نحن يبرهن على وجود بروتوكول زراعة الخلايا لدراسة مباشرة لمكونات الخلايا العصبية والدبقية في الجهاز العصبي المعوي. ويتم إعداد الخلايا العصبية / الدبقية ثقافة مختلطة coverslips على من الضفيرة العضلية المعوية من فأر بالغ توفير القدرة على فحص الخلايا العصبية الفردية وظيفة الخلايا الدبقية التي كتبها الكهربية، المناعى، الخ.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الجهاز العصبي المعوي هو عبارة عن شبكة واسعة من الخلايا العصبية والدبقية يمتد على طول القناة الهضمية التي تتحكم ظيفيا حركية الجهاز الهضمي. ووصف الإجراء لعزل وثقافة يسكنها خليط من الخلايا العصبية والدبقية من الضفيرة العضلية المعوية. يمكن الحفاظ على الثقافات الأولية لأكثر من 7 أيام، مع وصلات بين الخلايا العصبية النامية والدبقية. يتم تجريد قطاع العضلات الطولية مع المرفقة العضلية المعوية الضفيرة من العضلات الدائرية الكامنة وراء الدقاق الماوس أو القولون وتعرض لعملية الهضم الأنزيمية. في ظروف معقمة، والحفاظ على الخلايا العصبية والدبقية معزولة السكان داخل الكرية التالية الطرد المركزي ومطلي coverslips على. في غضون 24-48 ساعة، يحدث محوار ثمرة ويمكن التعرف على الخلايا العصبية بواسطة علامات عموم العصبية. بعد يومين في الثقافة، والخلايا العصبية معزولة إمكانات العمل النار كما لوحظ من الدراسات المشبك التصحيح. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا أن يكون الدبقية المعوية identifالعبوات الناسفة من قبل GFAP تلطيخ. وهناك شبكة من الخلايا العصبية والدبقية في بدل وثيقة تشكل في غضون 5-7 أيام. يمكن أن الخلايا العصبية المعوية يكون بشكل فردي ودرس مباشرة باستخدام أساليب مثل المناعية، الكهربية، والتصوير الكالسيوم، وحيدة الخلية PCR. وعلاوة على ذلك، هذا الإجراء لا يمكن أن يؤديها في الحيوانات المعدلة وراثيا. هذه المنهجية هي بسيطة وغير مكلفة لأداء. وعموما، هذا البروتوكول إلى الكشف عن مكونات الجهاز العصبي المعوي بطريقة التلاعب بها بسهولة حتى نتمكن من اكتشاف أفضل وظيفة في الولايات ENS العادي والمرض.
المقدمة
الجهاز العصبي المعوي (ENS) هي شبكة واسعة من الأعصاب والخلايا الدبقية التي تمتد على طول كامل من الجهاز الهضمي (GI) المسالك. وENS تسيطر وظيفيا جميع جوانب الهضم، بما في ذلك التمعج، وامتصاص السوائل / إفراز، والإحساس من المحفزات، الخ (للمراجعة انظر 1). أنه يحتوي على أكثر من 500 مليون خلية عصبية، أكثر من الموجودة في الحبل الشوكي، ويحتوي على كل فئة الناقلات العصبية الموجودة في الدماغ. علاوة على ذلك، ENS هي فريدة من نوعها من حيث أنها يمكن أن تعمل بالغريزة دون مدخلات من الجهاز العصبي المركزي 2. فهم ENS أمر بالغ الأهمية، ليس فقط لفهم دورها فسيولوجية طبيعية، ولكن لفهم مشاركتها في مجموعة متنوعة من اعتلال الأعصاب الذي يمكن أن يكون خلقي (مرض هيرشسبرونغ)، المكتسب (داء شاغاس)، الثانوية لمرض دول (خزل المعدة السكري)، ومكافحة المخدرات التي يسببها (متلازمة الأمعاء الأفيونية)، أو بسبب الاصابة (العلوص بعد الجراحة) 1. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن الخلايا العصبية المعوية تكون إعادةservoir لعدوى فيروسية (الحماق النطاقي) 3. بسبب التشابه إلى الدماغ ومستويات مرتفعة من السيروتونين في الأمعاء، والأدوية التي تهدف إلى علاج عيوب الجهاز العصبي المركزي غالبا ما يكون لها آثار جانبية غير مرغوب فيها على ENS 2. ومن الجدير بالذكر أيضا أن العديد من اعتلالات الأعصاب مثل مرض الزهايمر ومرض باركنسون تظهر التغيرات الخلوية مماثلة في الخلايا العصبية المعوية طويلة قبل ظهورها في الخلايا العصبية المركزية، مما يجعل ENS نموذج الوصول إليها لدراسة المرضية لهذه الأمراض 4. لذلك، فهم شامل للENS هو ضرورة في فهم الحالات المرضية ومنع / توقع الآثار الجانبية الدوائية.
وقد تم دراسة الخلايا العصبية في ENS تقليديا في خنزير غينيا استخدام مستحضرات wholemount 5-7 أو الخلايا العصبية مثقف 8. وعلى الرغم من سهولة في والتي يمكن دراستها الخلايا العصبية في هذه الحيوانات الكبيرة، وهذا النموذج لديه الكثير من القيود بما في ذلكعدم وجود سلالات معدلة وراثيا، والافتقار إلى الكواشف محددة لهذا النوع، والتكلفة العالية المرتبطة اشتري هذه المواضيع والإسكان. تطوير نموذج الجهاز العصبي المعوي الفئران لديه ميزة فريدة من طرق مختلفة من أنظمة، مجموعة واسعة من المنهجيات الأخرى المنشأة التي يمكن استخدامها جنبا إلى جنب مع تقنية زراعة الخلايا، والقدرة على توفير التحقق من صحة لنموذج خنزير غينيا .
ويتألف من ثلاثة ENS بلكسى التي تعمل على طول القناة الهضمية: والعضلية المعوية الضفيرة الخارجي (بين العضلات الطولية والدائرية) التي هي المسؤولة أساسا عن تصرفات تحوي من الأمعاء، وكذلك بلكسى تحت المخاطية والمخاطية، ( وجدت تحت وداخل الغشاء المخاطي، على التوالي) التي تسيطر إلى حد كبير امتصاص السوائل / إفراز والكشف عن المنبهات 1. يبدأ هذا الأسلوب مع العزلة من الضفيرة إعداد العضلات / العضلية المعوية طولية (LMMP) عن طريق تقشيرقبالة طبقة العضلات الخارجي من الجهاز الهضمي. هذا يخفض بشكل كبير بانخفاض بشأن قضايا التلوث التي تنشأ عندما تشارك الطبقة المخاطية في عزلة. ونتيجة لذلك، وهذه العملية هي مثالية لدراسة السيطرة العصبية في القدرة على الحركة بدلا من الإجراءات إفرازية من ENS.
الطريقة المعروضة هنا النتائج في ثقافة مختلطة من الخلايا العصبية المعوية والخلايا الدبقية. واثنين على الأقل من أنواع مختلفة من الخلايا العصبية موجودة على أساس الملاحظات الكهربية وimmunocytochemical السابقة 9. وجود الخلايا الدبقية هو مفيد للغاية، لأنها ليست سوى نوع من الخلايا الهامة للدراسة في حد ذاتها، ولكن لأنها تسهم في بقاء الخلايا العصبية المعوية 10 والحفاظ على التعبير مستقبلات الأم على سطح الخلية العصبية 11. وعلاوة على ذلك، قد نقص من الدبقية المعوي يؤدي إلى غير طبيعي الجهاز الهضمي الحالات المرضية حركية، صاغ 12 '-gliopathies العصبية'. ولذلك، فإن ثقافة ENS المقدمة هنا Results في العديد من أنواع الخلايا التي أصبحت جاهزة للتحقيق فيها.
مزايا لهذه المنهجية هي سهولة العزلة، ومتطلبات أداة غير مكلفة، وفترة زمنية قصيرة لإتقان هذه التقنية من قبل موظفي المختبر ذوي الخبرة. القيود المفروضة على منهجية تشمل انخفاض العائد خلية الإجمالي من وحدات تخزين الأنسجة عالية واستبعاد الخلايا العصبية ENS من بلكسى المخاطية وتحت المخاطية. وسوف يكون هذا الإجراء مفيدا للغاية للعلماء المتخصصين في الكهربية، المناعية، وحيدة الخلية PCR، والمنهجيات الأخرى.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
كانت كل رعاية الحيوان والإجراءات التجريبية وفقا للوافقت عليها لجنة استخدام المؤسسات ورعاية الحيوان في جامعة فرجينيا كومنولث.
1. إعداد العقيمة coverslips الزجاج بولي-D-يسين وLaminin مغلف بالمطاط في 24 لوحات جيدة
- يتم تنفيذ جميع الإجراءات للخطوة 1 في ظروف معقمة؛ تحت غطاء محرك السيارة، ومع الكواشف معقمة. ويجب تعقيم coverslips الزجاج والماء منزوع الأيونات المزدوجة ([ده 2 O) مقدما. إعداد لوحات ويمكن القيام تصل إلى أسبوعين قبل الخلايا العصبية العزلة.
- تحت غطاء محرك السيارة، واستخدام ملقط معقم لوضع coverslips الزجاج تعقيمها في 12 بئرا من 24 لوحة جيدا.
- إعداد الأوراق المالية بولي-D-يسين في وقت مبكر. إضافة 50 مل من ddH2O العقيمة إلى 5 ملغ بولي-D-يسين. دوامة وتخزينها في 3 مل aliquots في -20 درجة مئوية. ذوبان الجليد مأخوذة قبل الاستخدام.
- لتركيز النهائي من 1 مل الأسهم بولي-D-يسين لكل 25 سم 2: ماصة 80 ميكرولترمن الأسهم بولي-D-يسين على رأس كل منهما الزجاج ساترة (2 سم 2). اسمحوا حل تسوية لمدة 10 دقيقة.
- إزالة بولي-D-يسين باستخدام فراغ وشطف coverslips على 3x مع العقيمة DDH 2 O.
- السماح لوحات لتجف لمدة لا تقل عن 2 ساعة تحت غطاء محرك السيارة.
- قد يتم تخزين لوحات في 4 درجة مئوية أو - 20 درجة مئوية قبل الشروع في طلاء laminin.
- إعداد الأوراق المالية laminin في وقت مبكر. ذوبان الجليد laminin على الجليد والحفاظ على الجليد أثناء الاستخدام. تمييع إلى تركيز 50 ميكروغرام / مل؛ الالتفات إلى الكثير تركيز؛ كل كبيرة وسوف تكون مختلفة. اعتمادا على تركيز الكثير، سيتم إضافة ما يقرب من 20 مل ده 2 O إلى كل قارورة من laminin. قسامة (5 مل) وتخزينها في -80 درجة مئوية. ذوبان الجليد مأخوذة على الجليد قبل الاستخدام.
- coverslips على معطف مع 5 ميكروغرام / سم 2 laminin؛ ماصة 200 ميكرولتر من الأسهم laminin على كل ساترة.
- احتضان حل laminin coverslips على لمدة 1 ساعة.
- نضح الحل laminin المتبقية وشطف coverslips على مرة واحدة مع[ده 2 O. تجنب كشط سطح coverslips على.
- لوحات تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
2. الإعداد المسبق من الخلية العصبية العزلة حلول
- يعد حل كريبس (في ملي: 118 كلوريد الصوديوم، 4.6 بوكل، 1.3 ناه 2 ص 4، 1.2 MgSO 4، 25 NaHCO 3، 11 الجلوكوز، و 2.5 و CaCl 2). المكان 13.79 غرام كلوريد الصوديوم (FW 58.44)، 0.686 غرام بوكل (FW 74.55)، 0.312 غ ناه 2 ص 4 (FW 120)، 0.289 غرام MgSO 4 (FW 120.4)، 4.20 غرام NaHCO 3 (FW 84.01)، 3.96 غرام جلوكوز (FW 180.2)، و0.555 غرام و CaCl 2 (FW 111) في 2 L [ده 2 0. هدئ إلى 4 درجات مئوية.
- إعداد شطف وسائل الإعلام (F12 وسائل الإعلام مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) والمضادات الحيوية / مضاد فطري): لزجاجة 500 مل من F12 سائل الإعلام، إضافة 50 مل FBS و 5 مل من مضاد حيوي / مضاد فطري السائل 100X (GIBCO).
- إعداد وسائل الاعلام الخلايا العصبية المعوية (Neurobasal A وسائل الاعلام مع B-27، 2 مم L-الجلوتامين، 1٪ FBS، 10 نانوغرام / مل، الدبقية مشتقة Neurotrعامل ophic (GDNF)، ومضاد حيوي / مضاد فطري السائل 100X). لجعل الأسهم GDNF، إضافة 1 مل ddH2O إلى 10 ميكروغرام GDNF وتجميد مرة أخرى في 50 ميكرولتر مأخوذة، مخزن في -80 درجة مئوية. لقارورة مل 50 من وسائل الاعلام الخلايا العصبية كاملة، والجمع بين 47.5 مل Neurobasal A وسائل الاعلام، 1 مل B-27 (50X)، 500 ميكرولتر FBS، 500 ميكرولتر 200 مم L-الجلوتامين (GIBCO) 50 الأسهم GDNF ميكرولتر، و 500 ميكرولتر مضاد حيوي / السائل 100X فطري. يرصد وسائل الاعلام في 50 دفعات صغيرة مل لضمان نضارة GDNF وتجنب تلوث كميات كبيرة من هذه الخلية مكلفة خليط سائل الإعلام.
3. الحصاد الطولية العضلات / العضلية المعوية الضفيرة (LMMP) من إعداد الفئران
- وينبغي أن تكون الأخلاقيات الوطنية والمؤسسية المناسبة في المكان قبل تنفيذ التجارب على الحيوانات. ويعيش الكبار السويسري وبستر الفئران وزنها أكثر من 25 غرام (عادة أكثر من 8 أسابيع من العمر) في مجموعات من 6 قبل التجارب. وتستخدم الأنسجة من اثنين من الفئران لعزل الخلايا العصبية المعوية اللفائفية والدبقية وتستخدم ثلاثة الفئران للعزل الخلايا القولون.
- إعداد المنطقة الجراحية. جمع مقص صغير جراحية، ملقط الزاوية، ومسحات القطن، وثلاثة أكواب زجاج 200 مل، وقضيب الزجاج / البلاستيك (الرسام). ضمان غسلها جيدا كل اللوازم وتشطف قبل استخدامها للحد من التلوث. هذه الخطوة لا يمكن أن يؤديها قبل يوم من التجربة.
- وضع حل كريبس على الجليد وفقاعة مع كربوجين (95٪ أكسجين و 5٪ CO 2) لمدة 30 دقيقة على الأقل لتحقيق الاستقرار في درجة الحموضة.
- بدوره على مختلف المعدات والمواد الكيميائية دافئ لتحقيق الاستقرار في درجات الحرارة المطلوب؛ حمام مائي حرارة (ق) إلى 37 ° C، الطرد المركزي بارد إلى 4 درجات مئوية، مكان محلول ملحي متوازن هانك (HBSS) والتربسين 0.5٪ في حمام ماء (37 ° C ). ينبغي أن تظل وسائل الإعلام الخلايا العصبية كاملة وشطف سائل الإعلام المبردة.
- فقاعات مكان 150 مل الجليد الباردة كريبس في ثلاثة أكواب زجاج 200 مل المسمى 'القذرة'، 'نظيفة'، و 'LMMP'. دورق فقاعة المسمى 'LMMP' مع كربوجين.
- بعد موافقة لجنة الأخلاقيات، الموت ببطء م[أوس] من قبل خلع عنق الرحم أو CO 2 الاختناق.
- ضع الماوس في رقود ظهري على سطح الجراحية، والجلد نظيف مع 70٪ ETOH، ورفع جلد البطن باستخدام ملقط. باستخدام مقص، وتجويف البطن مفتوحة وتكشف عن الجهاز الهضمي الداخلية.
- إزالة طول الجهاز الهضمي من خلال رفع قسم من الدقاق والكشف عن مساريق لها. قصاصة من خلال مساريق مع مقص لإزالة بلطف وكشف الدقاق والقولون، والحرص على عدم سحب مساريق من الدقاق / القولون.
- بعد كشف كامل طول الأمعاء، وإزالة الدقاق من خلال قطع الأمعاء القاصي إلى المعدة والأقرب إلى الأعور ملاحظة: يمكن أيضا أن يتم تنفيذ هذا الإجراء مع أنسجة القولون عن طريق إزالة القولون من القاصي إلى الأعور إلى الأقرب إلى فتحة الشرج.
- الأنسجة ويمكن تقسيم آخر بين القولون القريبة والبعيدة، وjejenum، والدقاق. وسوف تبقى من هذا الإجراء الرجوع إلى عزلة الدقاق؛ ركان الإجراء هو نفسه لعزل LMMP القولون. وضع الدقاق كامل في وعاء زجاجي مع الثلج الباردة كريبس ملحوظ 'القذرة'.
- إنشاء أداة لتنظيف الدقاق؛ حادة كبير 20 إبرة G باستخدام الحجر الايداع وإرفاقه حقنة كبيرة (10 مل) تحتوي على الجليد الباردة كريبس.
- تنظيف البراز من الدقاق من قبل باجتزاء الدقاق إلى ثلاثة أو أكثر من القطع الكبيرة. إزالة القسم اللفائفية من كوب ووضع إبرة اضعافها في نهاية مقال اللفائفية.
- تشغيل بلطف كريبس من خلال قسم الأمعاء حتى تتم إزالة جميع البراز في وعاء النفايات منفصلة. وضع قسم تنظيف في وعاء من كريبس ملحوظ 'نظيفة'. كرر حتى يتم تنظيف الدقاق بأكمله.
- لإزالة LMMP، وقطع الدقاق الى شرائح صغيرة، حوالي 2-4 سم. ضع شريحة من الدقاق على البلاستيك أو الزجاج قضيب؛ الدقاق ينبغي أن تناسب سنججلي لكن لا تكون فضفاضة أو مشدود (~ 2 مم). بدء إزالة LMMP عن طريق إزالة بلطف بت من مساريق لا تزال تعلقإد إلى (GI) الجهاز الهضمي باستخدام ملقط. منع الجهاز الهضمي من تدور حول قضيب تعلق بها بلطف أنبوب للقضيب باستخدام الإبهام.
- فصل LMMP من العضلات الدائرية الأساسية؛ الأول فرك بلطف على حافة ملقط على طول الخط كله حيث كان يعلق على مساريق، من أعلى إلى أسفل للجزء، وخلق بلطف وجود فجوة في العضلة الطولية. ثم ندف بلطف بعيدا العضلات الطولية باستخدام مسحة القطن مبلل مع كريبس.
- تبدأ في الجزء العلوي من الفجوة في العضلات الطولية وندف بعيدا باستخدام أخف السكتة الدماغية الأفقي أثناء تطبيق الضغط الخفيف جدا حتى العضلات الطولية يبدأ فقط لفصل من العضلات الدائرية؛ القيام بذلك أسفل الشريط بأكمله على طول نقطة التعلق مساريق.
- ثم تبدأ بلطف للعمل على أنبوب GI؛ والانتقال من الأعلى إلى الأسفل والخلف كما يتم فصل العضلات الطولية ببطء من العضلات الدائرية على طول الطريق حول الأنبوب. عندما كاملة، وLMMP سوف تأتي بشكل طبيعي قبالة ما تبقى من الأنبوب الهضمي.
- وضع قطاع رقيقة الناتج من العضلات الطولية في الدورق ملحوظ 'LMMP'. كرر لجميع القطاعات.
- بعد أن تم جمع كل شرائح من LMMP من الماوس واحد، كرر إجراء أي الفئران الأخرى المستخدمة. شطف جيدا في الأكواب 'القذرة' و 'نظيف' قبل إعادة استخدامها.
- شطف LMMP 3X لإزالة التلوث البيولوجي. ملء ثلاثة 2 مل إيبندورف أنابيب مع الثلج الباردة كريبس. وضع شرائط LMMP في الأنبوب الأول وتدور لمدة 30 ثانية في 356 XG في جهاز للطرد المركزي يتم تبريده الى 4 درجات مئوية. إزالة بعناية طاف مع ماصة ونقل شرائط LMMP إلى التالي نظيفة كريبس أنبوب شغلها. كرر هذا الإجراء لكل أنبوب المتبقية.
4. هضم LMMP
- يعد حل الهضم عن طريق وضع 13 ملغ كولاجيناز من النوع 2 و 3 ملغ BSA في 10 مل كربوجين-فقاعات حل كريبس.
- شرائح مكان LMMP المشطوفة إلى حل الهضم وSCIS استخدامSORS إلى قص LMMP إلى قطع صغيرة.
- هضم LMMP لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حمام مائي مع شاكر في حين يجري فقاعات بلطف مع كربوجين.
- بعد اكتمال عملية الهضم، وجمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي لمدة 8 دقائق في 356 XG في أجهزة الطرد المركزي يتم تبريده الى 4 درجات مئوية.
- من هذه النقطة إلى الأمام يجب أن تتم جميع الإجراءات تحت ظروف معقمة في غطاء ثقافة الخلية! يجب تعقيم جميع الكواشف والحاويات قبل الاستخدام.
- أثناء الطرد المركزي، وإعداد 0.05٪ التربسين الحل من خلال وضع 1 مل تحسنت 0.25٪ التربسين و 4 مل تحسنت HBSS في العقيمة 50 مل أنبوب خلية ثقافة.
- بعد الطرد المركزي، وإزالة وتجاهل طاف. لا تستخدم فراغ، وهذا من المرجح أن تمتص الخلية بيليه بسبب الطرد المركزي بسرعة منخفضة. إزالة بعناية بيليه الخلية ومكان في أنبوب نظيفة مع 5 مل من محلول التربسين 0.05٪.
- هضم الخلايا في حل التربسين 0.05٪ في 37 ° C حمام الماء مع اهتزاز لمدة 7 دقائق. لا تتجاوز 7 ميلن من مجموع العلاج التربسين أو الخلايا العصبية سوف يهلك.
- تحييد التربسين مع 10 مل من وسائل الاعلام شطف الباردة بعد 7 دقائق من العلاج التربسين.
- أجهزة الطرد المركزي الخلايا لمدة 8 دقائق في ز X 356. إزالة وتجاهل وسائل الإعلام.
- أثناء الطرد المركزي، وتحقيق التوازن قسم من تعقيم شبكة Nitex على رأس العقيمة 15 مل أنبوب خلية ثقافة.
- بعد الطرد المركزي، وإزالة وتجاهل طاف. بلطف خليط الخلية resuspend من قبل الطحن في 3 مل وسائل الاعلام الخلايا العصبية كاملة. تجنب توليد فقاعات الهواء خلال هذه الخطوة وجميع الخطوات المستقبلية التي triturated خليط الخلية. يجب أن تتم جميع triturations بلطف جدا. تصفية حل الخلية من خلال شبكة Nitex في نظيفة 15 مل أنبوب خلية ثقافة.
- اختياري: كاب خلية أنبوب الثقافة والمكان في خلاط حولا المبردة (أو أي خلاط التي توفر دوران) مع المتداول لطيف ويميل لمدة 30 دقيقة. هذه الخطوة اختيارية ولكن الموصى بها.
- اختياري: بعد خلاط حولا، إضافة 2 مل شطف سائل الإعلام البارد لغسل الخلايا.
- جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي (8 دقائق، 356 x ج). إزالة وتجاهل طاف.
- Resuspend الخلايا في 1،200 ميكرولتر وسائل الاعلام الخلايا العصبية كاملة. يسحن الخلايا بلطف باستخدام 1 مل من البلاستيك غيض ماصة. لا تولد فقاعات الهواء. ماصة ببطء وبلطف حتى يتم تقسيم معظم أجزاء يصل ويتم تعليق الخلايا في السائل.
- إضافة 750 ميكرولتر من وسائل الإعلام كاملة إلى كل من الآبار 12 تحتوي على ساترة الزجاج قبل المغلفة وإضافة 100 ميكرولتر من الحل خلية triturated.
- احتضان الخلايا العصبية في خلية ثقافة حاضنة عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5٪ CO 2.
- تغيير نصف من وسائل الإعلام خلية كل يوم 2.
- الخلايا العصبية على استعداد للتسجيلات الكهربية بعد 1-2 أيام في الثقافة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
سوف العزلة التالية مباشرة من الخلايا المشتقة من LMMP، الخلايا العصبية وأنواع الخلايا الأخرى لا يكون واضحا بسهولة. المعيشة، ويمكن رؤية خلايا جولة من النمط الظاهري غير واضحة وكذلك المخلفات الأنسجة من شظايا الأنسجة هضمها بشكل غير كامل والنسيج الضام. هذا هو حطام سفينة من أي قلق وسوف يتم إزالتها إلى حد كبير مع تغير وسائل الاعلام لأول مرة في يومين. لا تحاول تنظيف الشرائح قبل هذا وسيتم إزالة، خلايا قابلة للحياة صحية كذلك.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الحيوانات المستخدمة
وقد تم تحسين هذا البروتوكول بالنسبة السويسري الفئران ويبستر. ومع ذلك، وهذه الطريقة غير قابلة للتكيف بسهولة إلى غيرها من الثدييات الصغيرة مثل الفئران وغيرها من سلالات من الفئران. لقد أجرينا بنجاح العزلة الأولية مع C57 الفئران ومستقبلات μ-الأفيونية تدق الرافضة. ومع ذلك، فمن الممكن أيضا أن سلالات أخرى من الفئران قد تكون إشكالية بسبب الاختلافات المورفولوجية في الجهاز الهضمي. وعلاوة على ذلك، هناك اختل...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن الكتاب أنه لا توجد المصالح المتنافسة الرئيسية.
شكر وتقدير
المعهد الوطني للصحة منح DA024009، DK046367 وT32DA007027.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
Equipment< / strong> قد تستخدم
< td colspan = "4" >
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| recodes< / strong> | |||
| Fisherbrand Coverglass لنظارات غطاء النمو (قطر 12 مم) | فيشر ساينتفيك | 12-545-82 | ؛ |
| بولي د-ليسين | سيجما | P6407- 5 ملغ | |
| 24 بئر لوحة زراعة الخلايا | CELLTREAT | 229124 قد تستخدم أي علامة تجارية | |
| Laminin | BD Biosciences | 354 232 | |
| ddH2O | يمكن تحضيره في المختبر | ||
| 15 مل أنبوب الطرد المركزي | المعقم Greiner Bio-one | 188261 | قد تستخدم أي علامة تجارية |
| 50 مل أنبوب الطرد المركزي | المعقم Greiner Bio-one | 227261 | قد تستخدم أي علامة تجارية |
| NaCl | Fisher BioReagents | BP358-212 | ميجاوات 58.44 |
| KCl | Fisher BioRecodes | BP366-500 | ميجاوات 74.55 |
| NaH2< / sub>PO4 < / sub>.2H2< / فرعي >O | فيشر للكيماويات | S369-3 | MW137.99 |
| MgSO4< / sub> | Sigma Aldrich | M7506-500G | MW 120.4 |
| NaHCO3< / sub> | Sigma Aldrich | S6014-5KG | MW 84.01 |
| جلوكوز | فيشر كيماويات | D16-1 | ميجاوات 180.16 |
| CaCl2< / sub>2H2< / sub>O | Sigma Aldrich | C5080-500G | MW 147.02 |
| F12 وسائل الإعلام | Gibco | 11330 | |
| مصل الأبقار الجنيني | جودة البيولوجية Inc. | 110-001-101HI | قد تستخدم أي علامة تجارية |
| مضاد حيوي / مضاد للفطريات 100x سائل | Gibco | 15240-062 | ؛ |
| Neurobasal A وسائل الإعلام | Gibco | 10888 | |
| 200 ملي مولار L-glutamine | Gibco | 25030164 | |
| عامل التغذية العصبية المشتق الدبقي (GDNF) | علم الأعصاب | PR27022 | |
| مقص تشريح حاد مدبب | فيشر | Scientific 8940 | قد يستخدم أي علامة تجارية |
| ملقط الأنسجة | التشريح فيشر Scientific | 13-812-41 | قد يستخدم أي علامة تجارية |
| أدوات تطبيق ذات رؤوس قطنية | فيشر Scientific | 23-400-101 | قد تستخدم أي علامة تجارية |
| 250 مل دورق زجاجي متدرج | فيشر Scientific | FB-100-250 | قد يستخدم أي علامة تجارية |
| 2 لتر زجاج Erlenmyer قارورة | فيشر Scientific | FB-500-2000 | قد تستخدم أي علامة تجارية |
| قضيب بلاستيكي (فرشاة طلاء للأطفال) | Crayola | 05 3516 | قد تستخدم أي علامة تجارية |
| Carbogen | Airgas | UN 3156 | 5٪ CO2< / sub> |
| 10 مل Leur-lock حقنة | Becton Dickinson | 309604 | قد تستخدم أي علامة تجارية |
| 21 جم × 1 1/2 بوصة. إبرة تحت الجلد | Becton Dickinson | 305167 | قد تستخدم أي علامة تجارية |
| كولاجيناز نوع 2 | ورثينجتون | LS004174 | |
| مصل الأبقار الألبومين | الأمريكي التحليل الحيوي | AB00440 | |
| 2 مل أجهزة الطرد المركزي الدقيقة أنابيب Eppendorf | Fisher Scientific | 13-864-252 | قد تستخدم أي علامة تجارية |
| Nitrex Mesh 500 & micro ؛ قد تستخدم شركة M | Elko Filtering Co | 100560 | أي علامة تجارية |
| مجموعة ماصات | Fisher Scientific | 21-377-328 | قد تستخدم أي علامة تجارية |
| Sharpeining Stone | Fisher Scientific | NC9681212 | قد تستخدم أي علامة تجارية |
| LabGard ES 425 خزانة السلامة البيولوجية (غطاء لزراعة الخلايا) | Nuaire | NU-425-400 | أي العلامة التجارية |
| 10 لتر اهتزاز Waterbath | Edvotek | 5027 | قد تستخدم أي علامة تجارية |
| أجهزة طرد مركزي دقيقة 5417R | Eppendorf | 5417R | قد تستخدم جهاز طرد مركزي واحد أكبر مع محولات حجم |
| Allegra 6 Series أجهزة الطرد المركزي | Beckman Coulter | 366816 | قد تستخدم أي علامة تجارية |
| HuluMixer Sample Mixer | Invitrogen | 15920D | & nbsp ؛ |
| حاضنة مائية AutoFlow CO2 | قد | تستخدم أي علامة تجارية | |
| مقياس ميزان تحليلي | Mettler Toledo | XS104 | قد يستخدم أي علامة تجارية |
المراجع
- Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9 (5), 286-294 (2012).
- Gershon, M. D. The enteric nervous system: A second brain. Hosp. Pract. (Minneap). 34 (7), 31-32 (1999).
- Gershon, A. A., Chen, J., Gershon, M. D. A model of lytic, latent, and reactivating varicella-zoster virus infections in isolated enteric neurons. J. Infect. Dis. 197, 61-65 (2008).
- Wakabayashi, K., Mori, F., Tanji, K., Orimo, S., Takahashi, H. Involvement of the peripheral nervous system in synucleinopathies, tauopathies and other neurodegenerative proteinopathies of the brain. Acta. Neuropathol. 120 (1), 1-12 (2010).
- Hirst, G. D., Holman, M. E., Spence, I. Two types of neurones in the myenteric plexus of duodenum in the guinea-pig. J. Physiol. 236 (2), 303-326 (1974).
- Clerc, N., Furness, J. B., Bornstein, J. C., Kunze, W. A. Correlation of electrophysiological and morphological characteristics of myenteric neurons of the duodenum in the guinea-pig. Neuroscience. 82 (3), 899-914 (1998).
- Rugiero, F., et al. Analysis of whole-cell currents by patch clamp of guinea-pig myenteric neurones in intact ganglia. J. Physiol. 538 (Pt. 2), 447-463 (2002).
- Jessen, K. R., Saffrey, M. J., Baluk, P., Hanani, M., Burnstock, G. The enteric nervous system in tissue culture. III. studies on neuronal survival and the retention of biochemical and morphological differentiation. Brain Res. 262 (1), 49-62 (1983).
- Smith, T. H., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. Morphine decreases enteric neuron excitability via inhibition of sodium channels. PLoS One. 7 (9), e45251(2012).
- Abdo, H., et al. Enteric glial cells protect neurons from oxidative stress in part via reduced glutathione. FASEB J. 24 (4), 1082-1094 (2010).
- Aube, A. C., et al. Changes in enteric neurone phenotype and intestinal functions in a transgenic mouse model of enteric glia disruption. Gut. 55 (5), 630-637 (2006).
- Bassotti, G., et al. Enteric glial cells and their role in gastrointestinal motor abnormalities: Introducing the neuro-gliopathies. World J. Gastroenterol. 13 (30), 4035-4041 (2007).
- Neal, K. B., Parry, L. J., Bornstein, J. C. Strain-specific genetics, anatomy and function of enteric neural serotonergic pathways in inbred mice. J. Physiol. 587 (Pt. 3), 567-586 (2009).
- Phillips, R. J., Walter, G. C., Powley, T. L. Age-related changes in vagal afferents innervating the gastrointestinal tract. Auton. Neurosci. 153 (1-2), 90-98 (2010).
- Furness, J. B. Types of neurons in the enteric nervous system. J. Auton. Nerv. Syst. 81 (1-3), 87-96 (2000).
- Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9 (11), 625-632 (2012).
- Pomeranz, H. D., Rothman, T. P., Chalazonitis, A., Tennyson, V. M., Gershon, M. D. Neural crest-derived cells isolated from the gut by immunoselection develop neuronal and glial phenotypes when cultured on laminin. Dev. Biol. 156 (2), 341-361 (1993).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
