تحبب الخلايا البدينة، والإفراج عن وسطاء حساسية، والمهم في الحساسية، والربو، والدفاع الطفيلي. نحن هنا لشرح تقنيات 1 لتقييم آثار المخدرات والمواد السامة على تحبب، المنهجية المستخدمة مؤخرا لإظهار تأثير مثبط قوي من وكيل مضاد للجراثيم التريكلوسان 2.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
والفحص صفيحة ميكروسكوبية لتقييم تأثيرات المواد الكيماوية على RBL-2H3 الصاري تحبب الخلايا: آثار التريكلوسان بدون استخدام مذيب عضوي
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الخلايا البدينة تلعب دورا هاما في أمراض الحساسية والمناعة ضد الطفيليات الدفاع. تنشيط مرة واحدة (مثلا عن طريق مثيرة للحساسية)، فإنها degranulate، وهي العملية التي ينتج إيماس من الوسطاء حساسية. التشكيل من تحبب الخلايا البدينة من المخدرات والمواد السامة قد يكون لها آثار إيجابية أو سلبية على صحة الإنسان. وقد تم تشريح وظيفة الخلايا البدينة بالتفصيل مع استخدام مستقعد الخلايا البدينة سرطان الدم الفئران (RBL-2H3)، وهو النموذج المقبول على نطاق واسع من الإنسان الخلايا البدينة المخاطية 3-5. يمكن بسهولة وبشكل موثوق أن تقاس الصاري مكون الخلية الحبيبية والوسيط حساسية β-هيكسوزامينيداز، التي يتم تحريرها خطيا جنبا إلى جنب مع الهيستامين من الخلايا البدينة 6، من خلال رد الفعل مع ركيزة الفلورة، مما أسفر عن كثافة مضان قابلة للقياس في فحص صفيحة ميكروسكوبية التي هي قابلة لل دراسات عالية الإنتاجية 1. نشرت أصلا من قبل نعال وآخرون. 1، ونحن قد تكيفت هذه مقايسة تحبب لفحص سالأدوية و المواد السامة والتظاهر واستخدامه هنا.
التريكلوسان هي وكيل واسع الطيف مضاد للجراثيم التي هي موجودة في كثير من المنتجات الاستهلاكية وعثر عليها لتكون المساعدات العلاجية في الإنسان مرض حساسية الجلد 7-11، على الرغم من أن آلية هذا التأثير غير معروف. هنا علينا أن نظهر مقايسة للتأثير على التريكلوسان تحبب الخلايا البدينة. أظهرنا مؤخرا أن التريكلوسان يؤثر بقوة ظيفة الخلايا البدينة 2. في محاولة لتجنب استخدام مذيب عضوي، يذوب التريكلوسان مباشرة إلى المخزن المؤقت مائي مع الحرارة والتحريك، وتأكيد تركيز الناتجة باستخدام القياس الطيفي للأشعة فوق البنفسجية فيس (باستخدام ε 280 = 4،200 L / M / سم) 12. هذا البروتوكول لديه القدرة على أن تستخدم مع مجموعة متنوعة من المواد الكيميائية لتحديد آثارها على تحبب الخلايا البدينة، وعلى نطاق أوسع، إمكاناتهم حساسية.
المقدمة
الخلايا البدينة وحبيبات غاية الخلايا المناعية المستجيب أن تكون بمثابة الوسطاء الرئيسيين في الربو، والحساسية، والطفيليات الدفاع والتسرطن 13-16. يقيمون في ما يقرب من كل الأنسجة أوعية دموية 15، حيث تخزن بشكل آمن وسطاء حساسية والتهابات في حبيبات هيولية حتى المنشط لdegranulate. تحبب هو إيماس من حبيبات غشاء محدد، مما يؤدي إلى إطلاق وسطاء الصيدلانية الفعالة مثل الهستامين، تريبتاز، و leukotrienes 15. هذه النتائج العملية في الشروع في النوع الأول من تفاعلات فرط الحساسية التي تعتبر بالغة الأهمية في تصاعد الدفاع ضد الطفيليات وكذلك الشروع في استجابات حساسية، الربو، ومسببة للسرطان 15.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
لاحظ أن جميع صفات العازلة مدرجة في جدول في نهاية النص البروتوكول.
DAY 1:
1. إعداد الخلايا
- خطة من 96 جيدا مخطط الإعداد لوحة، وتتمحور عينات اختبار على التخطيط من أجل تجنب آثار الحافة. تخصيص ثلاثة مكررات لكل تركيز TCS المختبرة (± المنشطات تحبب من المستضد أو حامل الأيون)، فضلا عن ثلاث مكرارت لاطلاق سراح عفوية (لا تحبب المنشطة)، والحد الأقصى الافراج عن (0.2٪ تريتون X-100 [TX] تحلل المنظفات)، وكذل....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
عند تسخينها إلى 50 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة، وطيف الامتصاص للأشعة فوق البنفسجية فيس TCS لتنتج، منحنى قوي السلس بين ~ 260 و 300 نانومتر، مع ذروة عند 280 نانومتر، كما هو مبين في الشكل 1. القياس الطيفي للأشعة فوق البنفسجية فيس هو، بالتالي، أداة هامة التي يمكن استخدامها لحساب تركيز، لأن معامل الامتصاص المولي نشرت في 280 نانومتر هو 4،200 L / مول / سم 12. لقد وجدنا أن TCS لا تسقط من حل خلال الإطار الزمني للتجربة تحبب كامل، في أعقاب 50 ° C التدفئة (لا تظهر البيانات).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في عام 2004، نعال وآخرون. 1 وضع جهاز الاستشعار البيولوجي الخلايا البدينة للاختبار عالية الإنتاجية من تحبب. وهو فحص القوية التي تكيفنا للدراسات TCS لدينا ومفصلة في هذا الفيديو. قبل نعال وآخرون. 1 الفحص، تحبب الخلايا البدينة قد تم تقييمها بشكل روتيني عبر β-هيكسوزامينيداز 59-61، ولكن هذه الأساليب في وقت مبكر تستخدم fluorometers الذي كان يقرأ عينة واحدة في وقت واحد. الأهم من ذلك، نعال وآخرون. التوافق المباشرة المقامة بين أكثر طريقتهم الإنتاجية ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدينا شيء في الكشف عنها.
شكر وتقدير
معتمدة LMW وRHK من قبل مدرسة UMaine الدراسات العليا للعلوم والهندسة (GSBSE) الطبية الحيوية؛ كان مدعوما أيضا من قبل RHK مين الزراعية وتجربة محطة غابة. وقدمت تمويلا إضافيا من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (NIH P20-GM103423)، ومين الزراعية وتجربة محطة غابة (جرانت عدد ME08004-10، الفريق الاستشاري المشترك)، وجامعة ولاية ماين ADVANCE ارتفاع المد مركز (NSF المنح # 1008498) ، وبحوث كاتب المنحة الصيدلة / علم السموم من مؤسسة فارما (JAG). نشكر الدكاترة. ديفيد Holowka وباربرا بيرد للمستضد والخلايا. ونحن ممتنون لهينا الهاشمي، اليخاندرو فيليز، وأندرو Abovian للمساعدة بالمعدات وأوامر. هذا هو مين الزراعية والغابات تجربة محطة المنشور رقم 3311.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
المعدات: < / قوي> < << td colspan = "4" > الوصفات: < / قوي> < td colspan = "4" >< قوي > مادة بلاستيكية مستخدمة: < / قوي > < < < < < <
< < << td colspan = "4" >
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| RBL-2H3 Cells | ATCC | CRL-2256 | كانت الخلايا التي استخدمناها هدية ، ولكنها متوفرة أيضا من ATCC< / p> |
| Triclosan / Irgasan< / p> | Sigma | 72779< / p> CAS # 3380-34-5< / p> | يجب تخزينه في بيئة منخفضة الرطوبة< / p> |
| Trypsin < / p > | Gibco | 25300-054 < / p> CAS # 3380-34-5 < / p > | < / p > |
| EMEM< / p> | Lonza | 12-611F< / p> | < p align = "center" >< / p> |
| مصل الأبقار الجنينية< / p> | Atlanta Biologicals | S11150< / p> | < p align = "center" >< / p> |
| Gentamycin Sulfate< / ص> | لونزا للعلوم البيولوجية | < ص محاذاة = "مركز">17-518< / ص> | < ص محاذاة = "مركز" >< / ص |
| > < محاذاة = "مركز" >ألبومين ، مصل بقري< / ص > | كالبيوكيم | < p align = "center" > 12659 < / p > < p>CAS # 9048-46-8 < / p> < / p > | < / p> |
