أعضاء من جنس بيركولديريا هي مسببات الأمراض ذات الأهمية السريرية. نحن تصف طريقة لاستخراج البروتين الكلي البكتيري، وذلك باستخدام اضطراب الميكانيكية، و 2-D الكهربائي للهلام لتحليل البروتين اللاحقة.
مقالة منهجية
أعضاء من جنس بيركولديريا هي مسببات الأمراض ذات الأهمية السريرية. نحن تصف طريقة لاستخراج البروتين الكلي البكتيري، وذلك باستخدام اضطراب الميكانيكية، و 2-D الكهربائي للهلام لتحليل البروتين اللاحقة.
التحقيق في مستويات البروتين داخل الخلايا من الأنواع البكتيرية من الأهمية لفهم الآليات المسببة للأمراض من الأمراض التي تسببها هذه الكائنات. نحن هنا وصف الإجراء لاستخراج البروتين من الأنواع بيركولديريا على أساس تحلل الميكانيكية باستخدام الخرز الزجاجي في وجود حمض tetraacetic الإيثيلين وphenylmethylsulfonyl الفلوريد في الفوسفات مخزنة المالحة. هذه الطريقة يمكن استخدامها لأنواع مختلفة بيركولديريا، لظروف النمو المختلفة، وانها مناسبة المحتمل للاستخدام في الدراسات البروتين من البكتيريا الأخرى. بعد استخراج البروتين، ويوصف (2-D) هلام الكهربائي تقنية البروتين ثنائي الأبعاد لدراسة التغيرات العالمية في proteomes من هذه الكائنات. يتكون هذا الأسلوب من فصل البروتينات وفقا لجهة نظرهم كهرساوي بواسطة كهرساوي التركيز في البعد الأول، تليها الفصل على أساس الوزن الجزيئيبواسطة الأكريلاميد هلام الكهربائي في البعد الثاني. ويتم فصل التصور من البروتينات بها الفضة تلطيخ.
تضم بيركولديريا جنس أكثر من 62 نوعا، والكائنات السلبية الغرام معزولة عن مجموعة واسعة من المنافذ، ويتم تقسيمها في مجموعتين رئيسيتين 1،2. وتشمل المجموعة الأولى phytotrophic الكائنات البشرية والحيوانية و، وركزت معظم الدراسات على الأنواع المسببة للأمراض من هذه المجموعة نظرا لأهميتها السريرية الخاصة بهم. الأعضاء الأكثر الممرضة هي B. الراعومية وباء. المطرقة (الذي يسبب راعوم والرعام على التوالي) 3،4 ومسببات الأمراض الانتهازية (17 أنواع محددة من مجمع الشرهة بيركولديريا، BCC) 5، والتي تسبب المرض في التليف الكيسي (CF) والداء الحبيبي المزمن (CGD) 1. المجموعة الثانية، م....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
1. الثقافة النمو (يوم 1 +2)
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
وأظهر تحليل مقارن لمحات البروتين المستخرج من نفس الثقافة البكتيرية في مناسبتين مختلفة أنماط مماثلة النطاقات تشير الاستخراج البروتين ناجحة. تراوحت البروتينات الوزن الجزيئي المستخرجة 10-150 كيلو دالتون. الشكل 1 يبين ممثل Coomassie هلام تلطيخ الزرقاء في الاستخراج البروتين خلية كاملة من الشرهة بيركولديريا (عضو في BCC) العزلات السريرية التي تزرع في LB أو الخميرة / Manitol (YEM) مرق و تحصد من الطور الثابت.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
وقد وصفت طريقة لتحضير البروتينات التي يمكن استخراج معظم البروتينات بيركولديريا مع استنساخ جيدة. ويتجلى ذلك من خلال الحصول على نفس التشكيل الجانبي البروتين من اثنين الاستعدادات مستقلة أجريت في أيام مختلفة باستخدام نفس الثقافة البكتيرية التي تزرع في مرق LB أو YEM كما هو مبين في الشكل 1. وكان استخراج فعالة للبكتيريا نمت في وسائل الإعلام السائل، ولكن نحن لم نجرب هذه الطريقة للبكتيريا نمت على لوحات. وقد استخدم هذا الأسلوب أيضا لمزيد من توصيف البروتين باستخدام .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
وأيد هذا العمل من قبل studentship من جامعة كولومبيا البريطانية (لBV) والمنح المقدمة من التليف الكيسي كندا والكندية معاهد أبحاث الصحة (لDPS). نشكر جاكلين تشونغ لإعداد الأولي من البروتوكولات.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي > كواشف < / قوي > | |||
| ميثان سولفونيل فلوريد (PMSF) | سيجما | P7626 | سام ومسبب للتآكل |
| A18-1 | قابلة للاشتعال | ||
| علم البيولوجي | R028 | ||
| حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) فيشر | BP118-500 | ||
| حبات زجاجية سامة (0.1 مم) | منتجات BioSpec | 11079101 | |
| أنابيب الطرد المركزي Nalgene Oak Ridge ، البولي كربونات (50 مل) | VWR | 21009-342 | |
| طقم استخراج البروتين MicroBCA | بيرس | 23235 | |
| أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 2.0 مل أنابيب غطاء لولبي مخروطي الشكل مع غطاء وحلقة O | Fisher | 02-681-375 | |
| طقم تنظيف 2-D | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| Urea | Invitrogen | 15505-050 | CHAPS مهيج |
| CHAPS | Amersham Biosciences | 17-1314-01 | |
| Dithiothreitol (DTT) | MPBiomedical ، LCC | 856126 | |
| Immobiline DryStrips درجة الحموضة 4-7 24 سم | Amersham Biosciences | 176002-46 | |
| Duracryl | Proteomic Solutions | 80-0148 | شديدة السمية ومسرطنة |
| بيرسلفات الأمونيوم | فيشر | BP179-100 | قابلة للاشتعال ، سامة ، قابلة للتآكل |
| N ، N ، N '، N'-رباعي ميثيل إيثيلين ديامين (TEMED) | Invitrogen | 15524-010 | |
| كبريتات دوديسيل الصوديوم | فيشر | BP166-500 | سمية حادة ، قابلة للاشتعال |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| الإيثانول | فيشر | HC1100-1GL | قابل للاشتعال ، |
| حمض الخليك | فيشر | A491-212 | قابل للاشتعال ، |
| جلوتارالديهايد | فيشر | G151-1 | شديد السمية ، تآكل ، خطير على البيئة |
| رباعي التتراثيونات البوتاسيوم | Sigma | P2926 | مهيج |
| أسيتات الصوديوم | EM Science | 7510 | |
| نترات الفضة | سيجما | 209139 | أكالة ، خطيرة على البيئة |
| الفورمالديهايد | سيجما | 252549 | |
| ثيوسلفات الصوديوم | السامة سيجما | S7026 | |
| تريس بيس | EMD | 9230 | |
| جلايسين | MP طبي ، LCC | 808831 | |
| جلسرين | MPBiomedical ، LCC | 800688 | |
| ميثانول | فيشر | A412-4 | قابلة للاشتعال ، سامة ، مخاطر صحية |
| كربونات الصوديوم اللامائية | EMD | SX0400-3 | |
| زيت معدني | ACROS | 415080010 | |
| <قوي> معدات< / قوي> | |||
| JA-20 دوار الطرد المركزي الفائق | بيكمان كولتر | 334831 | |
| ميني بيدبيتر | منتجات Biospec | 3110BX | |
| نظام التركيز المتساوي الكهربي Ettan IPGphor II وملحقاته | GE Healthcare | 80-6505-03 | www.amershambiosciences.com< / a> |
| Ettan DALT نظام الرحلان الكهربائي العمودي الكبير | GE Healthcare | 80-6485-27 | www.amershambiosciences.com< / a> |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن