وصفنا إعداد مكتبات الحمض النووي barcoded واللاحقة المستندة إلى التهجين التقاط اكسون للكشف عن الطفرات المرتبطة بالسرطان الرئيسية في عينات الورم السريرية التي المتوازية "الجيل القادم" التسلسل. استهداف تسلسل اكسون يقدم فوائد إنتاجية عالية وتكلفة منخفضة، وتغطية تسلسل عميق، وبالتالي العائد حساسية عالية للكشف عن الطفرات التردد المنخفض.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الكشف عن التعديلات الوراثية الجسدية في عينات الورم عن طريق التقاط اكسون وتسلسلها الموازي واسع
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وقد أثبتت الجهود للكشف والتحقيق الطفرات أنكجنيك مفتاح قيمة لتسهيل العلاج المناسب لمرضى السرطان. إنشاء الإنتاجية العالية، المتوازية "الجيل القادم" التسلسل ساعد على اكتشاف العديد من هذه الطفرات. لتعزيز المرافق السريرية ومتعدية لهذه التكنولوجيا، ويجب أن تكون منصات عالية الإنتاجية، وفعالة من حيث التكلفة، ومتوافقة مع البارافين الثابتة الفورمالين جزءا لا يتجزأ من (FFPE) عينات الأنسجة التي قد تسفر عن كميات صغيرة من الحمض النووي المتدهورة أو التالفة. هنا، نحن تصف إعداد مكتبات الحمض النووي barcoded والمضاعفة تليها التقاط القائم على التهجين من الإكسونات المستهدفة للكشف عن الطفرات المرتبطة بالسرطان في الأورام المجمدة والطازجة FFPE بواسطة تسلسل المتوازية. هذه الطريقة تمكن من تحديد الطفرات تسلسل، نسخ التعديلات العدد، وحدد إعادة ترتيب الهيكلية التي تنطوي على جميع الجينات المستهدفة. استهداف تسلسل اكسون يقدم روقال انه يستفيد من إنتاجية عالية وتكلفة منخفضة، وتغطية تسلسل عميق، وبالتالي منح حساسية عالية للكشف عن الطفرات التردد المنخفض.
المقدمة
تحديد "سائق" الأحداث الجينية في الورم المسرطنة الرئيسية وورم القامع الجينات تلعب دورا أساسيا في تشخيص وعلاج العديد من أنواع السرطان 1. وقد مكنت الجهود البحثية على نطاق واسع باستخدام المتوازية "الجيل القادم" التسلسل تحديد الكثير من هذه الجينات المرتبطة بالسرطان في السنوات الأخيرة 2. ومع ذلك، تتطلب هذه المنصات التسلسل عادة كميات كبيرة من الحمض النووي المعزولة من أنسجة الطازجة المجمدة، مما يشكل عائقا كبيرا في تشخيص وتحليل الطفرات الحمض النووي من الأنسجة الحفاظ عليها، مثل البارافين الثابتة الفورمالين جزءا لا يتجزأ من (FFPE) عينات الورم. سوف تحسين الجهود لبكفاءة وبشكل موثوق تميز المعلومات الجينية "للتنفيذ" من ع....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. الحمض النووي وإعداد الكاشف
ملاحظة: يصف هذا البروتوكول تجهيز في وقت واحد وتحليل 24 عينة (على سبيل المثال 12 الورم / أزواج عادي) ولكن يمكن تكييفها لدفعات أصغر وأكبر. عينات من الحمض النووي قد تنبع من FFPE أو الأنسجة الطازجة المجمدة، عينات الخلوي، أو الدم. عادة، سيتم محة سواء الورم والأنسجة الطبيعية من نفس المريض معا من أجل التمييز الطفرات الجسدية من الأشكال الموروثة. يبدأ بروتوكول التالية استخراج الحمض النووي على الفور.
- قسامة 50-250 نانوغرام (250 نانوغرام مستحسن....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم القبض على واحد مجموعة من 24 مكتبات barcoded تسلسل (12 زوجا للورم عادي) باستخدام مجسات المقابلة لجميع الإكسونات الترميز البروتين من 279 جينات السرطان والتسلسل كما يقرأ 2 × 75 نقطة أساس على حارة واحدة من خلية تدفق HiSeq 2000. وكان يتم تجميع الورم والمكتبات العادية في نسبة 2:1. وأظهرت مقاييس الأداء عينة لمجموعة من العينات المجمدة الحمض النووي ورم في الشكل 1، بما في ذلك معدل المحاذاة، حجم التوزيع جزء، على التقاط الهدف والنوعية، ويعني التغطية المستهدفة. المثال الطفر.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
لدينا IMPACT فحص تنتج نسبة عالية المحاذاة، وارتفاع معدل على الهدف، التغطية المستهدفة عالية، وحساسية عالية للكشف عن الطفرات، indels، ونسخ التعديلات العدد. لقد أثبتنا قدرة لدينا فحص الحمض النووي لIMPACT تسلسل من كلا الطازجة المجمدة وأرشفة عينات الحمض النووي FFPE من المدخلات منخفضة. عن طريق إجراء تسلسل اكسون تستهدف الجينات المرتبطة بالسرطان الرئيسية، يمكن للمرء أن تحقيق التغطية تسلسل عميق جدا لالإكسونات من هذه الجينات الأكثر أهمية مما تعظيم القدرة على الكشف عن الطفرات التردد المنخفض........
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وقد تلقى الدكتور بيرغر رسوم الاستشارات وتمويل البحوث من مؤسسة الطب، وهي شركة تشخيص السرطان.
شكر وتقدير
نشكر الدكتور أغنيس فيالي ومختبر علم الجينوم MSKCC الأساسية للحصول على المساعدة الفنية. وقد تم تطوير هذا البروتوكول بدعم من مركز أبحاث السرطان Beene جيفري ومؤسسة مزارع العائلة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| وحدة إصلاح نهاية NEBNext | نيو إنجلاند Biolabs | E6050L | & nbsp ؛ |
| NEBNext dA-Tailing Module | New England Biolabs | E6053L | & nbsp ؛ |
| NEBNext وحدة ربط سريع | نيو إنجلاند Biolabs | E6056L | & nbsp ؛ |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter Genomics | ||
| NEXTflex الباركود الخالي من PCR – 24 | Bioo Scientific | 514103 | |
| طقم تضخيم مكتبة HiFi | KAPA Biosystems | KK2612 | |
| COT الحمض النووي البشري ، تشخيص روش الصف الفلورومتري | 05 480 647 001 | ؛ | |
| NimbleGen SeqCap EZ مجموعة التهجين والغسيل | Roche NimbleGen | 05 634 261 001 | |
| SeqCap EZ Library Baits | Roche NimbleGen | ||
| طقم تنقية QIAquick PCR | Qiagen | 28104 | |
| Qubit dsDNA مجموعة فحص واسعة النطاق (BR) | تقنيات الحياة | Q32850 | |
| كيوبيت dsDNA عالية الحساسية (HS) مجموعة | تقنيات الحياة | Q32851 | |
| Agilent DNA HS Kit | Agilent Technologies | 5067-4626, 4627 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
| Covaris E220 | Covaris | ||
| حامل مغناطيسي - 96 | Ambion | AM10027 | |
| Illumina مرحبا Seq 2000 | Illumina |
المراجع
- Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. The cancer genome. Nature. 458 (7239), 719-724 (2009).
- Meyerson, M., Gabriel, S., Getz, G. Advances in understanding cancer genomes through second-generation sequencing. Nat. Rev. Genet. 11 (10), 685-696 (2010).
- Thomas, R. K., Baker, A. C....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