| Surfact-Amps X-100 (Triton X-100 ؛ محلول 10٪) < / p> | بيرس | < p align = "center" > 28314 < / p > CAS # 9002-93-1 < / p> | < p align = "center" >< / p> |
| HEPES< / p> | JT Baker | < محاذاة = "مركز" > 4153-01 < / ص > < ص محاذاة = "مركز" > CAS # 75277-39-3 < / ص > | < محاذاة = "مركز" >< / ص |
| > < p محاذاة = "مركز" > كلوريد المغنيسيوم < / ص > | VWR | p align = "center" >BDH0244-500G < / p > < p align = "center" >CAS # 7791-18-6 < / p > | < / ص > < |
| محاذاة = "مركز" > د- (+) - الجلوكوز < / ص > | الطب الحيوي | < محاذاة = "مركز" >152527< / ص > < محاذاة = "مركز" > CAS # 50-99-7 < / ص > | < ص محاذاة = "مركز" >< / ص |
| > < محاذاة = "مركز" >بلورات كلوريد البوتاسيوم< / ص > | جي تي بيكر | 3046-01 < / p > < p align = "center" >CAS # 7447-40-7< / p > | < / p |
| > dihyrdate كلوريد الكالسيوم < / p > | Acros Organics | < p align = "center" >207780010< / p > CAS # 10035-04-8 < / p > | < p align = " center">< / p> |
| Glycine < / p > | Sigma | < p align = "center" >G8898 < / p > CAS # 56-40-6 < / p > | < p align = "center" >< / p > |
| 4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-& beta ؛ -D-glucosaminide (4-MU) < / p> | EMD Biosciences | < p align = "center" > 474502-250MG< / p > CAS # 37067-4< / p> | التفاف في رقائق &ndash ؛ حساس للضوء < / p |
| > Anti-DNP Mouse IgE< / p> | Sigma | D8406 < / p> | يحتوي الكاشف على تركيز 1 مجم / مل. Aliquot 25 & micro; l من الكاشف في أنابيب منفصلة للطرد المركزي الدقيق وبارافيلم. تخزين الكميات عند -20 درجة ؛ C التي لا يتم استخدامها وتخزين aliquot التي يتم استخدامها عند 2-8 درجة ؛ C لمدة لا تزيد عن 1 شهر.< / ص > |
| < p align = "center" >DNP-BSA < / p > | هدية من الدكتور ديفيد هولوكا والدكتورة باربرا بيرد ، جامعة كورنيل | < p align = "center" >< / p | > اقتراح: تقنيات الحياة DNP-BSA catalog # A23018< / a>< / p> |
| الكالسيوم أيونوفور A23187 < / p > | Sigma | C75-22-1mg < / p> | تم صنع الأيونوفور من مسحوق بإضافة 400 & micro ؛ l من DMSO الطازج 100٪ في قارورة الأيونوفور ويتم الاحتفاظ بها عند -20 درجة ؛ C< / p> ملاحظة: لقد استخدمنا الأيونوفور بعد تاريخ انتهاء صلاحيته البالغ 3 أشهر بنجاح < / p |
| > DMSO< / p> | Sigma | D2650 < / p> CAS # 67-68-5 < / p > | < / p > |
| حمض الخليك < / ص > | VWR | p محاذاة = "مركز" >BDH3094 -2 < / ص > < ص محاذاة = "مركز" > CAS # 64-19-7 < / ص > | < ص محاذاة = "مركز" >< / ص > |
| < p align = "مركز" > كربونات الصوديوم اللامائية < / p > | Sigma | < p align = "center" >222321< / p > CAS # 497-19-8< / p> | < p align = "center" >< / p > |
| كلوريد الصوديوم < / p > | Sigma | < p align = "center" > 71376 < / p > CAS # 7647-14-5 < / p > | < p align = "center" >< / p |
| > حمض الهيدروكلوريك < / p > | VWR | BDH3026< / p > CAS # 7647-01-0 < / p > | < / p > |
| مرجع عازل ، درجة الحموضة 7 < / p > | VWR | BDH5046< / p > | < / p > |
| المخزن المؤقت المرجعي ، درجة الحموضة 10< / ص > | VWR | BDH5072< / ص > | < / p |
| > Reference Buffer ، درجة الحموضة 4< / p > | VWR | BDH5018< / p> | < / p |
| > ph electrode حل التخزين< / p> | VWR | p align = "center">14002-828< / p> | < / p> |
| DU 7500 مقياس الطيف الضوئي < / p> | Beckmann | لم يعد يباع< / p> | < / p> |
| Synergy 2 plate reader < / p > يستخدم برنامج جمع وتحليل بيانات الصفيحة الدقيقة Gen5 < / p > | BioTek | < p align = "center" > Module s < / p > | < / p |
| > Hematocytometer < / p > | Hausser Scientific | < p align = "center" > 3110< / ص > | < p align = "مركز" >< / p > |
| < p align = "center" >7 x & nbsp ؛ 7 CER ساخن / تحريك 120 فولت < / ص > < ص محاذاة = "مركز" > لوح تسخين / لوحة تحريك مغناطيسية < / ص > | VWR | p محاذاة = "مركز" > 97042-634 < / ص > | < p align = "مركز" >< / p |
| > الطرد المركزي < / p > | Eppendorf | < p align = "center" > 5430 < / p > | < p align = "center">< / p> |
| حمام مائي لزراعة الأنسجة < / p > | VWR | p align = "center" > نموذج # 89032-206 < / p > | < p align = "center" >< / p > |
| خزانة السلامة البيولوجية لثقافة الأنسجة < / p > SafeGARD (غطاء محرك TC) < / p > | شركة بيكر | < محاذاة = "مركز" > نموذج # SG403A-HE< / p > | < p align = "مركز" >< / p > |
| < p align = "center" >حاضنة ثقافة الأنسجة< / p> | ThermoScientific | < p align = "center" > نموذج # 3598 < / p > | < p align = "center" >< / p |
| > Pipetman < / p > | VWR | < / p> | Range: P2-P1000 < / p > |
| Balance < / p > | Mettler Toledo | < p align = "center" > Model # AG204 < / p > | < p align = "center" >< / p |
| > ph meter < p > | Symphony / VWR | نموذج # SB70P< / ص > | < p align = "center" >< / p > |
| Pipet-Aid < / p > | Drummond Scientific | < p align = "center" >4-000-100 < / p > | < / p > |
| موزع Combitip < / p > | Eppendorf | < p align = "center" > 4981 000.019 < / p> | < p align = "center" >< / p > |
| الأسيتات العازلة ، الرقم الهيدروجيني 4.4< / p> | اصنع 0.12 M حمض الخليك والمعايرة إلى درجة الحموضة 4.4 مع 10 N هيدروكسيد الصوديوم. هذا هو 5.3 مل من حمض الخليك الجليدي في 1 لتر من ماء MilliQ: (1 لتر) * (0.12 مول / لتر) * (60 جم / مول) * (مل / 1.37 جم) = 5.3 مل لأن كثافة الجليد 1.37 جم / مل | < ص محاذاة = "مركز" > مرشح معقم في زجاجة زجاجية معقمة < / ص > | |
| < p align = "مركز" >الركيزة (4-MU) < / p > | Sigma M-2133 ، 250 ملغ ، C18< / sub>H21< / sub>NO8< / sub> ، FW 379.4 CAS (37067-30-4) تخزين في -20 درجة ؛ مخزون C: 0.12 م في DMSO (46 مجم في 1 مل DMSO) ، دافئ إلى 37 درجة ؛ C ، دوامة ، صوتنة 10 دقائق في سونيكاتير حمام مائي بالماء الدافئ ، دوامة مرة أخرى | < p align = "center" >لكل تجربة ، قم بعمل محلول جديد من الركيزة في عازلة الأسيتات (تخفيف 100x) ، للتركيز النهائي 1.2 ملي مولار في عازلة الأسيتات < / ص > | |
| < p align = "center" > Glycine Carbonate Buffer ، درجة الحموضة 10< / p> | 26.7 جم جلايسين 47.1 جم كربونات الصوديوم اللامائية أضف الماء منزوع الأيونات لمدة 1 لتر ، واضبط الرقم الهيدروجيني على 10 | مرشح معقم في زجاجة زجاجية معقمة < / ص > | |
| < p align = "مركز" >Tyrodes (2 L) ، الرقم الهيدروجيني 7.4 < / ص > | 135 ملي كلوريد الصوديوم: 15.78 جم (أو 270 مل من 1 م) 5 ملي كلوريد الكنتروجين: 10 مل من مخزون 1 م 1.8 ملي CaCl 2< / sub>: 7.20 مل من مخزون 0.5 م 1 ملي مولار MgCl 2< / sub>: 4.00 مل من 0.5 م مخزون 5.6 ملي جلوكوز: 2.02 جم (11.2 مل من 1 م) 20 ملي هيب: 40 مل من مخزون 1 م باستخدام حمض هيدروكلوريك المركز من ~ 9.7-7.4 | < ص محاذاة = "مركز" > مرشح معقم في زجاجة زجاجية معقمة < / ص > | |
| < p align = "center" >RBL Cell Media< p> | مصل إذابة الأبقار الجنينية (FBS ، مخزن عند -20 درجة ؛ ج) لمدة 4 ساعات في 37 درجة ؛ حمام مائي C اتبع تقنية التعقيم القياسية احصل على 1 لتر كحد أدنى من الوسط الأساسي (MEM) مع L-glutamine (مع Earle' s أملاح) اسكب بعض MEM للحصول على 800 مل من MEM ، أضف 200 مل FBS دافئ أضف 1 مل مضاد حيوي لكبريتات جنتاميسين إلى 1 لتر من الوسائط باستخدام ماصة معقمة استخدم فقط زجاجات الوسائط التي تم تعقيمها وتمييزها لاستخدام زراعة الخلايا فقط. | مرشح معقم (0.2 مم) في زجاجة زجاجية معقمة < / p > | |
| < محاذاة = "مركز" > 200 & micro ؛ l نصائح ماصة معقمة يمكن التخلص منها مع تخرج في 96 رف < / ص > | VWR | p align = "center" >53509-009 < / p > | polypropylene < / p > |
| 1,000 & micro ؛ l نصائح ماصة الهباء الجوي المعقمة مع HighRecovery < / p > | VWR | p align = "center" > 89003-420 < / p > | polyethylene < / p |
| > 10 & micro ؛ l طرف صغير معقم منخفض ملزمة < / ص > | VWR | p محاذاة = "مركز" > 14217-704 < / ص > | محاذاة < ص = "مركز" > بولي بروبيلين < / ص |
| > محاذاة < ص محاذاة = "مركز" > أنابيب الطرد المركزي الدقيقة التي يمكن التخلص منها / المخروطية لقوة G العالية < / p > | VWR | p align = "مركز" >20170-038 < / ص > | محاذاة < p = "مركز" >البولي بروبيلين < / ص > |
| يمكن التخلص منه/متخرج/مخروطي/معقم 50 مل أنابيب الطرد المركزي مع أغطية لولبية < / ص > | VWR | p محاذاة = "مركز" > 21008-178 < / ص | > < محاذاة = "مركز" >البولي بروبيلين < / ص |
| > < محاذاة = "مركز" > يمكن التخلص منها / متخرج / مخروطي / معقم 15 مل & nbsp ؛ أنابيب الطرد المركزي ذات الأغطية اللولبية < / p > | VWR | p align = "center" >21008-103 < / p > | polypropylene < / p |
| > CELLSTAR ثقافة الأنسجة المعالجة T-25 قارورة مع غطاء المرشح < / p > | Greiner Bio One | < p align = "center" >690175< / p > | البوليسترين < / p> |
| CELLSTAR ثقافة الأنسجة المعالجة T-75 قارورة ث / غطاء المرشح < / p > | Greiner Bio One | 658175< / p > | polystyrene < / p |
| > CELLSTAR 10 ml & nbsp ؛ ماصة مصلية ملفوفة بالورق / البلاستيك < / ص > | Greiner Bio One | < p align = "center" > 607180 < / p > | < p align = "center" >polystyrene < / p > |
| CELLSTAR 2 ml & nbsp ؛ ماصة مصلية ملفوفة بالورق / البلاستيك < / ص > | Greiner Bio One | < p align = "center" > 710180 < / p > | < p align = "center" > polystyrene < / p > |
| CELLSTAR 5 ml ؛ ماصة مصلية ملفوفة بالورق / البلاستيك < / ص > | Greiner Bio One | < p align = "center">606180 < / p | > البوليسترين < / p > |
| CELLSTAR 25 ml & nbsp ؛ ورقة / ماصة مصلية ملفوفة بالبلاستيك < / ص > | Greiner Bio One | < p align = "center" > 760180 < / p > | البوليسترين < / p |
| > 1 سم كوفيت < / p > | N / A | < p align = "center" > N / A < / p | > البوليسترين < / p> |
| < محاذاة = "مركز" > CELLSTAR ، 96 واط صفيحة دقيقة ، معالجة ثقافة الأنسجة ، أسود ، مع غطاء < / ص > < ص محاذاة = "مركز" > 96 بئر لوحة< / ص > | Greiner Bio One | < p align = "center" >655086< / p > | polystyrene < / p > |
| Combitips< / p > | Eppendorf | < p align = "center"> 022266501< / ص > | < محاذاة = "مركز" > بولي بروبيلين / < / ص > < ف محاذاة = "مركز" > بولي إيثيلين < / ص> |
المراجع
- Naal, R., Tabb, J., Holowka, D., Baird, B. In situ measurement of degranulation as a biosensor based on RBL-2H3 mast cells. Biosens. Bioelectron. 20, 791-796 (2004).
- Palmer, R. K., et al. Antibacterial agent triclosan suppresses RBL-2H3 mast ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
