مقالة منهجية

تلوين الأجسام المضادة في C. ايليجانس عن طريق "تجميد تكسير"

DOI:

10.3791/50664

⸱

أكتوبر 14, 2013

1Department of Biological Sciences, Ohio University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

"تكسير الفريزر"، وهي طريقة لتعريض الأنسجة الداخلية للC. الخيطية ايليجانس إلى الأجسام المضادة للبروتين التعريب، ويتجلى.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وصمة عار C. ايليجانس مع الأجسام المضادة، لا بد من تجاوزها بشرة منيعة نسبيا بالطرق الكيميائية أو الميكانيكية. "تكسير تجميد" هو أسلوب واحد يستخدم لسحب جسديا بشرة من الديدان الخيطية الديدان الخيطية عن طريق ضغط بين شريحتين ملتصقة، تجميدها، وسحب الشرائح على حدة. يوفر تجميد تكسير وسيلة بسيطة وسريعة للوصول إلى الأنسجة دون المعالجة الكيميائية، ويمكن استخدامها مع مجموعة متنوعة من مثبتات. ومع ذلك، فإنه يؤدي إلى فقدان العديد من العينات وضغط ميكانيكيا المطلوبة يشوه العينة. مطلوب الممارسة لتحقيق أقصى قدر من الانتعاش من العينات مع مورفولوجية جيدة. يمكن أن يكون الأمثل تجميد تكسير لشروط محددة التثبيت، والانتعاش من العينات، أو منخفضة تلطيخ غير محددة، ولكن ليس لجميع المعلمات في آن واحد. عن الأجسام المضادة التي تتطلب شروط التثبيت من الصعب جدا وتحمل العلاجات الكيميائية اللازمة لpermeabilize كيميائيا بشرة، المعاملهقد يكون من المفضل طن من الديدان الخيطية سليمة في الحل. إذا كانت الأجسام المضادة يتطلب الإصلاح أخف وزنا أو إذا كانت الشروط التثبيت الأمثل غير معروفة، ويوفر تجميد تكسير وسيلة مفيدة جدا لفحص الأجسام المضادة بسرعة ويمكن أن تسفر عن معلومات محددة توطين التحت خلوية والخلوية للمستضد من الفائدة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتحديد توطين الخلوية والتحت خلوية من البروتينات، والعلماء وصفت تقليديا الأنسجة مع الأجسام المضادة المحددة للاعتراف على وجه التحديد خاصة البروتينات 1. في بعض الكائنات الحية مثل نموذج C. ايليجانس، وكثيرا ما تم استبدال تلوين الأجسام المضادة عن طريق التقنيات الوراثية الجزيئية، والتي تسفر عن نتائج بسرعة أكبر. وتشمل هذه الكائنات مع تحويل بنيات تتكون من اندماج الجينات بين المروج والمناطق الترميز من الجينات في المصالح وبروتين الفلورية الخضراء. ومع ذلك، والتقنيات الجزيئية تخضع لعدد من الأعمال الفنية، بما في ذلك المشاكل مع معرفة المروج الحقيقي والتغيرات في التعبير عن ثوابت في عدد نسخ عالية (التقنيات المعتادة في C.....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: يتم عرض الخطوات بروتوكول متعددة مع خيارات لمجموعة المتابعة وإعداد تبعا لظروف معينة من التجربة. لهذه الحالات، يتم عرض خطوات بديلة ك A، B، C، الخ ويرد بروتوكول مع خطوات بديلة في الشكل 1.

1. إعداد الشرائح المغلفة متعدد الليزين

ثلاثة أنواع مختلفة من الشرائح يمكن استخدامها، وهذا يتوقف على المطلوب مفاضلة بين سهولة التحضير، التصاق النسبي، وغير محددة وملزمة من الأجسام المضادة. وترد تفاصيل عن بدائل إعداد الشريحة أدناه في الخطوات 1A-1C من أجل زيادة التصاق والتعقيد. الشرا....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عندما يتم ضغط الديدان بشكل صحيح، متصدع، وبخفة ثابتة، يمكن تقريبا الدودة بأكمله تكون في متناول تلوين الأجسام المضادة (انظر الشكل 2). موقع نواة كما يتبين من تلطيخ دابي تشير إلى أي أجزاء من دودة سليمة عندما تتعرض الديدان لتثبيتي أصعب، مثل الفورمالديهايد، والتشكل من دودة قد تصبح مشوهة (كما رأينا من قبل ظهور مائج غير طبيعية من العضلات في أرقام 3A-D). مشكلة مشتركة أخرى هي تثبيت متفاوتة أو اختراق أنسجة معينة. ويرد مثال على ذلك في أرقام 3E-H،

