يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الثقافات العصبية الطبقية للجنس لدراسة مسارات موت الخلايا الإقفارية

12.4K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/50758

⸱

ديسمبر 9, 2013

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, University of Colorado School of Medicine, 2Oregon National Primate Research Center, Oregon Health & Science University, 3Department of Pharmacology, University of Colorado School of Medicine

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

الثقافات العصبية الجنينية الأولية المنفصلة مفيدة للتحقيق في آليات الإشارات المشاركة في موت الخلايا العصبية. يسمح تحديد جنس الأجنة قبل عزل الحصين وتفكيكه بإعداد ثقافات منفصلة للذكور والإناث ، مما يمكن الباحث من تحديد إشارات الخلية الخاصة بالجنس والتحقيق فيها.

الملخص

لوحظت منذ فترة طويلة الاختلافات بين الجنسين في قابلية الخلايا العصبية للإصابة الإقفارية والأمراض التنكسية العصبية ، لكن آليات الإشارات المسؤولة عن هذه الاختلافات لا تزال غير واضحة. توفر الثقافة العصبية الجنينية الأولية المنفصلة نموذجا تجريبيا مبسطا يمكن من خلاله التحقيق في إشارات الخلايا العصبية المشاركة في موت الخلايا نتيجة لنقص التروية أو المرض. ومع ذلك ، فإن معظم الثقافات العصبية المستخدمة في البحث اليوم هي مختلطة من الجنس. يمكن للباحثين واختبار آثار العلاج بالستيرويد الجنسي في الثقافات العصبية المختلطة بين الجنسين في نماذج إصابة الخلايا العصبية والمرض ، ولكن تراكم الأدلة تشير إلى أن الدماغ الأنثوي يستجيب للأندروجينات والاستروجين والبروجسترون بشكل مختلف عن الدماغ الذكري. علاوة على ذلك ، تستجيب القوارض الذكور والإناث حديثي الولادة بشكل مختلف للإصابة الإقفارية ، حيث يعاني الذكور من إصابة أكبر بعد نقص التروية الدماغية من الإناث. وبالتالي ، قد تحجب الثقافات العصبية الجنسية المختلطة النتائج التجريبية وتربكها. قد يتم تفويت المعلومات المهمة. لهذا السبب ، يقوم مختبر هيرسون في كلية الطب بجامعة كولورادو بشكل روتيني بإعداد الثقافات العصبية الجنينية الأولية المنفصلة حسب الجنس من كل من الحصين والقشرة. يتم جنس الأجنة قبل حصاد أنسجة المخ ويتم فصل أنسجة الذكور والإناث بشكل منفصل ، ومطلية بشكل منفصل ، ويتم الاحتفاظ بها بشكل منفصل. باستخدام هذه الطريقة ، أظهر مختبر هيرسون دورا خاصا بالذكور للقناة الأيونية TRPM2 في موت الخلايا الإقفارية. في هذه المخطوطة ، نشارك ونناقش بروتوكولنا الخاص بممارسة الجنس مع الفئران الجنينية وإعداد ثقافات الخلايا العصبية الأولية المنفصلة عن الحصين طبقية حسب الجنس. يمكن تكييف هذه الطريقة لإعداد الثقافات القشرية الطبقية حسب الجنس ويمكن استخدام طريقة جنس الجنين جنبا إلى جنب مع بروتوكولات أخرى لأي دراسة يعتقد فيها أن الجنس محدد مهم للنتيجة.

المقدمة

الثدييات ثنائية الشكل جنسيا مع الذكور والإناث الذين يظهرون سمات وخصائص مختلفة. تمتد الفروق بين الجنسين حتى إلى الدماغ وتتجلى في قابلية الخلايا العصبية للإصابة والمرض (تمت مراجعتها في1-5). على سبيل المثال ، يكون دماغ الذكور أكثر عرضة لإصابة الخلايا العصبية الإقفارية من السكتة الدماغية أو السكتة القلبية متبوعة بالإنعاش (تمت مراجعته في6). مرض باركنسون (تمت مراجعته في7) والفصام (تمت مراجعته في8) أكثر شيوعا عند الذكور من الإناث ، بينما يبدو الدماغ البشري الأنثوي أكثر عرضة للإصابة بمرض الزهايمر (تمت مراجعته في9) ، واضطرابات المزاج مثل الاكتئاب (تمت مراجعته في10). على الرغم من الاختلافات الملحوظة بين الجنسين في القابلية للإصابة والمرض العصبي ، فإن معظم نماذج العلاج الحالية تفشل في مراعاة الجنس وهي متشابهة في كل من الرجال والنساء. ويمكن تحقيق نجاح أكبر إذا تم مراعاة الفروق بين الجنسين وفهمها.

تظهر النماذج الحيوانية للإصابة والمرض في الجسم الحي إزدواج الشكل الجنسي المشابه للبشر وهي ضرورية لتعزيز فهمنا للفروق بين الجنسين وكيف تساهم هذه الاختلافات في بقاء الخلايا العصبية ووظيفتها. أظهرت الأدلة ، على سبيل المثال ، أن ذكور القوارض أكثر عرضة من الإناث لإصابة الخلايا العصبية الإقفارية11-15. ويعتقد أن هذا الاختلاف يعتمد جزئيا على الأقل على الإشارات الجزيئية لهرمون التستوستيرون, هرمون الستيرويد الجنسية الذكرية الأساسي, والاستروجين, هرمون الستيرويد الجنسي الإناث الأساسي. تكشف الدراسات التي أجريت على القوارض من الذكور والإناث المصابة بالزبد أن هرمون التستوستيرون ومستقلب التستوستيرون وثنائي هيدروتستوستيرون (DHT) يفاقم والإستروجين يقلل من إصابة الخلايا العصبية بعد نقص تروية الدماغ12-14،16-18. ومع ذلك ، فإن الفروق بين الجنسين في نقص التروية الدماغية موجودة في كل من حديثي الولادة والبالغين19،20. يعاني حديثو الولادة من طفرات في هرمون الاستروجين أو هرمون التستوستيرون في الرحم أثناء النمو ، ولكن لديهم مستويات منخفضة نسبيا من الهرمون بعد الولادة حتى سن البلوغ (تمت مراجعته في21). وبالتالي ، فإن وجود أو عدم وجود هرمون الجنس الأولي ليس هو المحدد الوحيد لقابلية الخلايا العصبية المتأثرة بالجنس للإصابة. في الواقع ، من المحتمل أن يتم إنشاء إزدواج الشكل الجنسي أثناء التطور مما يؤدي إلى اختلافات في إشارات الخلية والاستجابة لنقص التروية حتى عندما تكون مستويات الهرمون منخفضة.

< p class = "jove_content">بغض النظر عما إذا كانت الفروق بين الجنسين تعتمد على وجود هرمون الستيرويد الجنسي أو ما إذا كانت ناتجة عن إزدواج الشكل الذي تم إنشاؤه أثناء التطور ، فقد أصبح من الواضح مع مزيد من الدراسة أن هناك اختلافات في إشارات الخلايا بين الذكور والإناث في الدماغ. في مختبر هيرسون في كلية الطب بجامعة كولورادو ، حددنا أحد هذه الاختلافات. لقد وجدنا أن القناة الأيونية المنفذة للكالسيوم والصوديوم والبوتاسيوم ، TRPM2 (تمت مراجعتها في22،23) ، تحفز موت الخلايا العصبية بعد الإهانة الإقفارية في الجسم الحي في الذكر ولكن ليس الأنثىالفأر 24. نوضح أن التثبيط الدوائي أو الضربة القاضية الجينية ل TRPM2 وقائي في الذكور ولكن ليس الأنثى الفأر في نموذج انسداد الشريان السباتي الأوسط في الجسم الحي (MCAO) للسكتةالدماغية 24.

على الرغم من فائدتها ، قد تكون النماذج الحيوانية في الجسم الحي لإصابة الخلايا العصبية الإقفارية ، في بعض الأحيان ، محدودة للدراسات الجزيئية لموت الخلايا العصبية ، بسبب صعوبة أو عدم القدرة على استهداف الخلايا العصبية على وجه التحديد للتحقيق لهذا السبب ، يستخدم مختبرنا الخلايا العصبية القشرية أو الحصين الأولية المنفصلة في المختبر لاستكمال عملنا في الجسم الحي. تقدم مزارع الخلايا العصبية الأولية المنفصلة أداة مفيدة للتحقيق في مسارات إشارات الخلية المشاركة في إصابة الخلايا العصبية والمرض. يمكن الحفاظ على الخلايا العصبية في الثقافة في بيئة خاضعة للرقابة بإحكام ، مع أو بدون مدخلات دبقية. في حالة عدم وجود الخلايا الدبقية ، فإن أي استجابات لوحظت في الثقافة تكون عصبية. يمكن إعطاء العوامل الدوائية للثقافة دون مخاوف بشأن الامتصاص عبر الحاجز الدموي في الدماغ ، مما يسمح بتثبيط أو تنشيط مكونات معينة لمسار نقل إشارة معين. يمكن استخدام البيولوجيا الجزيئية للإفراط في التعبير عن البروتينات المختلفة ذات الأهمية أو إسقاطها ، ويمكن إجراء قياسات الفيزيولوجيا الكهربية على الخلايا الفردية ، وهو أمر لن يكون ممكنا في نظام نموذج في الجسم الحي.

يوسع مختبر هيرسون فائدة الثقافات العصبية الأولية المنفصلة عن طريق تحديد جنس الأجنة المستخدمة في تحضير الثقافات أولا. توضح ثقافات الخلايا العصبية الطبقية من الذكور والإناث بوضوح أن الخلايا العصبية الذكرية أكثر عرضة من الخلايا العصبية الأنثوية لموت الخلايا العصبية بعد الحرمان من الأكسجين والجلوكوز25. الحرمان من الأكسجين والجلوكوز هو نموذج مقبول في المختبر لنقص تروية الخلايا العصبية حيث يقلل نقص التروية من توافر الأكسجين والجلوكوز في الدماغ. علاوة على ذلك ، فقد أثبتنا من خلال التجارب الفيزيولوجية الكهربية في الخلايا العصبية المنفصلة والطبقية حسب الجنس أن TRPM2 يتم تنشيطه في الخلايا العصبية الذكرية وليس الأنثوية24،26. نحن نحقق حاليا في المنظمين الجزيئيين الخاصين بالجنس لنشاط TRPM224،26. هنا ، نشارك ونناقش بروتوكولنا لإنشاء مزارع الخلايا العصبية الجنينية الأولية المنفصلة عن الجنس ونقدم بيانات تمثيلية باستخدام هذه الطريقة التي تشير إلى أن إنزيم إصلاح الحمض النووي ، PARP-1 ، يساهم في موت الخلايا الإقفارية بطريقة جنسية مشابهة ل TRPM2. يتم تنشيط PARP-1 عن طريق كسر الحمض النووي بسبب الإجهاد التأكسدي (تمت مراجعته في27،28). عندما يكون تلف الحمض النووي ضئيلا ، فإن نشاط PARP-1 يعزز بقاء الخلية ، ولكن عندما يكون الضرر مفرطا ، فإن زيادة نشاط PARP-1 يؤدي إلى تفاقم موت الخلايا. ينتج PARP-1 بولي (ADP) ريبوز ، وهو منشط معروف لقناة TRPM228-31 ، وتشير بعض الأدلة إلى أن PARP-1 يتم تنشيطه بشكل تفضيلي في دماغ الذكور وليس الإناث استجابة للإجهاد التأكسدي32،33. وبالتالي ، نفترض أن PARP-1 ينشط TRPM2 في الذكور وليس الإناث ، مما يؤدي إلى موت الخلايا العصبية استجابة للحرمان من الأكسجين والجلوكوز.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم إجراء جميع الإجراءات الواردة في هذا البروتوكول وفقا لإرشادات المعهد الوطني للصحة للمعاملة الأخلاقية ورعاية ، ووفقا لبروتوكول استخدام المعتمد من IACUC.

< p class = "jove_title" >1. تحضير أطباق زراعة الأنسجة ووسائط الثقافة وأدوات التشريح التي يجب إجراؤها قبل يوم واحد على الأقل من التشريح

  1. تحضير 1 لتر من البورات العازلة: 3.1 جم / لتر من حمض البوريك و 4.75 جم / لتر من البوراكس في H2O المقطر المزدوج. اضبط الرقم الهيدروجيني على 8.4. قم بتعقيمه بالفلتر وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
  2. يخفف بولي د-ليسين إلى 0.1 ملغ/مل.
    1. تحت غطاء مزرعة الأنسجة ذات التدفق الصفحي ، ضع ما يكفي من بولي دي ليسين المخفف لتغطية قاع كل بئر من لوحة زراعة الأنسجة المعقمة متعددة الآبار والمعالجة بالثقافة. (إذا رغبت في ذلك ، يمكن إضافة زلات زجاجية منظفة مسبقا ومعقمة إلى قاع كل بئر قبل إضافة بولي دي ليسين. يمكن أن تطفو زلات الغطاء بعد إضافة بولي دي ليسين ، لذلك يجب دفعها لأسفل باستخدام ملقط معقم إذا لزم الأمر.)
    2. احتضان الألواح طوال الليل في الحاضنة عند 37 درجة مئوية.
  3. تحضير 1 لتر من محلول التشريح: 350 مجم / لتر NaHCO3 ، و 2.38 جم / لتر HEPES ، و 1.44 جم / لتر MgSO4 ، و 300 مجم / لتر BSA في محلول ملح متوازن 1x Hanks بدون Ca أو Mg أو بيروفات الصوديوم أو الفينول الأحمر. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.3. قم بالفلتر والتعقيم وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لحين الحاجة.
  4. تحضير 500 مل وسط طلاء: 10٪ مصل من الأبقار الجنينية ، و 100 وحدة / مل لكل من البنسلين والستربتومايسين ، و 2.5 ملي مولار من الجلوتامين في MEM بدون الفينول الأحمر. تعقيم الفلتر. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لحين الحاجة. تخلص من أي وسيط غير مستخدم بعد 1 شهر.
  5. تحضير 500 مل وسط تغذية: 2٪ مكمل B-27 ، 100 وحدة / مل لكل من البنسلين والستربتومايسين ، و 2.0 ملي مولار GlutaMAX (وليس الجلوتامين) في Neurobasal بدون فينول أحمر. تعقيم الفلتر. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لحين الحاجة. تخلص من أي وسط تغذية متبقي بعد 1 شهر.
  6. تحضير 10 مل من 100 ملي CaCl2 و 500 ملي مولار EDTA و 1 M هيدروكسيد الصوديوم حسب الحاجة وفقا للطرق القياسية.
  7. قم بتعقيم الأدوات الجراحية / التشريح وتخزينها في ظروف معقمة لحين الحاجة. يتطلب هذا الإجراء ملقطين حادين بزاوية فائقة الدقة ، ملقط منحني ناعم ، ملقط منحني مسنن ، ملقط صغير ذو أسنان فئران ، زوج واحد من المقص الجراحي الدقيق ، زوج واحد من المقص الجراحي الناعم الضيق ، زوج واحد من المقص متوسط الرؤوس ، ومسبار تشريح حاد. يمكن إضافة أدوات معقمة إضافية حسب التفضيل الشخصي.

2. تحضير أطباق زراعة الأنسجة ، ووسائط الاستزراع ، وأدوات التشريح ، ومنطقة التشريح التي سيتم إجراؤها في يوم التشريح

  1. اغسل ألواح زراعة الأنسجة المطلية ب poly-D-lysine. تحت خزانة السلامة الحيوية ذات التدفق الرقائقي ، قم بشفط poly-D-lysine بخط تفريغ أو ماصة ، وأضف الماء إلى كل بئر ، واحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ~ 5 دقائق. استنشق الماء واستبدله بماء نظيف ومعقم. كرر 3 مرات.
    1. اترك الأطباق تجف تماما في درجة حرارة الغرفة.
  2. قم بإعداد منطقة التشريح عن طريق مسح العداد ونطاق التشريح بنسبة 70٪ من الإيثانول.
    1. قم بتشبع Kimwipe كبير بنسبة 70٪ من الإيثانول ، وقم بوضع أدوات التشريح المعقمة. غطيها بكيمويب آخر.
    2. املأ طبقا كبيرا مسطحا بالثلج. قم بتسمية وتعبئة عدد مناسب من أطباق الاستزراع 60 مم بمحلول التشريح البارد. قم بإعداد أطباق كافية لإبقاء رؤوس الذكور والإناث والعقول والحصين منفصلين (إن أمكن).
    3. املأ طبقين أكبر مقاس 100 مم بمخزن مؤقت للتشريح البارد.
    4. توضع جانبا طبقا منفصلا مقاس 100 مم بدون عازلة (جافة).
    5. إنشاء منطقة للنفايات البيولوجية وأخرى للأنسجة الحيوانية (يتم التخلص منها بشكل مناسب بعد التشريح ، وفقا للمعايير المؤسسية).
  3. وسائط طلاء دافئة 30 مل في حمام مائي 37 درجة مئوية. سيتم استخدام هذا المحلول الدافئ في مرحلة تفكك الخلية في البروتوكول.
  4. ضع 1 مل من وسائط الطلاء في كل بئر من 24 بئر ، بولي دي-ليسين ، لوحة زراعة الأنسجة. استخدم حجما أصغر مناسبا إذا تم استخدام ألواح أصغر. ضع الصفيحة المغطاة في حاضنة 37 درجة مئوية عند 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 للتدفئة والتوازن مع ثاني أكسيد الكربون2 أثناء التشريح.
  5. تحضير محلول غراء.
    1. قم بتسمية أنبوبين مخروطيين معقمين سعة 15 مل ، أحدهما على أنه "ذكر" والآخر على أنه "أنثى".
    2. أضف ما يلي إلى كل أنبوب: 10 مل من محلول التشريح ، 150 ميكرولتر 100 ملي CaCl2 ، 10 ميكرولتر 500 ملي EDTA ، 10 ميكرولتر 1 M هيدروكسيد الصوديوم ، و 150 وحدة من غراء.
    3. امزج برفق عن طريق قلب الأنبوب ثلاث مرات ، ثم قم بتسخينه في حمام مائي 37 درجة مئوية. ملاحظة: سيكون لكل قارورة من غراء وحدة نشاط مختلفة لكل ملغ من غراء ، وبالتالي فإن حجم غراء المضاف إلى المحلول سيختلف من قارورة إلى أخرى. سيكون الغراء غائما في البداية ، لكن المحلول سيزول عندما يذوب غراء تماما.
< p class = "jove_title" >3. حصاد وجنس وتشريح أجنة E18

  1. تخدير أنثى الفأر الحامل بالأيزوفلوران أو أي تخدير مناسب آخر. القتل الرحيم للفأر تحت التخدير العميق عن طريق قطع الرأس أو خلع عنق الرحم.
  2. العمل بسرعة ، تنظيف بطن الأنثى بنسبة 70٪ من الإيثانول. إذا رغبت في ذلك ، يمكن حلق البطن قبل رشه بالإيثانول لتقليل مخاطر التلوث. ارفع جلد البطن باستخدام ملقط أسنان الفئران. قم بعمل شق كبير في البطن باستخدام المقص متوسط الرأس ، وقطع الجلد وعضلات البطن ، وتعريض الأعضاء الداخلية.
  3. قم بإزالة الأجنة بعناية ، وارفع كل قرن رحمي بالكامل من البطن ، مع الحرص على عدم السماح له بملامسة أي نسيج خارجي إن أمكن (لتجنب التلوث). ضع قرون الرحم التي تحتوي على الأجنة في طبق به تشريح بارد ملحي وانقله إلى الثلج.
  4. قم بإزالة كل جرو بعناية من قرون الرحم والكيس الجنيني. الجراء هشة ، لذلك من الأفضل القيام بذلك عن طريق قطع أنسجة الرحم بين كل جنين لفضح الكيس الجنيني ، ثم تقطيع الكيس بعناية على السطح بحافة المقص الصغير الضيق. يمكن بعد ذلك دفع السائل الجنيني والجرو برفق عبر الفتحة دون الإضرار بالجنين.
    1. إذا لم يكن الشق في الكيس الجنيني كبيرا بما يكفي لخروج السائل والجرو بسهولة ، فقم بتكبير الشق بعناية حتى ينزلق الجرو بأقل قدر من القوة.
    2. لا تضغط على الكيس بقوة شديدة لإجبار الجنين على الخروج ، لأن هذا أيضا قد يؤدي إلى إتلاف الأجنة.
  5. قم بإزالة الرأس من جنين واحد. اترك الرأس في طبق من الملح على الثلج. ضع جسم الجنين على ظهره على طبق جاف 100 ملي تحت نطاق التشريح. باستخدام الملقط المنحني متوسط الرؤوس في يد والملقط المنحني المسنن في اليد الأخرى ، قم بتسطيح الجرو برفق للخارج ، وادفع الأرجل الخلفية لأسفل والبطنية ، والساقين الأماميتين لأسفل والظهرية.
  6. قم بإزالة الذيل بالمقص إذا لزم الأمر ؛ يميل الذيل إلى الالتفاف فوق البطن ويمكن أن يعيق التشريح.
  7. حرر الساقين الخلفيتين واضغط على البطن عند جذر الحبل السري ، المسمى السرة. ارفع برفق. حرر الأرجل الأمامية وباليد الأخرى والمقص الصغير ، قم بعمل حرف "v" مقلوب صغير في البطن فوق السرة مباشرة مع نقطة "v" تشير إلى الجمجمة.
  8. استبدل المقص بالملقط المنحني مرة أخرى. اقلب الملقط بحيث تكون النقطة لأعلى وبعيدا عن. بقوة لطيفة ، ادفع لأسفل والظهرية على القفص الصدري مع الحافة المغلقة المستديرة للملقط المنحني ، أثناء السحب لأسفل وبطني مع الملقط الآخر ، ونشر الجرو من البطن إلى الظهر. ستؤدي حركة الانتشار هذه إلى فتح تجويف البطن ، وتعريض الأمعاء والكبد والأعضاء الداخلية الأخرى.
  9. باستخدام الملقط المنحني ، ادفع الأمعاء والكبد برفق شديد في الجمجمة باستخدام حركات الكنس المتكررة. سيؤدي ذلك إلى كشف الكلى والمثانة تدريجيا ، والأهم من ذلك ، الأعضاء التناسلية الداخلية.
    1. يتم التعرف على الجراء الذكور من خلال وجود خصيتين مخططتين موجودتين أسفل الكلى مباشرة على كل جانب. يبلغ حجم الخصيتين حوالي 1 / 3-1 / 2 حجم الكلى وأحيانا تسقطان للجلوس فوق المثانة مباشرة.
    2. يتم التعرف على الإناث بسهولة أكبر من خلال نقص الخصيتين ، ولكن يمكن أيضا التعرف عليها من خلال الرحم الصغير الذي يقع فوق المثانة ، وقناتي فالوب التي تمتد نحو الكلى. في ظل القوة العالية على نطاق التسلخ ، يمكن أيضا تحديد المبايض على أنها أعضاء صغيرة ومظلمة في نهاية قناتي فالوب أسفل الكلى مباشرة وأحيانا تحتها بشكل ثنائي.
  10. بمجرد تحديد الجنس ، تخلص من الجسد وضع الرأس في طبق مكتوب عليه بشكل مناسب (ذكر أو أنثى). احتفظ بالرؤوس على الجليد في محلول التشريح.
  11. كرر الخطوات 3.5-3.10 حتى يتم ممارسة الجنس مع كل جرو. للحصول على أفضل النتائج ، امسح الطبق نظيفا باستخدام Kimwipe بين كل تشريح. السائل يجعل الجراء زلقة ويصعب فهمها للتشريح.
    12. بمجرد أن يتم
  12. جنس جميع الأجنة وفصل رؤوس الذكور والإناث ، استمر في باقي التشريح مع الحرص بشكل خاص على إبقاء جميع الأنسجة المشتقة من الذكور والإناث منفصلة.
  13. انقل دماغا واحدا في كل مرة إلى طبق 100 ملي مليء بمحلول تشريح بارد. تحت نطاق التشريح ، استخدم الملقط المنحني لثقب عيون الجنين لتثبيته للتشريح. باستخدام مقص الجراحة المجهرية ، قم بعمل شق خط الوسط الضحل ، وتقسيم الجلد والجمجمة أسفل خط الوسط ، من قاعدة الجمجمة إلى أعلى الرأس فوق الممر الأنفي مباشرة.
  14. ادفع الجلد والجمجمة جانبا برفق بشكل ثنائي واستخرج الدماغ برفق شديد عن طريق تجريفه بعناية من الدماغ الأمامي باتجاه جذع الدماغ باستخدام قاعدة المقص الجراحي المجهري أو باستخدام ملقط مغلق بزاوية.
    1. استخدم الملقط بعناية لنقل الدماغ المستخرج إلى طبق نظيف ومصنف مليء بمحلول التشريح البارد. احتفكي الطبق على الجليد.
    2. كرر هذه العملية حتى يتم حصاد جميع الأدمغة.
    3. يجب أن تنتج هذه الخطوة لوحين من الأدمغة الكاملة في مخزن مؤقت للتشريح ، أحدهما للذكور والآخر للأنسجة الأنثوية.
  15. ضع طبقا نظيفا أسفل نطاق التشريح واملأه بمخزن التشريح. صب ما يكفي من المحلول للحفاظ على رطوبة الدماغ في جميع أنحاء تشريح الحصين. الكثير من شأنه أن يتسبب في تعويم الدماغ ويجعل التعامل معه صعبا. إذا رغبت في ذلك ، قم بتغطية طبق التشريح بالشمع المعقم. يوفر الشمع سطحا غير قابل للانزلاق يعمل عليه ويحمي أطراف أدوات التشريح الحساسة. يمكن أن يؤدي خدش قاع الطبق غير المطلي إلى ثني أو إضعاف الحواف الحادة للأدوات.
  16. قم بتغيير نطاق التشريح إلى إعداد عالي الطاقة، واضبط التركيز البؤري وفقا لذلك. انقل بعناية دماغا واحدا في كل مرة لتشريح الطبق. باستخدام الملقط ذو الرؤوس الدقيقة للغاية ، قم بفصل كل نصف كرة من الدماغ وقرصه من جذع الدماغ.
  17. بعناية فائقة ، قم بإزالة السحايا من كل نصف الكرة الأرضية. (السحايا عبارة عن غشاء وردي ، غني بالأوعية الدموية ، وهو مصدر شائع للتلوث الدبقي في ثقافة الخلايا العصبية.)
    1. لإزالة السحايا ، قم بقرص الغشاء برفق ، ورفعه ، وسحبه ، مع الحرص على عدم اختراق أنسجة المخ تحتها.
    2. اسحب السحايا بعيدا عن الدماغ ، مما يسمح للدماغ بالتدحرج قليلا تحت الملقط مع إبقائه في مكانه بحيث يمكن سحب الغشاء بعيدا.
  18. في هذه المرحلة ، يمكنك تشريح الدماغ لاستخدام الأنسجة المختارة. على سبيل المثال ، قم بتشريح الحصين من كل نصف كرة كرية. ضع نصف الكرة الأرضية مع الجانب الجانبي لأسفل. راقب تجويف البطين الكبير ، الذي يخلق سديلة تغطي الحصين. قم بإثارة هذه السديلة برفق للخلف حتى يمكن ملاحظة الحصين على شكل هلال. الحصين مرتفع قليلا ويقع بين منتصف الدماغ والقشرة.
  19. باستخدام زوجين من الملقط الحاد والدقيق للغاية ، أمسك نصف الكرة المخية مفتوحا بيد واحدة واقطع الحصين بعيدا عن القشرة ومنتصف الدماغ باليد الأخرى.
    1. ضع الحصين في طبق مكتوب عليه بشكل صحيح (ذكر أو أنثى) مملوء بمخزن التشريح ويحتفظ به على الجليد.
    2. قم بتشريح الحصين من نصف الكرة المتبقي وكرر هذه العملية مع كل دماغ.
  20. انقل الحصين إلى أنابيب مخروطية الشكل سعة 15 مل ذات العلامات المناسبة.
    1. يغسل برفق مرتين باستخدام محلول التشريح البارد. استخدم شفط الفراغ بعناية فائقة في هذه المرحلة. الحصين صغير ويمكن أن يضيع بشكل لا يمكن إصلاحه في الفراغ. امنع ذلك عن طريق السماح للأنسجة بالاستقرار في قاع الأنبوب، وإزالة أكبر قدر ممكن من السائل من الأنبوب باستخدام ماصة، والتخلص من المحلول، واستبدلها بمحلول تشريح جديد ونظيف.
    2. كرر الخطوة 3.20.1.
< p class = "jove_title" >4. تفكك الخلايا العصبية

  1. انقل الحصين إلى محلول غراء مسمى بشكل مناسب. ضعها في حمام مائي 37 درجة مئوية واحتضنها لمدة 8-10 دقائق ، مع قلب الأنابيب برفق لخلطها كل 2-3 دقائق.
  2. قم بإزالة مزيج غراء والأنسجة من الحمام المائي. اسمح للأنسجة بالاستقرار ، ثم قم بإزالة أكبر قدر ممكن من محلول غراء بعناية باستخدام ماصة ، تاركا الأنسجة في قاع الأنبوب. اغسل المنديل 3x بوسائط الطلاء. يعمل المصل الموجود في وسط الطلاء على إخماد الهضم الأنزيمي للغراء. هناك حاجة إلى مثبط التربسين إذا لم يتم استخدام المصل في وسائط الطلاء.
  3. قم بإزالة وسائط الطلاء.
    1. أضف 2 مل من الوسط العصبي القاعدي الطازج وقم بفصل الأنسجة برفق باستخدام ماصة مصلية سعة 5 مل على أبطأ سرعة.
    2. يتم إجراء التفكك عن طريق سحب العينات برفق لأعلى ولأسفل 8 أضعاف. احرص على عدم إدخال الفقاعات في المحلول. للحصول على أفضل النتائج، التقط المحلول والأنسجة في الماصة ثم حرر المحلول على جانب الأنبوب المخروطي، مما يسمح للأنسجة بالانزلاق لأسفل الجانب والعودة إلى أسفل الأنبوب.
  4. بعد التجربة الثامنة ، اترك الأنسجة تستقر وتجمع الوسائط الغائمة في الأعلى. تحتوي هذه الوسائط على خلايا غير مرتبطة.
    1. انقله إلى أنبوب جديد مسمى.
    2. أضف 2 مل إضافي إلى الأنسجة غير المنفصلة.
    3. ثلاثي مرة أخرى 8 أضعاف.
    4. حصاد الوسائط الغائمة.
    5. كرر هذه العملية 3-5x. ستبقى بعض الأنسجة غير المنفصلة. في حين أنه من الممكن أن تتلاعب حتى يتم فصل جميع الأنسجة, الاضطرار المفرط يؤدي إلى سوء صحة الخلايا العصبية ولا ينصح به.
  5. أضف وسيطا إضافيا إلى الأنابيب المخروطية حسب الضرورة لمعادلة الأحجام والأوزان بين أنسجة الذكور والأنثى. الطرد المركزي للخلايا في جهاز طرد مركزي دلو دوار عند 228 × جم لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية بعناية.
  6. أعد تعليق الخلايا برفق في وسائط طلاء جديدة سعة 2 مل وقم بتصفية المحلول من خلال مصفاة خلية شبكية في أنبوب مخروطي نظيف ومسمى سعة 50 مل.
  7. أضف 50 ميكرولتر من معلق الخلية إلى 450 ميكرولتر من 0.4٪ Trypan Blue. احتضان الخلايا لمدة دقيقتين في Trypan Blue ، واخلطها برفق ، وقم بتحميل 10 ميكرولتر على مقياس كثافة الدم. عد الخلايا باستثناء تلك التي تناولت صبغة Trypan Blue ؛ الخلايا الزرقاء الداكنة ميتة أو تحتضر.
< p class = "jove_title" >5. الطلاء وصيانة الثقافة

  1. احسب الحجم الصحيح لتعليق الخلية لإضافته إلى كل بئر من لوحة زراعة الأنسجة للحصول على كثافة الخلية المطلوبة. تعتبر مزارع الخلايا العصبية حساسة للغاية لكثافة الخلايا وتعمل بشكل أفضل في الكثافة المتوسطة إلى العالية ما لم يتم زراعتها مع الخلايا الدبقية أو تغذيتها بوسائط مكيفة دبقية. في هذا البروتوكول ، يتم طلاء الخلايا بمعدل 150,000-200,000 خلية / سم2.
  2. قم بإزالة لوحة زراعة الأنسجة المملوءة مسبقا بوسائط الطلاء من الحاضنة (المعدة في الخطوة 2 أعلاه).
      قم
    1. بتدوير معلق الخلية برفق في الأنبوب المخروطي سعة 50 مل ، ثم قم بتدوير الحجم المطلوب من تعليق الخلية (المحسوب أعلاه في الخطوة 5.1) إلى وسط كل بئر.
    2. كرر ذلك ، قم بتدوير تعليق الخلية في كل مرة قبل سحب العينة لضمان كثافة الخلايا المتساوية في كل بئر. تستقر الخلايا بسرعة ويمكن أن تتغير كثافة الخلايا من بئر إلى آخر إذا تم تخطي خطوة الدوران.
  3. بمجرد إضافة الخلايا إلى كل بئر ، قم بتدوير اللوحة برفق لتفريق الخلايا ، ثم استبدل الطبق على الفور في الحاضنة. اترك الخلايا دون إزعاج لمدة 24 ساعة على الأقل.
  4. بعد 24 ساعة على الأقل من طلاء الخلايا ، قم بتسخين وسائط التغذية العصبية القاعدية الكاملة إلى 37 درجة مئوية. الشفط والاستبدال من بئر واحد في كل مرة لتقليل الإجهاد العصبي وتحسين بقاء الخلايا.
  5. يجب تغذية مزارع الخلايا العصبية كل 4-7 أيام عن طريق إزالة نصف الوسط بعناية وإضافة كمية متساوية من الوسط الطازج. في ظل هذه الظروف ، يمكن الحفاظ على الثقافات لمدة أسبوعين. مع الثقافات العصبية الأولية ، من المتوقع موت بعض الخلايا. وبالتالي ، مع نضوج الثقافات ، ستنخفض الكثافة. في هذا البروتوكول ، تنخفض كثافة الخلايا بنسبة 30٪ تقريبا بحلول اليوم 10 في المختبر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يعد التحديد الصحيح لجنس أجنة الفئران خطوة حاسمة في تحضير مزارع العصبونات الأولية المصنفة حسب الجنس. ولضمان استنبات حصين الذكور والإناث بشكل منفصل من جراء محددة الجنس بدقة، تم فصل الأجنة حسب الجنس واستئصال القشرة والحصين منها. تم عزل الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (Genomic DNA) من الأنسجة المستأصلة لكل جنين وفقاً للإجراءات القياسية، مع الحرص على إبقاء الجنسين منفصلين. تم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) باستخدام بادئات للجين الخاص بالذكور SRY والمؤشر العام myogenin (Myog) (الشكل 1). ويعد SRY، ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تقدم الثقافات العصبية الأولية المنفصلة للحصين الطبقية التي يتم فيها تشريح الحصين من الذكور والإناث وفصلها وزراعتها بشكل منفصل أداة مفيدة للتحقيق في إشارات الخلايا الخاصة بالجنس في موت الخلايا العصبية. بينما يستخدم علماء الأعصاب عادة الثقافات العصبية الأولية ، تختلف البروتوكولات بين المختبرات اعتمادا على أهدافهم واهتماماتهم التجريبية المحددة. يختار العديد من الباحثين زراعة الخلايا العصبية مع الخلايا الدبقية ، إما في الثقافة المختلطة أو عن طريق طلاء الخلايا العصبية على غطاء زجاجي معلق على طبقة نجمية محددة مسبقا. ويعتقد أن ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

العمل مدعوم جزئيا من قبل مؤسسة Walter S. and Lucienne Driskill و NIH R01NS058792.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مكمل B27Invitrogen17504-044
BoraxSigma71997
حمض البوريكSigmaB6768
مصل الأبقار الألبومينSigmaA4503
مصل الأبقار الجنينيInvitrogen26140-079
GlutaMAXInvitrogen35050-061
الجلوتامينInvitrogen25030-081
HBSS ، خال من الكالسيوم ، خال من المغنيسيوم ، خال من الفينول الأحمرInvitrogen14175-095
MEM ، خال من الجلوتامين ، خال من الفينول الأحمرInvitrogen51200-038
Neurobasal ، خال من الجلوتامين ، خال من الفينول الأحمرInvitrogen12348-017
البنسلين / الستربتومايسينInvitrogen15070-063
بولي دي ليسين ، ميغاواط 70،000-150،000سيجماP0899
تريبان أزرق 0.4٪Invitrogen15250-061
معدات
دومون # 5/45 ملقط بزاويةأدوات العلومالدقيقة 11251-35
دومون # 7 & - ndash ؛ ملقط منحني دقيقأدوات العلومالدقيقة 11274-20
مسننة (لندن) ملقطأدوات العلوم الدقيقة11080-02
ملقط Graefe ناعم للغاية 1 × 2 أسنانأدوات العلوم الدقيقة11153-10
مقص الربيع مورياأدوات العلومالدقيقة 15396-00
مقص التشغيل المتوسطRoboz SurgicalRS-6812
مقص تشريح دقيق للغايةRoboz SurgicalRS-5880
24 بئر ألواح زراعة الأنسجةفيشر87721
مصفاة خلية ، 40 & إم نايلون شبكةBD Biosciences352340

المراجع

  1. Andreano, J. M., Cahill, L. Sex influences on the neurobiology of learning and memory. Learn Mem. 16, 248-266 (2009).
  2. Arnold, A. P., Burgoyne, P. S. Are XX and XY brain cells intrinsically different. Trends Endocrinol. Metab. 15, 6-11 (2004).
  3. Cahill, L. Why sex matters for neuroscience. Nat. Rev. Neurosci. 7, 477-484 (2006).
  4. Jazin, E., Cahill, L. Sex differences in molecular neuroscience: from fruit flies to humans. Nat. Rev. Neurosci. 11, 9-17 (2010).
  5. Morris, J. A., Jordan, C. L., Breedlove, S. M. Sexual differentiation of the vertebrate nervous system. Nat. Neurosci. 7, 1034-1039 (2004).
  6. Lang, J. T., McCullough, L. D. Pathways to ischemic neuronal cell death: are sex differences relevant. J. Transl. Med. 6, 33(2008).
  7. Van Den Eeden, S. K., et al. Incidence of Parkinson's disease: variation by age, gender, and race/ethnicity. Am. J. Epidemiol. 157, 1015-1022 (2003).
  8. Abel, K. M., Drake, R., Goldstein, J. M. Sex differences in schizophrenia. Int. Rev. Psychiatry. 22, 417-428 (2010).
  9. Vest, R. S., Pike, C. J. Gender, sex steroid hormones, and Alzheimer's disease. Horm. Behav. 63, 301-307 (2013).
  10. Fernandez-Guasti, A., Fiedler, J. L., Herrera, L., Handa, R. J. Sex, stress, and mood disorders: at the intersection of adrenal and gonadal hormones. Horm. Metab. Res. 44, 607-618 (2012).
  11. Hall, E. D., Pazara, K. E., Linseman, K. L. Sex differences in postischemic neuronal necrosis in gerbils. J. Cereb. Blood Flow Metab. 11, 292-298 (1991).
  12. Hawk, T., Zhang, Y. Q., Rajakumar, G., Day, A. L., Simpkins, J. W. Testosterone increases and estradiol decreases middle cerebral artery occlusion lesion size in male rats. Brain Res. 796, 296-298 (1998).
  13. Nakano, T., Hurn, P. D., Herson, P. S., Traystman, R. J. Testosterone exacerbates neuronal damage following cardiac arrest and cardiopulmonary resuscitation in mouse. Brain Res. 1357, 124-130 (2010).
  14. Pan, Y., et al. Effect of testosterone on functional recovery in a castrate male rat stroke model. Brain Res. 1043, 195-204 (2005).
  15. Siegel, C., Turtzo, C., McCullough, L. D. Sex differences in cerebral ischemia: possible molecular mechanisms. J. Neurosci. Res. 88, 2765-2774 (2010).
  16. Uchida, M., et al. Dose-dependent effects of androgens on outcome after focal cerebral ischemia in adult male mice. J. Cereb. Blood Flow Metab. 29, 1454-1462 (2009).
  17. Yang, S. H., et al. Testosterone increases neurotoxicity of glutamate in vitro and ischemia-reperfusion injury in an animal model. J. Appl. Physiol. 92, 195-201 (2002).
  18. Cheng, J., Alkayed, N. J., Hurn, P. D. Deleterious effects of dihydrotestosterone on cerebral ischemic injury. J. Cereb. Blood Flow Metab. 27, 1553-1562 (2007).
  19. Nunez, J. Sex and steroid hormones in early brain injury. Rev. Endocr. Metab. Disord. 13, 173-186 (2012).
  20. Renolleau, S., Fau, S., Charriaut-Marlangue, C. Gender-related differences in apoptotic pathways after neonatal cerebral ischemia. Neuroscientist. 14, 46-52 (2008).
  21. McCarthy, M. M., Konkle, A. T. When is a sex difference not a sex difference. Front Neuroendocrinol. 26, 85-102 (2005).
  22. Aarts, M. M., Tymianski, M. TRPMs and neuronal cell death. Pflugers Arch. 451, 243-249 (2005).
  23. Jiang, L. -H., Yang, W., Zou, J., Beech, D. J. TRPM2 channel properties, functions and therapeutic potentials. Expert Opin. Ther. Targets. 14, 973-988 (2010).
  24. Jia, J., et al. Sex differences in neuroprotection provided by inhibition of TRPM2 channels following experimental stroke. J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 2160-2168 (2011).
  25. Fairbanks, S. L., et al. Mechanism of the sex difference in neuronal ischemic cell death. Neuroscience. 219, 183-191 (2012).
  26. Verma, S., et al. TRPM2 channel activation following in vitro ischemia contributes to male hippocampal cell death. Neurosci. Lett. 530, 41-46 (2012).
  27. Bai, P., Canto, C. The role of PARP-1 and PARP-2 enzymes in metabolic regulation and disease. Cell Metab. 16, 290-295 (2012).
  28. Blenn, C., Wyrsch, P., Bader, J., Bollhalder, M., Althaus, F. R. Poly(ADP-ribose)glycohydrolase is an upstream regulator of Ca2+ fluxes in oxidative cell death. Cell Mol. Life Sci. 68, 1455-1466 (2011).
  29. Buelow, B., Song, Y., Scharenberg, A. M. The Poly(ADP-ribose) polymerase PARP-1 is required for oxidative stress-induced TRPM2 activation in lymphocytes. J. Biol. Chem. 283, 24571-24583 (2008).
  30. Fonfria, E., et al. TRPM2 channel opening in response to oxidative stress is dependent on activation of poly(ADP-ribose) polymerase. Br. J. Pharmacol. 143, 186-192 (2004).
  31. Miller, B. A. Inhibition of TRPM2 function by PARP inhibitors protects cells from oxidative stress-induced death. Br. J. Pharmacol. 143, 515-516 (2004).
  32. Vagnerova, K., et al. Poly (ADP-ribose) polymerase-1 initiated neuronal cell death pathway--do androgens matter. Neuroscience. , 166-476 (2010).
  33. Yuan, M., et al. Sex differences in the response to activation of the poly (ADP-ribose) polymerase pathway after experimental stroke. Exp. Neurol. 217, 210-218 (2009).
  34. Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 2496-2500 (1986).
  35. Dumesic, D. A., Renk, M., Kamel, F. Estrogenic effects of phenol red on rat pituitary cell responsiveness to gonadotropin-releasing hormone. Life Sci. 44, 397-406 (1989).
  36. Ernst, M., Schmid, C., Froesch, E. R. Phenol red mimics biological actions of estradiol: enhancement of osteoblast proliferation in vitro and of type I collagen gene expression in bone and uterus of rats in vivo. J. Steroid Biochem. 33, 907-914 (1989).
  37. Hubert, J. F., Vincent, A., Labrie, F. Estrogenic activity of phenol red in rat anterior pituitary cells in culture. Biochem. Biophys. Res. Commun. 141, 885-891 (1986).
  38. Ortmann, O., Sturm, R., Knuppen, R., Emons, G. Weak estrogenic activity of phenol red in the pituitary gonadotroph: re-evaluation of estrogen and antiestrogen effects. J. Steroid Biochem. 35, 17-22 (1990).
  39. Rajendran, K. G., Lopez, T., Parikh, I. Estrogenic effect of phenol red in MCF-7 cells is achieved through activation of estrogen receptor by interacting with a site distinct from the steroid binding site. Biochem. Biophys. Res. Commun. 142, 724-731 (1987).
  40. Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. Estrogenic activity of phenol red. Mol. Cell Endocrinol. 57, 169-178 (1988).
  41. Moreno-Cuevas, J. E., Sirbasku, D. A. Estrogen mitogenic action. III. is phenol red a "red herring"? In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 36, 447-464 (2000).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

تحديد جنس أجنة الفئرانعزل العصبونات الحصينيةالحرمان من الأكسجين والجلوكوزتثبيط قناة TRPM2فئران معطلة جين PARP1طلاء البولي دي ليسينتحضير الوسط الغذائي العصبيزراعة الخلايا بكثافة محددةتحليل لطخة ويسترن
الثقافات العصبية الطبقية للجنس لدراسة مسارات موت الخلايا الإقفارية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.