يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

مقايسة نوكلياز خارجي قائم على التألق لتوصيف DmWRNexo ، تقويم العظام لنوكاز خارجي WRN البشري ، وتطبيقه على النوكليازات الأخرى

4.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/50722

⸱

ديسمبر 23, 2013

 ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Oxford

في هذه المقالة

ملخص

تلعب نوكلياز خارجي أدوارا حاسمة في ضمان استقرار الجينوم. يؤدي فقدان وظيفة نوكلياز خارجي WRN إلى الشيخوخة المبكرة. يمكن أن تساعد دراسة الركائز والمتطلبات الأخرى للنوكلياز في المختبر في توضيح دوره في الجسم الحي. نوضح هنا اختبارا سريعا وقابلا للتكرار قائما على التألق لقياس نشاط النوكلياز.

الملخص

يشارك نوكلياز خارجي < p class = "jove_content" > WRN في حل تلف الحمض النووي الذي يحدث إما أثناء تكرار الحمض النووي أو بعد التعرض للسموم الجينية الداخلية أو الخارجية. من المحتمل أن يلعب دورا في منع تراكم المواد الوسيطة المؤتلفة التي قد تتراكم في شوكات النسخ المتماثل المتوقفة بشكل عابر ، بما يتفق مع النمط الظاهري المفرط المؤتلف للخلايا التي تفتقر إلى WRN. في البشر ، يشتمل مجال نوكلياز خارجي على جزء طرفي N من بروتين أكبر بكثير يمتلك أيضا نشاط الهليكاز ، جنبا إلى جنب مع مواقع إضافية مهمة لتفاعل الحمض النووي والبروتين. على النقيض من ذلك ، في ذبابة الفاكهة ، يتم ترميز نشاط نوكلياز خارجي ل WRN (DmWRNexo) بواسطة موضع جيني مميز من الهليكاز المفترض ، مما يسمح بالتشريح الكيميائي الحيوي (والجيني) لدور نشاط نوكلياز خارجي في آليات استقرار الجينوم. هنا ، نوضح طريقة الفلورسنت لتحديد نشاط نوكلياز خارجي WRN باستخدام DmWRNexo المؤتلف المنقى وقليل النوكليوتيدات الفلورية ذات العلامات النهائية. يسمح هذا النظام بقابلية استنساخ أكبر من المقايسات المشعة حيث تظل قليل النوكليوتيدات الركيزة مستقرة لعدة أشهر ، ويوفر طريقة أكثر أمانا وسريعة نسبيا للتحليل التفصيلي لنشاط النوكلياز ، مما يسمح بتحديد قطبية النوكلياز ، والمعالجة ، وتفضيلات الركيزة.

المقدمة

تلعب النوكليازات دورا حيويا في الخلايا في إزالة الحمض النووي التالف ، وحل الهياكل غير المزدوجة مثل تقاطعات هوليداي وتوفير قدرة التدقيق اللغوي أثناء تكرار الحمض النووي ، سواء كانت جوهرية داخل بوليميرات الحمض النووي أو خارجية لها1. يمكن أن تعمل نوكليازات إما عن طريق تحلل الحمض النووي بالتتابع من الأطراف الحرة (نوكليازات خارجية) أو عن طريق شق روابط الفوسفوديستر الداخلية داخل جزيء الحمض النووي الأطول (نوكليازات داخلية). يمكن أن يؤدي فقدان نشاط نوكلياز إلى أنماط ظاهرية لعدم استقرار الجينوم محددة للغاية. في حين أن طفرة أحد أفراد عائلة RecQ helicase BLM تؤدي إلى معدلات عالية بشكل مفرط من تبادل الكروماتيد الشقيق ومعدلات السرطان المرتفعة عالميا (تمت مراجعتها بواسطة Payne and Hickson2) ، فإن طفرة بروتين WRN شديد الصلة تؤدي إلى الشيخوخة المبكرة3. يتمثل الاختلاف الرئيسي المهم بين هذين الفردين من العائلة في وجود مجال نوكلياز خارجي 3'-5 مع WRN4. تراكمت الأدلة على الدور الحاسم لنوكلياز خارجي WRN في الحفاظ على استقرار الجينوم من تحليل الأنماط الجينية في مرضى WS5 ، جنبا إلى جنب مع دراسات الطفرات النقطية والحذف في الخلايا البشرية ، مدعومة بدراسات بلورية لمجال نوكلياز خارجي المعزول6. ومع ذلك ، فإن التعاون والحديث المتبادل بين نشاط نوكلياز خارجي WRN ونشاط الهليكاز المركزي7 يجعل من الصعب التمييز بين وظائف كل منها ومساهماتها النسبية في استقرار الجينوم. في النباتات الميتازوان السفلية ، يوجد نشاط نوكلياز خارجي WRN على عديد ببتيد واحد يفتقر إلى نشاط الهليكاز8-10 (تمت مراجعته في Cox and Boubriak11) ؛ لقد ثبت كيميائيا حيويا في نبات الأرابيدوبسيس أن نوكلياز الإفرازات هذا يعمل بشكل منسق مع الهليكاز WRN المماثل ، مما يعيد بشكل فعال تكوين أنشطة الإنزيم المشتركة التي لوحظت في الفقاريات WRN9. لقد درسنا نوكلياز خارجي WRN في ذبابة الفاكهة لأن الأدوات الجينية الممتازة تسمح بتحليل تأثير طفرة نوكلياز خارجي (دون التأثير على الهليكاز المماثل المفترض) على مستوى الكائن الحي بأكمله ومن خلال التطور10،12. علاوة على ذلك ، قمنا باستنساخ والتعبير عن وتنقية ذبابة الفاكهة WRN exonclolease (DmWRNexo) مما يسمح بالتحليل الكيميائي الحيوي الكامل لخصائصه الإنزيمية13،14.

< p class = "jove_content" > تم إجراء تحليل Nuclease في المختبر تقليديا باستخدام قليل النوكليوتيدات ذات العلامات الإشعاعية ، وتقييم التحلل من خلال البحث عن سلالم المنتجات على المواد الهلامية للأكريلاميد4،8،15. على الرغم من حساسيتها ، إلا أن هذه المقايسات ليست قابلة للتكرار كميا يوما بعد يوم بسبب الاضمحلال الإشعاعي للركائز المصنفة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن مناولة الكواشف المشعة والتخلص منها تطرح قضايا بيئية وصحية كبيرة. كما أصبح الحصول على الملصقات الراديوية مشكلة متزايدة. تقوم طريقة بديلة حديثة بتقييم كمية ناتج التحلل النهائي بواسطة قياس الطيف الكتلي16. ومع ذلك ، فهي تستغرق وقتا طويلا (تستغرق عدة أيام) ، وتتطلب معدات متخصصة ، والقراءة هي كمية المنتج النهائي (النيوكليوتيدات المفردة) لذلك فهي غير مناسبة للقياس الحساس لجوانب مثل معالجة الإنزيم أو لتحديد ما إذا كانت بعض النيوكليوتيدات أو التسلسلات أو التعديلات تؤدي إلى توقف النوكلياز مؤقتا أو توقفه. للتغلب على هذه المشاكل ، قمنا بتكييف المقايسات التقليدية القائمة على الهلام للاستخدام مع ركائز قليل النوكليوتيدات الفلورية ، مما يولد ركائز ذات علامات ثابتة يمكن استخدامها بشكل متكرر على مدى فترات زمنية طويلة وبالتالي السماح بالمقارنة المباشرة لأنشطة النوكلياز في ظل ظروف مختلفة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحضير قليل النوكليوتيدات الركيزة

  1. تجميع قليل النوكليوتيدات المخصصة.
    1. صمم قليل النوكليوتيد أحادي الشريطة مع جزيء فلورسين مترافق 5 بوصات ؛ سيكون هذا هو العمود الفقري لكل ركيزة. (لاحظ أن هذا مخصص لانوكالاز خارجي 3'-5 '؛ بالنسبة للنوكلياز الخارجي القطبي 5'-3' ، استخدم خيط العمود الفقري المترافق 3'). إذا كانت القطبية غير معروفة ، فيجب اختبار كل من 3 و 5.
    2. صمم خيوطا تكميلية بحيث عندما يتم صلبها إلى قليل النوكليوتيد المسمى بالفلورسنت ، يتم تشكيل ركيزة (ركيزة) مزدوجة الاختيار. لاحظ أن الخيط التكميلي لا يترافق مع الفلوروفور. عند الطلب ، حدد تنقية الصفحة (تحلية المياه ليست كافية).
    3. قم بتخزين مخزونات قليل النوكليوتيدات المخزنة في 10 ملي مولار عند 1 نانومول / ميكرولتر عند -20 درجة مئوية وفي الظلام.
  2. امزج العمود الفقري المسمى قليل النوكليوتيد مع كل قليل النوكليوتيد التكميلي غير المسمى في نسبة مولارية 1: 1.2 من المسماة: غير المسمى في المخزن المؤقت (10 ملي مولار Tris-HCl الرقم الهيدروجيني 7.6 ، 1 ملي مولار EDTA الرقم الهيدروجيني 8.0 ، 50 ملي كلوريد الصوديوم). (ملاحظة: نسبة 1: 1 هي الأكثر رغبة ولكن الأهم من ذلك أن تكون جميع الخيط المسمى مرتبطة. يمكن أن تعمل نسب 1: 1 - 1: 1.5.)
  3. سخني حمام مائي أو كتلة حرارية إلى 95 درجة مئوية وضعي خليط التلدين فيه لمدة 3 دقائق ثم أطفئيه واتركيه يبرد ببطء (1 درجة مئوية / دقيقة) إلى أقل من 30 درجة مئوية.
  4. تحقق من التلدين الكامل لقليل النوكليوتيد المسمى عن طريق تشغيل الركيزة المزدوجة الناتجة على هلام بولي أكريلاميد أصلي بنسبة 10٪ (10٪ 19: 1 أكريلاميد: bis-acrylamide في 1x Tris-Borate-EDTA (TBE ، 89 ملي ملي قاعدة تريس ، 89 ملي حمض البوريك ، 2 ملي مولار EDTA) مبلمرة مع 0.05٪ وزن / حجم بيرسلفات الأمونيوم (APS) و 0.005٪ حجم / حجم TEMED). تصور عبر PhosphorImager (انظر القسم 5 أدناه).
فئة

2. تحضير المواد الهلامية الأكريلاميد

  1. قم بإعداد نظام صب الهلام ، على سبيل المثال جهاز الصب الهلامي Hoefer SE400 بألواح 16 سم × 18 سم وفواصل 1.5 مم.
    1. نظف الألواح الزجاجية والفواصل جيدا باستخدام المنظفات والماء. ارتد قفازات نظيفة لتجنب إعادة تلطيخ الألواح بالزيت من الأصابع ، مما قد يعيق تكوين الجل المتسق.
    2. اشطف الأطباق بالكثير من الماء المقطر (منزوع الأيونات) لإزالة بقايا المنظفات، ثم امسحها بمنديل خال من النسالة (مثل Kimwipes).
    3. أخيرا ، رش بنسبة 70٪ من الإيثانول وامسح - يجب أن تصدر الألواح الزجاجية صريرا إذا كانت نظيفة. توضع جانبا في وضع مستقيم للسماح لآخر مادة من الإيثانول بالتبخر.
    4. نظف باقي معدات تشكيل الجل بالماء المقطر (استخدم المنظف أولا إذا لزم الأمر) وجففها.
    5. قم بتجميع الألواح الزجاجية والفواصل في جهاز تشكيل الهلام ، مع التأكد من أن النظام مانع للتسرب.
  2. تحضير محلول الجل إلى نسبة البولي أكريلاميد المرغوبة
    1. لمقايسة النوكلياز ، استخدم المواد الهلامية متعددة الأكريلاميد التي تغير طبيعة 14٪ مع 8 M اليوريا في 1x TBE.
    2. لصنع 100 مل (يكفي ل 2 المواد الهلامية مع الكثير من الفائض للتسرب) خذ 48.05 جم من اليوريا في دورق عريض وأضف 35 مل 40٪ 19: 1 محلول أكريلاميد و 10 مل 10x TBE (890 ملي تريس ، 890 ملي حمض البوريك ، 20 ملي EDTA ، درجة الحموضة 8.3 مع هيدروكسيد الصوديوم). تنبيه: ارتد القفازات - الأكريلاميد هو سم عصبي قوي. قم بإذابة اليوريا باستخدام شريط التحريك ولوحة التحريك المغناطيسية (سيستغرق ذلك بعض الوقت).
    3. عند الذوبان ، أضف الماء منزوع الأيونات مللي كيو إلى 100 مل. قم بالترشيح والتعقيم باستخدام غشاء 0.22 ميكرومتر. إذا لم يتم استخدامه على الفور ، فقم بإزالة الغاز لفترة وجيزة باستخدام معدات الشفط وتخزينه في الظلام (سيحتفظ به بضعة أيام). لا تقم بتبريدها لأن اليوريا ستترسب
  3. بلمرة وصب الجل.
    1. خذ اليوريا أكريلاميد وأضف 0.5 مل 10٪ (وزن / حجم) بيرسلفات الأمونيوم (APS ، مكون من الماء المقطر) و 50 ميكرولتر TEMED. قم بتدوير الحاوية ببطء حتى تختلط دون نقل الهواء (الذي يمنع البلمرة) واسكبها في الجل السابق. تصرف بسرعة وإلا فقد يتماسك الجل قبل الانتهاء من الصب.
    2. أضف المشط المناسب لتشكيل آبار لتحميل العينات (يتم اختياره وفقا لجهاز الجل ورقم العينة المراد تحليله ، على سبيل المثال ، أمشاط 15 أو 29 سنا مناسبة للاستخدام مع جهاز هلام هوفر). تأكد من عدم إدخال فقاعات هواء تحت أسنان المشط.
    3. اتركيه للضبط. مراقبة التسرب. يتم تأخير البلمرة الكاملة في الأمشاط بسبب ملامسة الغلاف الجوي. عندما تكون الآبار صلبة ، سيتم ضبط باقي الجل.
    4. قم بإزالة الأمشاط واشطف مادة الأكريلاميد غير المبلمرة باستخدام الماء والماصة.
  4. قم بإعداد الجل للجري.
    1. اضبط الجل المصبوب في نظام تشغيل الجل وأضف الكمية المناسبة من 1x TBE تشغيل المخزن المؤقت في الغرفة السفلية وفي آبار الجل. الجل جاهز الآن للتحميل.
فئة < ص = "jove_title" >3. تحضير بروتين DmWRNexo المؤتلف الموسومة

  1. التعبير البكتيري لبروتين DmWRNexo
    1. باستخدام حلقة التلقيح ، اجمع البكتيريا عن طريق الكشط على سطح مخزون الجلسرين الذي يتم الاحتفاظ به عند -80 درجة مئوية (البكتيريا هي الإشريكية القولونية T7 Iq LysY (NEB) التي تم تحويلها باستخدام pIVEX2.3d-DmWRNexo). ضع على ألواح LB-agar (10 جم من التربتون ، 5 جم من مستخلص الخميرة ، 5 جم كلوريد الصوديوم ، 15 جم أجار مصنوع حتى 1 لتر بالماء المقطر ودرجة الحموضة المعدلة إلى 7.4) مع 50 ميكروغرام / مل أمبيسلين. احتضان مقلوب بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.
    2. اختر مستعمرة واحدة من الطبق إلى 50 مل رطل (10 جم من التربتون ، 5 جم من مستخلص الخميرة ، 5 جم كلوريد الصوديوم المكون حتى 1 لتر بالماء المقطر) مع 50 ميكروغرام / مل أمبيسلين (مصنوع من الماء ومعقم بالترشيح حتى 0.22 ميكرومتر). تنمو مع الاهتزاز عند 220 دورة في الدقيقة 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    3. تلقيح 1.8 لتر (حصة 600 مل لكل منها في ثلاث قوارير مخروطية سعة 2 لتر لضمان التهوية الكافية) من LB-ampicillin مع ثقافة 50 مل بين عشية وضحاها وتنمو إلى OD600 ~ 0.8. أضف IPTG إلى التركيز النهائي البالغ 0.7 ملي مولار واحتضنه عند 26 درجة مئوية (لمنع تراكم البروتين) مع الرج لمدة 4-8 ساعات.
    4. احصد حبيبات الخلية عن طريق الطرد المركزي عند 8,000 دورة في الدقيقة 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق - استخدم زجاجات طرد مركزي بلاستيكية معقمة 6 × 500 مل مع تعليق خلية 300 مل في كل منها. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات بحجم صغير (10 مل) من LB-amp الأصلي ، وانقله إلى أنبوب فالكون سعة 15 مل ثم أعد تدويره بسرعة 5,000 دورة في الدقيقة لحبيبات الخلايا - قم بإزالة المادة الطافية مرة أخرى وتجميدها عند -80 درجة مئوية (هذا يساعد في التحلل).
  2. تحلل الخلايا البكتيرية
    1. يتكون من 3.2 مل من محلول التحلل يحتوي على 1 مل 5 M كلوريد الصوديوم ، 1 مل 1 M DTT ، 200 ميكرولتر 1 م بنزاميد و 1 مل 10 مجم / مل ليزوزيم (معلق في الماء المقطر).
    2. إلى كل حبيبات مشتقة من 300 مل معلق بكتيري ، أضف 320 ميكرولتر محلول تحلل. أعد التعليق قدر الإمكان - استخدم طرف p1000 "منشور" وحركه بالإضافة إلى سحب العينة لأعلى ولأسفل. احتضن على الثلج لمدة 20 دقيقة. أضف 100 ميكرولتر إضافيا من محلول التحلل واخلطه جيدا ثم انقل أكبر قدر ممكن من المحللة المعلقة إلى أنبوب ميكرو فوج (سيكون لزجا جدا ويصعب ماصته).
    3. قم بالطرد المركزي للمحللات عند 14,000 دورة في الدقيقة في دوار ميكرو مبرد مسبقا عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة ، ثم خذ المادة الطافية إلى أنبوب ميكرو فوج نظيف: يحتوي على البروتين المؤتلف.
  3. تنقية فخ
    1. تحضير الكواشف: قم بتسمية 5 أنابيب ميكروفيج لكل تركيز من الإيميدازول التالية: 40 ملي مولار ، 60 ملي مولار ، 100 ملي مولار ، 300 ملي مولار ، 500 ملي مولار (مثل الملصق 40-1 ، 40-2 ، 40-3 ، إلخ) ، والتي سيتم استخدامها لجمع كسور العمود. قم بتخزين الأنابيب على الثلج في رف مع أغطية مفتوحة (ولكن قم بتغطيتها بشكل غير محكم بغشاء بلاستيكي أو ما شابه ذلك للحفاظ على نظافتها أثناء تحضير كل شيء آخر). اصنع 25 مل من 20 ملي مولار إيميدازول و 10 مل من كل تركيز آخر من الإيميدازول في أنابيب عالمية سعة 25 مل ، باستخدام 1x PBS (8 جم كلوريد الصوديوم ، 0.2 جم كلوريد كلوريد ، 1.44 جم Na2HPO4 ، 0.24 جم KH2PO4 ، درجة الحموضة المعدلة إلى 7.4 ومكونة من 1 لتر بالماء المقطر) كمخفف.
    2. اضبط المحللة البكتيرية على 20 ملي مولار إيميدازول باستخدام حجم مناسب من محلول مخزون إيميدازول 2 م ، واضبط الحجم على 1 مل على الأقل (<5 مل) باستخدام 20 ملي مولار إيميدازول.
    3. اغسل عمود His-Trap سعة 1 مل (Amersham) ب 10 مل من ماء MilliQ باستخدام حقنة سعة 5 أو 10 مل بقفل Luer وضغط يدوي لطيف ، ثم قم بموازنة العمود بالمرور عبر 10 مل من 20 ملي مولار إيميدازول مكون في PBS (انظر الخطوة 3.3.1 أعلاه).
    4. قم بتحميل المحللة على العمود. عندما يتم تحميل المحللة على العمود ، قد يتم اختبار ضغط خلفي كبير. هذا طبيعي تماما. لا تميل إلى تطبيق الكثير من القوة على المحقنة ، والحفاظ على ضغط ثابت متساو. من المعتاد رؤية تغير خفيف في اللون عند دخول المحللة إلى العمود. اجمع التدفق في زجاجة Sterilin bijou (سعة 7 مل) واحفظها على الثلج.
    5. اغسل العمود ب 10 مل من 20 ملي إيميدازول واجمعه في أنبوب عالمي سعة 25 مل على الثلج ، يسمى "غسل".
    6. مرر 5 مل من 40 ملي مولار إيميدازول عبر العمود ، واجمع 1 مل من الأجزاء في كل من أنابيب الطرد الدقيق (المسمى 40.1 ، 40.2 ، 40.3 ، إلخ): راقب مكبس المحقنة بعناية لأن هذا يسمح بقياس 1 مل.
    7. الآن تمر بالتتابع عبر 5 مل من كل من 60 ملي مولار ، و 100 ملي مولار ، و 300 ملي مولار ، و 500 ملي مولار إيميدازول ، وتجمع مرة أخرى 5 × 1 مل كسور عند كل تركيز ملح.
  4. تحليل كسور العمود
    1. لطخة نقطية: ضع نقطة 2 ميكرولتر من كل جزء عمودي (وكذلك التحميل والتدفق من خلال وغسل) على ورقة من النيتروسليلوز - يكون من الأسهل إذا تم وضع ذلك مسبقا بشبكة باستخدام قلم رصاص ناعم). اتركيه ليجف في الهواء. قم بمعالجة اللطخة النقطية عن طريق الحظر لمدة 15 دقيقة إلى ساعة واحدة في 5٪ حليب مجفف خالي الدسم مكون من PBS مع 0.2٪ v / v Tween 20 ، ثم اغسلها في PBS-Tween عدة مرات واحتضانها بالجسم المضاد HRP-anti-his المخفف 1: 500 في PBS-Tween لمدة 30-60 دقيقة. اغسل على نطاق واسع باستخدام PBS-Tween ثم PBS ، واكتشف الأجسام المضادة المرتبطة باستخدام التلألؤ الكيميائي المحسن (ECL) ، الذي تم تصوره على Hyperfilm MP. تعطي هذه اللطخة النقطية فكرة ممتازة عن كسور الذروة قبل تحليل SDS-PAGE ، ويمكن أن تبلغ خطوات التنقية اللاحقة إذا لزم الأمر (على سبيل المثال ، إذا كان استقرار البروتين يمثل مشكلة ، فمن الممكن تجميع كسور الذروة بناء على نتائج اللطخة النقطية والتحميل مباشرة على أعمدة ترشيح الهلام - انظر الخطوة 3.5 أدناه).
    2. SDS-PAGE: اجمع 50 ميكرولتر من كل جزء عمودي في أنبوب ميكروفيج مسمى يحتوي على 50 ميكرولتر 2x SDS-PAGE تحميل أصباغ (4٪ وزن / حجم SDS ، 20٪ حجم / حجم جلسرين ، 120 ملي مولار Tris-HCl pH 6.8 مع 200 ملي مولار DTT). قم بغلي هذه العينات لمدة 5 دقائق عند 95-100 درجة مئوية (لاحظ في حالة استخدام كتلة ساخنة بدون غطاء ساخن ، قم بعمل ثقب صغير في غطاء كل أنبوب بإبرة حقنة ضيقة لمنع "انفجار" الأنابيب أثناء تسخينها). قم بتشغيل 10٪ SDS-PAGE minigels لتحميل 10 ميكرولتر من كل جزء عمودي وصمة عار باللون الأزرق اللامع Coomassie للتحقق من الكسور القصوى ونقاء البروتين. إذا لزم الأمر ، من الممكن أيضا لطخة غربية للبروتين الموسوم به عن طريق نقل البروتينات المفصولة بواسطة SDS-PAGE على النيتروسليلوز. قم بسد الأغشية بنسبة 5٪ من الحليب الخالي من الدسم في PBS-0.2٪ Tween 20 ، ثم اغسلها وفحصها باستخدام الجسم المضاد المضاد المترافق ب HRP (1: 500) كما هو الحال بالنسبة للبقعة النقطية.
  5. لزيادة النقاء ، يمكن تجميع أجزاء الذروة من عمود المصيدة الخاصة به وتحميلها على عمود ترشيح هلام Superdex 75 مع الشطف في زيادة الملح (كما هو موضح سابقا Boubriak et al.13 وماسون وآخرون. 14).
< p class = "jove_title" >4. فحص Nuclease

  1. اصنع مخزون عمل من ركائز.
    1. استخدم 20 ركيزة ملي مول لكل تفاعل (على الرغم من أن هذا يمكن أن يختلف وفقا للسؤال المراد معالجته) لذا فإن مخزون العمل المناسب هو 200 pmol / μl (أي 10x). تتكون مخزونات العمل بكميات صغيرة من محلول التلدين (10 ملي مولار Tris-HCl pH7.6 ، 1 ملي مولار EDTA الرقم الهيدروجيني 8.0 ، 50 ملي كلوريد الصوديوم) أو في 10 ملي مولار Tris-HCl الرقم الهيدروجيني 7.0 (حتى الرقم الهيدروجيني 8.5 ، وفقا للنوكلياز) بدون ملح أو EDTA ، وفقا لحساسية الإنزيم أو الفحص الذي سيتم إجراؤه.
    2. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية وفي الظلام (ملفوفة بورق الألمنيوم). تدوم الركائز لعدة أسابيع دون فقدان سلامة الإرسال المزدوج أو إشارة الفلورسنت.
  2. فحص تركيز بروتين نوكلياز خارجي عن طريق التحليل اللوني ، أو قياس الطيف فوق البنفسجي عند ABS260.
    1. يحفظ في كميات صغيرة عند -80 درجة مئوية.
    2. إذا تم تجميد / إذابة العينات مرة واحدة ، افترض معدل طي البروتين الخاطئ بنسبة 5٪ (أو حدد تجريبيا لكل بروتين سيتم فحصه) واضبط التركيزات وفقا لذلك.
    3. تخلص من البروتينات لفحص نشاط نوكلياز خارجي بعد دورتين للتجميد / الذوبان ، ولاحظ حالة البروتين لكل تجربة.
  3. تصميم التجربة والعمل على كميات المزيج الرئيسي (MM) للعينات.
    1. اصنع MM يحتوي على جميع المكونات المشتركة في العينات التي يتم اختبارها (عادة كل شيء باستثناء الإنزيم أو الركيزة) لتقليل التباين بين العينات.
    2. اسمح بخطأ سحب العينة عند تكوين MM ، على سبيل المثال حساب أحجام العينات N عن طريق عمل ما يكفي لعينات (N + 0.1N).
    3. قم بإعداد تفاعلات بحجم إجمالي قدره 20 ميكرولتر / عينة ، تحتوي على 1 ميكرومول من الإنزيم و 20 ملي مول من الركيزة (كافتراضي قبل التحسين - من الواضح أن الكميات تختلف وفقا لما يتم اختباره ، على سبيل المثال تغيير كمية الإنزيم في حالة اختبار تأثير تركيز الإنزيم). بالنسبة إلى DmWRNexo ، تم العثور على المخزن المؤقت الأمثل لنشاط النوكلياز تجريبيا لاحتوائه على 40 ملي مولار Tris-HCl درجة الحموضة 8.0 ، 4 ملي مولار MgCl2 ، 5 ملي مولار ديثيوثريتول ، مع 0.1 مجم / مل من درجة البيولوجيا الجزيئية BSA.
  4. إعداد ردود الفعل.
    1. احتفظ بجميع الكواشف عند 4 درجات مئوية (دلو ثلج أو برد).
    2. قم بتكوين مزيج رئيسي وكمية كبيرة في العدد المناسب من أنابيب الطرد الدقيق المعقمة الخالية من DNase سعة 0.5 مل. قم بتضمين عنصر تحكم بدون إنزيم لتصور الركيزة الأولية (تحكم غير متدهور).
    3. اضبط كتلة حرارية على درجة الحرارة المناسبة لنشاط الإنزيم (37 درجة مئوية ، مع نقطة زمنية نهائية تبلغ 30 دقيقة كانت مثالية ل DmWRNexo على الرغم من أن ذلك قد يحتاج إلى تحديد تجريبيا من خلال مقارنة نشاط الإنزيم المختار في مجموعة من درجات الحرارة والأوقات). يجب اختبار مثبطات الإنزيم المحتملة الموجودة عادة في المخازن المؤقتة بعناية (على سبيل المثال ، تمنع EDTA DmWRNexo ، كما يفعل ATP14 الزائد ، على الأرجح عن طريق استخلاب Mg2+ الحرج لنشاط النوكلياز). لاحظ أنه حتى التركيزات العالية من الإيميدازول (>300 مللي مولار) ليس لها أي تأثير على نشاط إنزيم DmWRNexo ولا تطفئ التألق.
    4. محلول STOP المكياج (80٪ فورماميد ، 1x TBE). هذا عند 3x. قد يحتوي هذا على أصباغ مثل البروموفينول الأزرق إذا لزم الأمر. تخزين في RT.
    5. قم بإعداد ما يلي بالقرب من الكتلة الحرارية: الكاشف (الكاشفات) النهائي الذي سيتم إضافته إلى مزيج التفاعل (عادة الإنزيم) ؛ ماصة وأطراف 1-10 ميكرولتر ، ومؤقت ، ودلو ثلج ، ومحلول STOP.
  5. ابدأ رد الفعل.
    1. اضبط المؤقت عند إضافة الإنزيم إلى الأنبوب الأول. ضع الأنبوب في الكتلة الحرارية.
    2. استمر في إضافة الإنزيم إلى بقية الأنابيب على فترات مناسبة. (15 ثانية كافية للتفاعلات البسيطة التي لا تتطلب سوى حل STOP لإكمالها). ضعها في كتلة حرارية بمجرد إضافة الإنزيم.
  6. أوقف رد الفعل.
    1. عندما يصل المؤقت إلى الوقت الصحيح (على سبيل المثال 15 دقيقة) أضف محلول STOP سعة 10 ميكرولتر إلى العينة الأولى واخلطه عن طريق سحب العينات. ضعها على الفور على الثلج / في الثلاجة.
    2. استمر في إيقاف التفاعلات في الفترات الزمنية المناسبة وبنفس الترتيب الذي تم إعداده بحيث يكون لكل تفاعل نفس وقت الحضانة بالضبط.
  7. العينات جاهزة الآن للتحميل على جل تغيير الطبيعة المحضر.
    1. قم بتحميل نصف (أو كل) كل عينة باستخدام أطراف تحميل الهلام للحصول على سحب دقيق للسحب الدقيق. عند مستويات قليل النوكليوتيد المستخدمة في التفاعل ، سيعطي نصف التفاعل ناتجا جيدا للتصور ويسمح بتشغيل التكرار (على سبيل المثال إذا لم يعمل الهلام الأولي بشكل صحيح).
    2. من الملائم تحميل محلول 1x STOP الذي يحتوي على صبغة (مثل البروموفينول الأزرق) في ممر واحد أو أكثر للتأكد من كيفية تشغيل الجل.
    3. يمكن تشغيل قليل النوكليوتيدات الفلورية ذات الأحجام المعروفة جنبا إلى جنب مع العينات كعلامة للحجم.
  8. قم بتشغيل الجل.
    1. أضف الغرفة العازلة العلوية للتشغيل إلى جهاز الجل واملأها بمخزن مؤقت للتشغيل (1x TBE) ، مع التأكد من عدم إزعاج العينات. تحقق من وجود تسرب في المخزن المؤقت.
    2. قم بتوصيل جهاز الجل بمصدر طاقة وقم بتشغيله عند 200 فولت (جهد ثابت) لمدة 150-200 دقيقة أو حتى تصبح الصبغة الزرقاء البروموفينول (في حالة الاستخدام) حوالي ثلثي الطريق أسفل الجل (تعمل حول مستوى 10nt DNA في هذه النسبة المئوية من الهلام). راقب تسرب المخزن المؤقت ، والذي يمكن أن يحرف أو يمنع الانفصال.
    3. أوقف الجل وقم بإزالته من جهاز التشغيل.
فئة

5. تحليل الهلام والتصوير

  1. حدد حساسية جهاز التصوير المراد استخدامه ، على سبيل المثال يمكن ل Fuji FLA-3000 PhosphorImager / Fluorescence Imager اكتشاف تألق الفلورسين باستخدام ليزر أزرق 473 نانومتر ، باستخدام أكبر إعداد حساسية له يبلغ F1000 وأصغر قراءة بكسل (دقة) تبلغ 50 ميكرومتر.
  2. امسح الجل.
    1. قم بإزالة الفواصل ولوحة هلام واحدة بعناية. اشطف الجل المتبقي على لوحة الجل الأخرى جيدا (ولكن بعناية) لإزالة آثار اليوريا المترسبة التي ستتداخل مع المسح الضوئي.
    2. ضع اللوحة (مع استمرار الجل متصلا) على الوجه الزجاجي لحامل الجل وضعها في التصوير. لاحظ إحداثيات الجل على الزجاج (إذا لم يملأ السطح بالكامل).
    3. افتح البرنامج المناسب على الكمبيوتر المتصل وافحص المنطقة الملحوظة من منطقة المسح حيث يوجد الجل. استخدم أفضل الشروط المحددة كما في الخطوة 5.1. سيكون الملف الناتج كبيرا نسبيا (عدة ميغابايت) ولكن يمكن اقتصاص الصورة وضغطها إذا لزم الأمر.
    4. احفظ ، ثم قم بالتصدير كملف يمكن قراءته بواسطة برنامج التحليل ، على سبيل المثال التصدير ك.tiff للتحليل باستخدام ImageJ.
  3. تحليل البيانات.
    1. سيؤدي اختبار نوكلياز خارجي ناجح إلى تدهور الركيزة بالتتابع على طول قليل النوكليوتيد باتجاه الفلوروفور ، مما يؤدي إلى نمط مميز يشبه السلم لشظايا الحمض النووي الفلوري على الجل. الأنواع ذات القدرة العالية على الحركة على الجل (والتي تعمل أبعد من ذلك) أصغر من ركيزة البداية غير المتدهورة وبالتالي تمثل منتجات تحلل نوكلياز خارجي.
    2. استخدم أداة "المواد الهلامية" في ImageJ لتحديد الشدة النسبية للأنواع في كل حارة تعتمد على حركتها ، من أجل تحديد مستويات التحلل وبالتالي نشاط نوكلياز خارجي في كل عينة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يتطلب إجراء تحليل in vitro لنشاط الإكسونوكلياز عدداً من الخطوات التحضيرية بالإضافة إلى التحليل الفعلي. يظهر موجز لهذه الإجراءات في الشكل 1.

قبل إجراء فحوصات الإكسونوكلياز القائمة على الفلورة، من الضروري تحسين عملية الكشف عن الركيزة قليلة النوكليوتيد الموسومة بالفلورة بعد الفصل على هلامات يوريا-أكريلاميد باستخدام نظام تصوير فلوري مناسب. ويعد اختيار المرشح أمرًا بالغ الأهمية لأن ذلك يمكن أن يؤثر بشكل ملحوظ على حساسية الفحص الإجمالية؛ حيث إن الركيزة قليلة النوكليوتيد لدي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يتطلب تحديد نشاط نوكلياز خارجي للبروتينات المنقاة تحليل منتجات انقسام الحمض النووي. يمكن تصور الانقسام المتسلسل للحمض النووي بواسطة نوكليازات الخارجية عن طريق فصل منتجات الانقسام الموسومة على المواد الهلامية الأكريلاميد. تاريخيا ، تضمن هذا وضع العلامات النهائية لركيزة الحمض النووي باستخدام ملصق راديوي (على سبيل المثال 32P أو 35S) ، ولكن مع العيوب الكامنة في استخدام الملصق الراديوي (التكلفة وقضايا السلامة وعدم الاستقرار بمرور الوقت). للتغلب على هذه المشاكل ، قمنا بتطوير مقايسة نوكلياز خارجي ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

نشكر برنامج ديناميكيات الشيخوخة الجديدة الشامل للمجلس لتمويل هذا العمل [ES/G037086/1] والبروفيسور ديف شيرات (قسم الكيمياء الحيوية، جامعة أكسفورد) للوصول إلى Fuji FLA-3000.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

Equipment< / strong>Hoefer SE400 Gel جهاز Hoefer SE400-15-1.5 FLA-3000 (الفوسفور والفلورة قارئ صور
قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
كاشف / مادة < / قوي >
قليل النوكليوتيدات المخصصةEurogentecمن الضروري الحصول عليها بدرجة نقاء عالية < > على سبيل المثال < / em> مع تنقية PAGE.
5'FLOfluoresescein-5' GAACTATGGCTCTC
GAGTGCTAGGACATGTCTGA
CTACGTACAAGTCACC - 3'bubble
5'- GGTGACTTGTACGT
AGTCAGACATGTCCTAGCAC
TCGAGAGCCATAGTTC-3'40
٪ 19: 1 محلول أكريلاميدSevern Biotech20-2400-05تنبيه: سم عصبي قوي لذا يجب ارتداء القفازات في جميع الأوقات
أعمدة His-Trap (1 مل)GE Healthcare17-5247-01
جميع الكواشف الأخرىأي مورددرجة البيولوجيا الجزيئية ضرورية (خالية من DNase) ؛ يجب أن تكون أنابيب الطرد الدقيق بالمثل خالية من DNase و RNase
تصوير)فوجي
V2.02مقياس صورة فوجي فيلم
V3.3فوجي فيلم
حسن السمعة < td colspan = "4" >

المراجع

  1. Mason, P. A., Cox, L. S. The role of DNA exonucleases in protecting genome stability and their impact on ageing. Age (Dordr. 34, 1317-1340 (2012).
  2. Payne, M., Hickson, I. D. Genomic instability and cancer: lessons from analysis of Bloom's syndrome). Biochem. Soc. Trans. 37, 553-559 (2009).
  3. Yu, C. E., Oshima, J., Fu, Y. H., Wijsman, E. M., Hisama, F., Alisch, R., Matthews, S., Nakura, J., Miki, T., Ouais, S., et al. Positional cloning of the Werner's syndrome gene. Science. 272, 258-262 (1996).
  4. Huang, S., Li, B., Gray, M. D., Oshima, J., Mian, I. S., Campisi, J. The premature ageing syndrome protein, WRN, is a 3'-->5' exonuclease. Nat. Genet. 20, 114-116 (1998).
  5. Goto, M. Syndrome-causing mutations in Werner syndrome. Biosci. Trends. 2, 147-150 (2008).
  6. Perry, J. J., Yannone, S. M., Holden, L. G., Hitomi, C., Asaithamby, A., Han, S., Cooper, P. K., Chen, D. J., Tainer, J. A. WRN exonuclease structure and molecular mechanism imply an editing role in DNA end processing. Nat. Struct. Mol. Biol. 13, 414-422 (2006).
  7. Opresko, P. L., Laine, J. P., Brosh, R. M., Seidman, M. M., Bohr, V. A. Coordinate action of the helicase and 3' to 5' exonuclease of Werner syndrome protein. J. Biol. Chem. 276, 44677-44687 (2001).
  8. Plchova, H., Hartung, F., Puchta, H. Biochemical characterization of an exonuclease from Arabidopsis thaliana reveals similarities to the DNA exonuclease of the human Werner syndrome protein. J. Biol. Chem. 278, 44128-44138 (2003).
  9. Hartung, F., Plchova, H., Puchta, H. Molecular characterisation of RecQ homologues in Arabidopsis thaliana. Nucleic Acids Res. 28, 4275-4282 (2000).
  10. Saunders, R. D., Boubriak, I., Clancy, D. J., Cox, L. S. Identification and characterization of a Drosophila ortholog of WRN exonuclease that is required to maintain genome integrity. Aging Cell. 7, 418-425 (2008).
  11. Cox, L. S., Boubriak, I. DNA Instability in Premature Aging, in DNA Damage Repair, Repair Mechanisms and Aging. Thomas, A.E., Eds. Nova Science Publishers. , 1-34 (2010).
  12. Cox, L. S., Clancy, D. J., Boubriak, I., Saunders, R. D. Modeling Werner Syndrome in Drosophila melanogaster: hyper-recombination in flies lacking WRN-like exonuclease. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1119, 274-288 (2007).
  13. Boubriak, I., Mason, P. A., Clancy, D. J., Dockray, J., Saunders, R. D., Cox, L. S. DmWRNexo is a 3'-5' exonuclease: phenotypic and biochemical characterization of mutants of the Drosophila orthologue of human WRN exonuclease. Biogerontology. 10, 267-277 (2009).
  14. Mason, P. A., Boubriak, I., Robbins, T., Lasala, R., Saunders, R., Cox, L. S. The Drosophila orthologue of progeroid human WRN exonuclease, DmWRNexo, cleaves replication substrates but is inhibited by uracil or abasic sites : Analysis of DmWRNexo activity in vitro. Age (Dordr). , (2012).
  15. Machwe, A., Xiao, L., Orren, D. K. Length-dependent degradation of single-stranded 3' ends by the Werner syndrome protein (WRN): implications for spatial orientation and coordinated 3' to 5' movement of its ATPase/helicase and exonuclease domains. BMC Mol. Biol. 7, 6 (2006).
  16. Mangerich, A., Veith, S., Popp, O., Fahrer, J., Martello, R., Bohr, V. A., Burkle, A. Quantitative analysis of WRN exonuclease activity by isotope dilution mass spectrometry. Mech. Ageing Dev. 133, 575-579 (2012).
  17. Xue, Y., Ratcliff, G. C., Wang, H., Davis-Searles, P. R., Gray, M. D., Erie, D. A., Redinbo, M. R. A minimal exonuclease domain of WRN forms a hexamer on DNA and possesses both 3'- 5' exonuclease and 5'-protruding strand endonuclease activities. Biochemistry. 41, 2901-2912 (2002).
  18. Machwe, A., Ganunis, R., Bohr, V. A., Orren, D. K. Selective blockage of the 3'-->5' exonuclease activity of WRN protein by certain oxidative modifications and bulky lesions in DNA. Nucleic Acids Res. 28, 2762-2770 (2000).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

DmWRNexo WRN DNA
مقايسة نوكلياز خارجي قائم على التألق لتوصيف DmWRNexo ، تقويم العظام لنوكاز خارجي WRN البشري ، وتطبيقه على النوكليازات الأخرى
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.