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بروتوكول تكسير تجميد هي واحدة من عدة طرق لتلوين الأجسام المضادة في C. ايليجانس. وهو يوفر وسيلة بسيطة نسبيا وصمة عار الديدان، ولكن لا تتطلب الكواشف محددة وممارسة لأفضل النتائج. الخطوات الحاسمة (المبين في الشكل 1) ما يلي: 1) إعداد الشريحة (انظر الخطوات 1 و 2) ضغط يدوي من الديدان الخيطية (انظر الخطوات 2 و 3) التثبيت السريع (راجع الخطوة 3). أولا، لتحقيق أقصى قدر من الالتصاق من الديدان الخيطية على الشرائح، فمن الأفضل لإعداد الشرائح مع ارتفاع الوزن الجزيئي (بول.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلف أنه ليس لديها مصالح مالية المتنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم توفير التمويل من قبل جبهة الخلاص الوطني CCLI # 0633618 وجامعة ولاية أوهايو. وقدمت بعض سلالات من مركز علم الوراثة انواع معينة. يظهر طالب دراسات عليا Reetobrata باسو في الفيديو.

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
شريحة بولي L-lysine (ماركة ESCO)Fisher12-545-78العلامة التجارية Sigma مناسبة أيضا
بولي L-lysine هيدروبروميدSigmaP1524IMPORTANT: < / قوي> العلامة التجارية والوزن الجزيئي العالي للبوليسين الحرجة
شرائح حافة بلوري واحدةفيشر48312-002العلامات التجارية الأخرى مناسبة
أزيد الصوديومSigmaS2002-25GTOXIC ، ارتد قفازات وقناع أثناء وزن المسحوق لصنع مخزون بنسبة 10٪. ارتداء القفازات عند أنابيب محلول
كوبلن جرة تلطيخVWR47751-792العلامات التجارية الأخرى مناسبة
5 شرائح بريدإلكتروني علم المجهر71549-01واحدة من العديد من العلامات التجارية المختلفة لحامل الشرائح الصغير ، ومناسبة لتلوين
ParaformaldehydeVWRMK262159<قوي>هام: < / قوي> محاليل الفورمالين العادية (37٪ فورمالديهايد) ليست مناسبة. إما 1) قم بإذابة الكريساتالين بارافورمالدهيد في مخزن الفوسفات وتخزينه في كميات صغيرة مجمدة. أو 2) شراء درجة الفحص المجهري الإلكتروني بارافورمالدهيد في الاقتباسات. قفازات سامة - ارتداء القفازات. تخلص من الحوض الزائد بالماء.
محلول الجلوتارالديهايد ، 25٪ في الماءSigmaG 5882<قوي>هام: < / قوي> شراء الجلوتارالديهايد المجهري الإلكتروني في الأمبولات ؛ قفازات سامة - ارتداء القفازات. تخلص من الحوض الزائد بالماء.
Triton X-100VWREM-9410العلامات التجارية الأخرى مناسبة
مصل الأبقار ألبومينفيشرICN820451العلامات التجارية الأخرى مناسبة
مصل الحمار ، المجفف بالتجميدJackson Immunoresearch017-000-121العلامات التجارية الأخرى مناسبة
Cy3 Donkey المضاد للفأر IgG متعدد الملصقاتJackson Immunoresearch715-165-150يوصى باستخدام هذه الشركة للحصول على أجسام مضادة عالية الجودة متعددة الملصقات (مستنفدة التقارب). حدد الصبغة والمستضد المناسبين (يستخدم لرفع الجسم المضاد الأساسي).
ن-بروبيل غالاتفيشرICN10274750العلامات التجارية الأخرى مناسبة
DAPI ، 4'،6'-diamidino-2-phenylindole dihydrochlorideSigmaD 9542TOXIC. ارتد القفازات وقم بالاستغناء عن الأجزاء الصغيرة وقم بتقليل التعرض
Whatman # 1 مرشحات قطرها 15 سمفيشر09805G
Coverslip # 1 1/2 مستطيل 24 × 60 ممVWR48393-252# 1 1/2 سمك بصريا أفضل
مجلد شرائح مجهرVWR48429-092ماركات أخرى مناسبة
شرائح مخزون

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Harlow, E., Lane, D. Antibodies: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York City, New York. (1988).
  2. Mello, C., Fire, A. DNA Transformation. Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).
  3. Boulin, T., Etchberger, J. F., Hobert, O. Reporter gene fusions.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة