لوحات المصنف بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة للسماح نمو البكتيريا. ويمكن تسريع هذه العملية عن طريق الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 4-5 ساعة.
  2. نقل الحيوانات جوعا حتى المصنفة 8P لوحات. غسل الحيوانات قبالة لوحة NGM جوعا باستخدام 5-6 مل من العازلة M9 أو الماء وإضافة 1-2 مل من هذا التعليق على كل لوحة 8P.
  3. تسمح بنمو وتكاثر الحيوانات الاتحاد الوطني للعماليتم ملؤها ايل لوحات في التقاء قبل الكبار حامل.
  4. عزل البيض اللازمة لإعداد C. ايليجانس الخلايا الجنينية، من البالغين حامل باستخدام 5-6 مل من محلول تحلل.

حل تحلل وصفة

5 مل من الطازجة بليتش، 1.25 مل من هيدروكسيد الصوديوم 10 N و 18.5 مل من H 2 O. العقيمة يجب أن يكون مستعدا هذا الخليط الطازجة قبل كل استعمال.

  1. غسل البيض معزولة عن البالغين باستخدام حامل البيض العازلة:

العازلة البيض وصفة

118 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 48 ملي بوكل، 2 مم CaCl 2، 2 مم MgCl 2، 25 ملي Hepes، ودرجة الحموضة 7.3، الأسمولية 340 الميلي أسمول.

  1. إزالة قشر البيض الذي يحيط البيض عن طريق العلاج مع كيتيناز. كيتيناز هو انزيم مع أعلى نشاط في الرقم الهيدروجيني الحمضية 25. حل كيتيناز (سيغما، كتالوج رقم C6137) في البيض العازلة درجة الحموضة 6.5 عند تركيز النهائي من 2 ملغ / مل. تخزين الأسهم كيتينازالحل في -20 درجة مئوية في 1 مل مأخوذة في معقم 15 مل أنابيب مخروطية. ويمكن تخزين aliquots في -20 درجة مئوية تصل إلى بضعة أشهر.
  2. تنمو C. ايليجانس الخلايا المستزرعة coverslips على تعقيمها (12 مم) مغطاة الفول السوداني كتين. حل الفول السوداني كتين في الماء المعقم (0.5 ملغ / مل). لا ينبغي أن تتم تصفيته الفول السوداني حل كتين أو تعقيمها. كما أنها لا تحتاج إلى أن تعامل مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية. مخزن 2 مل aliquots في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
  3. كاملة مستنبت الخلية (500 مل) يحتوي على 500 مل L-15 مستنبت من GIBCO، 50 مل مصل بقري جنيني (الحرارة المعطل)، 7.7 غرام السكروز (45 الميلي أسمول)، 5 مل من 100 U / مل البنسلين و100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين (2٪). ثم يتم تصفية المتوسطة كاملة باستخدام فلتر المسام 0.20 ميكرون.

لاحظ أن المخزن المؤقت البيض ومستنبت لها الأسمولية من 340 و 345 على التوالي الميلي أسمول. في الواقع، خلافا للخلايا الثدييات، C. الخلايا ايليجانس ديك الأسمولية عالية نسبياالتي تحتاج إلى أن تؤخذ في العد عند إعداد الحلول التي سوف تأتي في اتصال مباشر مع غشاء البلازما من الخلايا. تم تعديل وصفات من هذه الكواشف للوصول إلى الأسمولية المطلوب، الذي يقاس باستخدام مقياس التناضح 1. فإنه ليس من الضروري استخدام مقياس التناضح إذا تم اتباع هذه الوصفات بالضبط ويتم استخدام الرعاية في إعداد هذه الكواشف. ومع ذلك، ينبغي للمرء أن استخدام osmoter إذا كان بحاجة إلى حلول أخرى لتكون مستعدة، التي لا يتم الإبلاغ عن وصفات هنا أو في أي من المطبوعات التي تستخدم C. ايليجانس الخلايا المستزرعة.

2. عزل البيض

  1. فمن المستحسن أن تبدأ مع أربعة 8P على الأقل لوحات لجمع ما يكفي من البيض لمدة 12 بئرا من الخلايا المستزرعة (في 24 لوحات جيدة).
  2. قبل البدء مع الإجراء ذوبان الجليد أنبوب واحد من محلول الفول السوداني الأسهم كتين. وضع coverslips تعقيمها في الجزء السفلي من الآبار في 24 لوحة جيدا وإضافة 200 ميكرولتر من الفول السوداني لكتين لل coverslips. احتضان لمدة 1 ساعة أو شntil الخلايا جاهزة للمطلي. إزالة تماما كتين الفول السوداني ويغسل مرة واحدة مع الآبار 1 مل من الماء المعقم تعقيمها. الاستئصال الكامل للكتين الفول السوداني من لل coverslips أمر ضروري لتجنب تراكمها الخلية.
  3. غسل البالغين حامل قبالة لوحات أجار تعقيمها باستخدام الماء المعقم. جمع التعليق إلى قسمين العقيمة المخروطية أنبوب 50 مل. ترك الأنابيب على الجليد لمدة تصل إلى 5 دقائق للسماح للترسيب الديدان في الجزء السفلي من الأنابيب (*). إزالة المياه مع ماصة نقل البلاستيك واستبدالها بالماء تعقيمها العقيمة الطازجة. بيليه الديدان حسب الجدول بين كبار الطرد المركزي في 200 x ج (~ 1،200 دورة في الدقيقة) لمدة 10 دقيقة (*). كرر هذه الخطوة الأخيرة على الأقل 3.
  4. نقل الديدان الى العقيمة 15 مل أنبوب مخروطي وبيليه لهم في 200 x ج (~ 1،200 دورة في الدقيقة) لمدة 10 دقيقة (*). لا تستخدم أعلى سرعة الطرد المركزي لتجنب جمع البكتيريا في الجزء السفلي من الأنبوب كذلك. أحيانا بعد centrifugations لا مكعبات الديدان تماما. بالعربيةثالثا كل غسل وقبل إزالة طاف، ووضع الأنابيب لمدة 5 دقائق على الجليد. في مبرد المياه الديدان يعجل في الجزء السفلي من الأنبوب.
  5. إزالة الماء وإضافة 5-6 مل من محلول تحلل (انظر ضبط المواد متابعة). صخرة تعليق بلطف لمدة 5-10 دقائق ثم تبدأ رصد دودة تحلل تحت stereomicroscope كل 2-3 دقائق. يمكن وضع قطرة من التعليق أيضا على ساترة لتسهيل التفتيش. فترة حضانة تختلف تبعا لنضارة التبييض، شراء زجاجات صغيرة من التبييض وفتح زجاجة جديدة كل شهر.
  6. عندما يتم ~ هي lysed 70-80٪ من الديدان (10 دقيقة من بداية الحضانة)، ووقف رد فعل تحلل بإضافة 9 مل من البيض العازلة درجة الحموضة 7.3 (انظر ضبط المواد متابعة). الطرد المركزي تعليق في 200 x ج (~ 1،200 دورة في الدقيقة) لمدة 10 دقيقة. من هذه النقطة لديك ناسخ بنسن على، على مقاعد البدلاء لمنع إعادة التلوث من البيض (*).
  7. إزالة بعناية طاف باستخدام ماصة معقمة نقل البلاستيك وغسل بيليه 3-4س مع العازلة البيض حتى الحل واضح. تأكد من أن يمزج جيدا بيليه في المخزن المؤقت البيض أثناء كل غسل.
  8. يتم فصل البيض من جثث الحيوانات باستخدام 30٪ محلول السكروز. resuspend وبيليه في 2 مل من العازلة بيضة معقمة وإضافة 2 مل من 60٪ محلول السكروز (الأسهم في المخزن بيضة معقمة). تخلط جيدا وأجهزة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 200 x ج (~ 1،200 دورة في الدقيقة) (*).
  9. إزالة بعناية من أنابيب الطرد المركزي. البيض تطفو في الجزء العلوي من الحل. باستخدام pipettor P1000 ونصائح عقيمة، ونقل عن البيض الطازج في 15 مل العقيمة أنبوب مخروطي.
  10. إضافة 10 مل من العازلة البيض العقيمة في أنبوب والطرد المركزي في 200 x ج (~ 1،200 دورة في الدقيقة) لمدة 10 دقيقة. تكرار غسل 3 ×. تأكد من معلق البيض تماما في المخزن المؤقت البيض أثناء كل غسل.

3. خلايا الجنينية التفكك

إجراء الخطوات التالية من الإجراء تحت ظروف معقمة باستخدام غطاء تدفق الصفحي. بينما الحيواناتثوب على البكتيريا لوحات، ويغسل والعلاج مع الحل تحلل تحتوي على مواد التبييض يجب القضاء على معظم إن لم يكن كل البكتيريا. وبالتالي استخدام غطاء الصفحي في هذه المرحلة من الإجراء يمنع تلوث جديدة لتعليق البيض.

  1. في resuspend مكعبات البيض في 1 مل من 2 ملغ / مل كيتيناز (الأسهم في البيض العازلة درجة الحموضة 6.5 (*)) ونقلها إلى العقيمة 15 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد. موسيقى الروك في أنبوب لمدة 10-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. فترة حضانة بالضبط يتغير وفقا لنضارة الإنزيم ودرجة حرارة الغرفة، ولذا ينبغي أن تحدد لكل إعداد. فمن المستحسن لبدء مراقبة البيض تحت المجهر مقلوب خلية الثقافة بعد 10 دقيقة من الحضانة. ملاحظة: في تجربتنا، وانخفاض الرقم الهيدروجيني يزيد من النشاط الأنزيمي كيتيناز. لهذا السبب نستخدم العازلة البيض في درجة الحموضة 6.5 حل كيتيناز (وصفة ذكرت أعلاه، حيث يتم ضبط درجة الحموضة إلى 6.5 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم).
  2. عندما يتم هضمها ~ 80٪ من البيض من قبلالعلاج كيتيناز (الشكلان 1 AB)، بيليه البيض بواسطة الطرد المركزي في 900 x ج (~ 2،500 دورة في الدقيقة) لمدة 3 دقائق (*). باستخدام pipettor P1000 ونصائح عقيمة، وإزالة بعناية طاف وإضافة 3 مل من L-15 متوسطة (*).
  3. نقل البيض في طبق قطره 6 سم وفصل بلطف الخلايا باستخدام محقنة معقمة 10 مل مزودة إبرة G 18. رصد درجة التفكك عن طريق وضع قطرة من تعليق في البلاستيك طبق بيتري الطازجة وعن طريق عرض تحت المجهر. لا نضح الهواء في حقنة خلال هذا الإجراء لتجنب الخلايا الضارة. تواصل التفكك حتى يتم فصلها ~ 80٪ من الخلايا.
  4. تحديد التعليق باستخدام العقيمة 5 ميكرون ميليبور التصفية. يجب أن تتم تصفيته تعليق خلية من أجل إزالة كتل الخلايا والبيض واليرقات عسر الهضم. تصفية 4-5 مل إضافية من جديد L-15 وسائل الإعلام من خلال تصفية لاسترداد جميع الخلايا. لا تستخدم القوة المفرطة أثناء خطوة الترشيح لتجنب داmaging مرشح و / أو الخلايا.

4. زراعة خلايا

  1. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في فصلها 900 x ج (~ 2،500 دورة في الدقيقة) لمدة 3 دقائق (*). باستخدام pipettor P1000 ونصائح عقيمة إزالة بعناية طاف جميع. resuspend الخلايا مكعبات كاملة في L-15 لوحة متوسطة و1 مل / جيد. مبلغ المتوسطة أضاف يعتمد على عدد من لوحات 8P المستخدمة، والتقاء الديدان على لوحات، ونوع التجارب التي سوف يتم تنفيذها على الخلايا. يمكن تحديد كثافة الخلية باستخدام عدادة الكريات. للحصول على تسجيلات التصحيح، المشبك تصفيح كثافة ~ 230،000 خلية / سم 2 هو الأمثل.
  2. الحفاظ على لوحة 24 بئرا في وعاء تثبرور بلاستيكية تحتوي على مناشف ورقية مبللة لتجنب التبخر من مستنبت. تخزين الحاويات في حاضنة ترطيب عند 20 درجة مئوية والهواء المحيط.
  3. وعادة ما تكون الخلايا جاهزة للتجارب في غضون 24 ساعة عندما تمايز المورفولوجية وصريحةايون من علامات GFP كاملة. يمكن أن تظل الخلايا في الثقافة لمدة تصل الى 2 أسابيع ولكنها عادة ما تكون أكثر صحية تصل إلى 7-9 أيام بعد الطلاء. المتوسط ​​يحتاج إلى استبداله مرة واحدة يوميا للحفاظ على الخلايا السليمة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. ايليجانس الخلايا المستزرعة والتفريق خلية صريحة علامات محددة

أظهرت كريستنسن وزملاؤه باستخدام تلطيخ التريبان الأزرق أن> 99٪ من الجنينية C. الخلايا ايليجانس تنجو من إجراء العزل. في يوم 9 و 22 بعد الطلاء، 85٪ و 65٪ على التوالي لا تزال على قيد الحياة 1. معزولة الجنينية C. الخلايا ايليجانس يجب أن تلتزم ركيزة من أجل التفريق. الخلايا التي تفشل في الالتزام كتل الش...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. ايليجانس هو كائن نموذج فك رموز قوية لمسارات الجينية التي تساهم في التنمية والسلوك والشيخوخة. يلائمها ينبع في المقام الأول من السهولة التي يمكن التلاعب بها وراثيا ومن دورة حياة قصيرة. على الرغم يلائمها، C. ايليجانس لها حدودها. C. الخلايا ايليجانس ضئيلة ومحصورة ضمن بشرة الضغط التي تحد من تطبيق الأساليب التي تتطلب الوصول المباشر إلى الخلايا، مثل تقنيات الكهربية والدوائية، أو العزلة من أنواع معينة من الخلايا، مثل الشخصى الجينات التعبير من خلال تح...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
REAGENTS< / strong>
Bacto PeptoneVWR International Inc.90000-382
Difco Agar GranulatedVWR International Inc.90000-784
باكتو التريبتونVWR الدولية90000-284
مستخلص الخميرة باكتوVWR الدولية Inc.90000-724
Leibovitz's L-15 متوسط (1x) سائلInvitrogen11415-064
مصل الأبقار الجنينيInvitrogen16140-063
البنسلين الستربتومايسينسيجماP4333-100ML
كيتيناز من Streptomyces GriseusSigmaC6137-25UN
NA22 الإشريكية القولونية< / em>Caenorhabditis< / em> مركز
الفول السوداني ليكتينسيجماL0881-10MG
السكروزسيجما57903-1KG
D- (+) الجلوكوزسيجما67528-1KG
الإيثيلين جلايكول مكرر (2-amin &# 8211 ؛ ثيليثير) ، N ، N ، N '، N'- حمض رباعي الحمض (EGTA)سيجماE0396-25G
هيبسسيجماH3375-500G
كوليسترول
كلوريد الصوديومسيجما57653-1 كجم
KClسيجماP9333-500G
CaCl 2< / sub>SigmaC1016-500G
MgCl2SigmaM8266-100G
MgSO4SigmaM2643-500 g
K2HPO4SigmaP2222-500G
KH2PO4SigmaP9791-500G
NaOHSigmaS8045-500G
KOHSigmaP1767-500G
الإيثانول
المعقم المقطر H2< / sub>O
Bleach
< قوي> المعدات < / قوي>
101-1000 & ل أزرق متدرج ماصة معطرالولايات المتحدة الأمريكية1111-2821
10 مل معقمة معقمة ملفوفة بشكل فرديالولايات المتحدة الأمريكية المعطرة1071-0810
حجم متغير مريح (100-1000 مو ؛ ل) ماصة مع طردVWR International Inc.89079-974
مساعد ماصة محمول ، شركة دروموندVWR الدولية53498-103
نقل البلاستيك معقمةVWR الدولية Inc.14670-114
15 مل أنبوب مخروطي الولايات المتحدة الأمريكية عطري1475-1611
50 مل أنبوب مخروطيالولايات المتحدة الأمريكية عطري1500-1811
معقم 18 مقياس إبربيكتون وديكنسون وشركاه305196
محاقن معقمة 10 ملبيكتون وديكنسون وشركاه.305482
مرشحات حقنة بلاستيكية Corning 0،20 & mu ؛ م حجم المسام Corning431224
Acrodic 25 مم مرشح حقنة ث / 5 & م versapor غشاءVWR الدولية Inc.28144-095
60x15 مم طبق بتري معقمVWR International Inc.82050-548
100x15 مم طبق بتري معقمVWR International Inc.82050-912
12 ملم قطر الزجاج أغطيةVWR الدولية Inc.48300-560
لوحات ثقافة الخلايا الشفافة 24 قاع مسطح بئر مع غطاء توماس العلمي6902A09
دومون # 5- العلوم الدقيقةالدقيقة 11254-20
جهاز طرد مركزي 5702Eppendorf022629883
غطاء التدفق
مجهر مقلوب مع هدف
ترطيب الهواء المحيط
علم الوراثة طرف أدوات بالملقط الصفحي x10حاضنة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33, 503-514 (2002).
  2. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. elegans II. , (1997).
  3. Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Molecular and cellular biology. 5, 3484-3496 (1985).
  4. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO journal. 10, 3959-3970 (1991).
  5. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  6. Sulston, J. E., White, J. G. Regulation and cell autonomy during postembryonic development of Caenorhabditis elegans. Developmental biology. 78, 577-597 (1980).
  7. Chalfie, M. Caenorhabditis elegans development. Current opinion in cell biology. 1, 1122-1126 (1989).
  8. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 314, 1-340 (1986).
  9. Goodman, M. B., Hall, D. H., Avery, L., Lockery, S. R. Active currents regulate sensitivity and dynamic range in C. elegans neurons. Neuron. 20, 763-772 (1998).
  10. Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature. 2, 791-797 (1038).
  11. Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim, R., Tsien, R. Y. Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 2135-2140 (1999).
  12. Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
  13. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature. 19, 137-141 (2001).
  14. Bloom, L. Genetic and molecular analysis of genes required for axon outgrowth in Caenorhabditis elegans. , (1993).
  15. Edgar, L. G. Blastomere culture and analysis. Methods in cell biology. 48, 303-321 (1995).
  16. Leung, B., Hermann, G. J., Priess, J. R. Organogenesis of the Caenorhabditis elegans intestine. Developmental biology. 216, 114-134 (1999).
  17. Buechner, M., Hall, D. H., Bhatt, H., Hedgecock, E. M. Cystic canal mutants in Caenorhabditis elegans are defective in the apical membrane domain of the renal (excretory) cell. Developmental biology. 214, 227-241 (1999).
  18. Suzuki, H., et al. In vivo imaging of C. elegans mechanosensory neurons demonstrates a specific role for the MEC-4 channel in the process of gentle touch sensation. Neuron. 39, 1005-1017 (2003).
  19. Carvelli, L., McDonald, P. W., Blakely, R. D., Defelice, L. J. Dopamine transporters depolarize neurons by a channel mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 16046-16051 (2004).
  20. Bianchi, L., et al. The neurotoxic MEC-4(d) DEG/ENaC sodium channel conducts calcium: implications for necrosis initiation. Nature. 7, 1337-1344 (2004).
  21. Frokjaer-Jensen, C., et al. Effects of voltage-gated calcium channel subunit genes on calcium influx in cultured C. elegans mechanosensory neurons. Journal of neurobiology. 66, 1125-1139 (2006).
  22. Von Stetina, S. E., et al. Cell-specific microarray profiling experiments reveal a comprehensive picture of gene expression in the C. elegans nervous system. Genome biology. 8, R135(2007).
  23. Fox, R. M., et al. A gene expression fingerprint of C. elegans embryonic motor neurons. BMC genomics. 6, 42(2005).
  24. Burnham-Marusich, A. R., et al. Metabolic Labeling of Caenorhabditis elegans Primary Embryonic Cells with Azido-Sugars as a Tool for Glycoprotein Discovery. PloS one. 7, e49020(2012).
  25. Kim, K. J., Yang, Y. J., Kim, J. G. Purification and characterization of chitinase from Streptomyces sp. M-20. Journal of biochemistry and molecular biology. 36, 185-189 (2003).
  26. Chalfie, M., Wolinsky, E. The identification and suppression of inherited neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Nature. 345, 410-416 (1990).
  27. Parpura, V. Voltage-gated calcium channel types in cultured C. elegans CEPsh glial cells. Cell calcium. 50, 98-108 (2011).
  28. Miller, D. M. 3rd, Niemeyer, C. J. Expression of the unc-4 homeoprotein in Caenorhabditis elegans motor neurons specifies presynaptic input. Development. 121, 2877-2886 (1995).
  29. Lickteig, K. M., et al. Regulation of neurotransmitter vesicles by the homeodomain protein UNC-4 and its transcriptional corepressor UNC-37/groucho in Caenorhabditis elegans cholinergic motor neurons. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 2001-2014 (2001).
  30. Zhang, H., et al. UNC119 is required for G protein trafficking in sensory neurons. Nature. 14 (7), (2011).
  31. Maduro, M., Pilgrim, D. Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system. Genetics. 141, 977-988 (1995).
  32. Chalfie, M., Sulston, J. Developmental genetics of the mechanosensory neurons of Caenorhabditis elegans. Developmental biology. 82, 358-370 (1981).
  33. Fukushige, T., et al. MEC-12, an alpha-tubulin required for touch sensitivity in C. elegans. Journal of cell science. 112 (Pt. 3), 395-403 (1999).
  34. Driscoll, M., Chalfie, M. The mec-4 gene is a member of a family of Caenorhabditis elegans genes that can mutate to induce neuronal degeneration. Nature. 349, 588-593 (1991).
  35. Xu, K., Tavernarakis, N., Driscoll, M. Necrotic cell death in C. elegans requires the function of calreticulin and regulators of Ca(2+) release from the endoplasmic reticulum. Neuron. 31, 957-971 (2001).
  36. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual review of physiology. 46, 455-472 (1984).
  37. Strange, K., Christensen, M., Morrison, R. Primary culture of Caenorhabditis elegans developing embryo cells for electrophysiological, cell biological and molecular studies. Nature protocols. 2, 1003-1012 (2007).
  38. Goodman, M. B., Lockery, S. R. Pressure polishing: a method for re-shaping patch pipettes during fire polishing. Journal of neuroscience. 100, 13-15 (2000).
  39. Nickell, W. T., Pun, R. Y., Bargmann, C. I., Kleene, S. J. Single ionic channels of two Caenorhabditis elegans chemosensory neurons in native membrane. The Journal of membrane biology. 189, 55-66 (2002).
  40. Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nature neuroscience. 11, 916-922 (2008).
  41. Parpura, V. Cell culturing of Caenorhabditis elegans glial cells for the assessment of cytosolic Ca(2)(+) dynamics. Methods Mol. Biol. 814 (2), 153-174 (2012).
  42. Zhang, Y., et al. Identification of genes expressed in C. elegans touch receptor neurons. Nature. 418, 331-335 (2002).
  43. Cinar, H., Keles, S., Jin, Y. Expression profiling of GABAergic motor neurons in Caenorhabditis elegans. Current biology : CB. 15, 340-346 (2005).
  44. Bacaj, T., Tevlin, M., Lu, Y., Shaham, S. Glia are essential for sensory organ function in C. elegans. Science. 322, 744-747 (2008).
  45. Colosimo, M. E., et al. Identification of thermosensory and olfactory neuron-specific genes via expression profiling of single neuron types. Current biology : CB. 14, 2245-2251 (1016).
  46. Shih, J. D., Fitzgerald, M. C., Sutherlin, M., Hunter, C. P. The SID-1 double-stranded RNA transporter is not selective for dsRNA length. RNA. 15, 384-390 (2009).
  47. O'Hagan, R., Chalfie, M., Goodman, M. B. The MEC-4 DEG/ENaC channel of Caenorhabditis elegans touch receptor neurons transduces mechanical signals. Nature. 8, 43-50 (2005).
  48. Du, H., Gu, G., William, C. M., Chalfie, M. Extracellular proteins needed for C. elegans mechanosensation. Neuron. 16, 183-194 (1996).
  49. Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PloS one. 6, e19505(2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

C elegans Embryonic CellsEgg IsolationChitinase TreatmentManual DissociationCell CultureImmunofluorescenceMicroscopyElectrophysiologyCalcium ImagingPatch Clamp

Related Articles