مقالة منهجية

بروتوكول سريع لدمج المصفوفات خارج الكروموسومات ذات معدل انتقال مرتفع في جينوم C. ايليجانس

9K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/50773

⸱

ديسمبر 9, 2013

 ,  ,  , 
1Université Claude Bernard Lyon, 2Centre de Génétique et de Physiologie Moléculaires et Cellulaires, CNRS UMR 5534

في هذه المقالة

ملخص

< p class = "jove_content"> يصف هذا البروتوكول إجراء سريعا ومنخفض استهلاك المواد لدمج المصفوفات خارج الكروموسومات المعدلة وراثيا في جينوم Caenorhabditis elegans باستخدام الأشعة فوق البنفسجية (UV). علاوة على ذلك ، فإن هذا البروتوكول مناسب بشكل خاص للخطوط المعدلة وراثيا التي تنقل المصفوفات خارج الكروموسومات بمعدل مرتفع.

الملخص

الحقن الدقيق للحمض النووي في سيتوبلازم الغدد التناسلية المخلوية ل Caenorhabditis elegans هي التقنية الرئيسية المستخدمة لإنشاء خطوط معدلة وراثيا تظهر معدلات انتقال جزئية ومتغيرة للمصفوفات خارج الكروموسومات إلى الجيل التالي. بالإضافة إلى ذلك ، فإن المعدلة وراثيا عبارة عن فسيفساء وتعبر عن الجين المعدل في عدد متغير من الخلايا. يمكن دمج المصفوفات خارج الكروموسومات في C. ايليجانس الجينوم باستخدام الأشعة فوق البنفسجية لإنشاء سلالات معدلة وراثيا غير فسيفسائية بمعدل انتقال 100٪ للجين المعدل وراثيا. إلى هذا الحد ، يتم فحص ذرية F1 للحيوانات المعدلة وراثيا المشعة بالأشعة فوق البنفسجية بحثا عن التي تحمل تكاملا متغاير الزيجوت للجين المعدل ، مما يؤدي إلى معدل انتقال مندلي بنسبة 75٪ إلى ذرية F2. يتمثل أحد تحديات هذه الطريقة في التمييز بين النسبة المئوية لانتقال الجينات المعدلة وراثيا في مجموعة سكانية قبل (X٪ من المعدلة وراثيا) وبعد الاندماج (≥75٪ F2 المعدلة وراثيا). وبالتالي ، تتطلب هذه الطريقة اختيار خط غير متحول وراثيا مع نسبة مئوية من المعدلة وراثيا أقل بكثير من الفصل المندلي البالغ 75٪. وبالتالي ، عادة ما تفضل الخطوط المعدلة وراثيا غير المتكاملة ذات معدل انتقال المصفوفة خارج الكروموسومات إلى الجيل التالي ≤60٪ للتكامل ، ومن الصعب تكامل الجينات المعدلة وراثيا في السلالات عالية الإرسال. نوضح هنا أن كفاءة تكامل المصفوفات خارج الكروموسومات في الجينوم تزداد عند استخدام خطوط معدلة وراثيا عالية الإرسال (≥80٪). يسمح البروتوكول الموصوف بالاختيار السهل للعديد من الخطوط المستقلة مع تكامل الجينات المعدلة وراثيا متماثل اللواقح في الجينوم بعد التشعيع فوق البنفسجي للديدان المعدلة وراثيا التي تظهر معدلا عاليا من انتقال المصفوفة خارج الكروموسومات. علاوة على ذلك ، هذه الطريقة سريعة جدا ومنخفضة استهلاك المواد. تعد إمكانية توليد خطوط مختلفة بسرعة تعبر عن جين معين متحول وراثيا متكاملا ذا أهمية كبيرة للدراسات التي تركز على نمط التعبير الجيني وتنظيمه ، وتوطين البروتين ، والإفراط في التعبير ، وكذلك لتطوير العلامات تحت الخلوية.

المقدمة

تستخدم الجينات المعدلة وراثيا على نطاق واسع في C. ايليجانس لمجموعة كبيرة من التطبيقات. عادة ما يتم إنشاء السلالات المعدلة وراثيا عن طريق حقن الحمض النووي في الغدد التناسلية الخنثى المخلوية1،2. يتم تزوين الحمض النووي الذي يحمل الجين المعدل محل الاهتمام جنبا إلى جنب مع البلازميدات التي تشفر علامات الحقنالمشترك 1،3،4. علامات الحقن المشترك هي جينات معدلة وراثيا تؤدي إما إلى التعبير عن بروتين فلوري أو إلى نمط ظاهري سلوكي أو مورفولوجي معين. يتم إعادة ترتيب الحمض النووي المحقون لتشكيل مصفوفات خارج الكروموسومات متعددة النسخ. لذلك ترتقط ال [جنس] الفائدة وال [ك-جنجن] علامة معا5,4. يتم اختيار الخطوط المعدلة وراثيا في الجيل F2 من المحقونة باتباع النمط الظاهري الناجم عن التعبير عن علامة الحقن المشترك (مضان أو نمط ظاهري معين)1. تظهر الخطوط المعدلة وراثيا معدلات انتقال جزئية ومتغيرة للمصفوفات خارج الكروموسومات إلى الجيل التالي. اعتمادا على السلالة ، ترث 10-100٪ (100٪ كحدث نادر) من مصفوفات خارج الكروموسومات. بالإضافة إلى ذلك ، فإن المعدلة وراثيا عبارة عن فسيفساء وتعبر عن الجين المعدل في عدد متغير من الخلايا. من المحتمل أن ترتبط هذه الفسيفساء بمعدل الانتقال إلى الجيل التالي. في الواقع ، في كل من السلالة الجرثومية والخلايا الجسدية ، يعتمد معدل الانتقال على فصل المصفوفات خارج الكروموسومات أثناء انقسامات الخلايا. تتمثل إحدى طرق تجنب هذه المشكلة في دمج الجين المعدل في الجينوم. تقليديا ، يعتمد دمج الجين المعدل في الكروموسوم على التشعيع (الأشعة فوق البنفسجية أو جاما) للديدان المعدلة وراثيا التي تحمل مصفوفات خارج الكروموسومات3. باختصار ، يتم تشعيع 50-100 خنثى في مرحلة اليرقات L4. في الجيل F1 ، يتم اختيار 200-800 معدل وراثيا وزراعته بشكل فردي على أطباق. وفقا للفصل المندلي ، فإن المعدلة وراثيا F1 التي تحمل تكاملا متغاير الزيجوت للجين المعدل في الجينوم ستنتج 1/2 من الأحفاد المعدلة وراثيا متغايرة الزيجوت للمصفوفة المتكاملة ، و 1/4 من الأحفاد المعدلة وراثيا متماثلة الزيجوت للمصفوفة المتكاملة ، و 1/4 من الأحفاد الذين لم يدمجوا المصفوفة (الشكل 1). وبالتالي ، يتم فحص الألواح التي تحتوي على الجيل F2 بصريا بحثا عن ≥75٪ من المعدلة وراثيا كما لوحظ من خلال التعبير عن علامة الحقن المشترك. يفترض أن حوالي 1/3 من F2 المختارة لكونها مرشحة متكاملة متماثلة الزيجوت للمصفوفة المتكاملة وتنتج 100٪ من F3 متماثلة اللواقح. ومن ثم ، من كل لوحة مختارة ، يتم استزراع ثلاثة إلى ثمانية F2 معدلة وراثيا بشكل فردي ويتم اختيار الصفائح التي تحتوي على 100٪ من أحفاد الجين المعدلة وراثيا. بعد ذلك ، يتم استزراع ثمانية F3 بشكل فردي لتأكيد وراثة الجين المعدل وراثة بنسبة 100٪.

العيوب الرئيسية لهذه الطريقة هي أن

< نوع العنوان = "أنا">
  • يتطلب شاشة مرئية لعدة مئات من لوحات F1 لذرية F2 المعدلة وراثيا بنسبة ≥75٪ ، وهو ما يستغرق وقتا طويلا بسبب النسبة المئوية المتغيرة وغير المتوقعة لانتقال المصفوفات خارج الكروموسومات غير المتكاملة. بدلا من ذلك ، لتجنب فحص صفائح F1 ، يمكن تنفيذ العديد من خطوات التجويع اللاحقة بعد تشعيع P0. يليه قطف 100 معدل وراثيا وفحص ذرية معدلة وراثيا بنسبة 100٪3.
  • لا يتم تكييفه مع السلالات التي تظهر نسبة مئوية من انتقال المصفوفة خارج الكروموسومات أعلى من 60٪ حيث يصعب تمييز هذه النسبة المئوية عن 75٪.
  • نظرا لأنه يمكن استخدام السلالات ذات معدل الانتقال المنخفض نسبيا فقط ، فمن الضروري وجود عدد كبير من المعدلة وراثيا P0 المشعة بالإضافة إلى مراقبة العديد من F1 و F2 ، وهو أمر يستغرق وقتا طويلا ويتطلب عددا كبيرا من الألواح.

    • يفترض أن يؤدي تشعيع الديدان إلى حدوث فواصل مزدوجة الخيط في الحمض النووي ويحدث تكامل المصفوفات خارج الكروموسومات في الكروموسومات أثناء إصلاح الحمض النووي. وبالتالي ، فمن المحتمل أن تتناسب فرص الحصول على تكامل ناجح بوساطة التشعيع طرديا مع عدد خلايا الخط الجرثومي التي تحمل مصفوفة خارج الكروموسومات. قد تحتوي السلالات ذات معدل الإرسال المرتفع على مصفوفات الحمض النووي المعدلة وراثيا أكثر من السلالات ذات معدل الإرسال المنخفض كما هو مقترح في2 ، وتظهر عددا أكبر من خلايا الخط الجرثومي التي تحمل مصفوفات خارج الكروموسومات. وبالتالي ، استنتجنا أنه في خطوط الإرسال العالية ، قد يكون دمج الجينات المعدلة وراثيا أسهل من الخطوط ذات معدل الإرسال المنخفض. ومع ذلك ، فإن البروتوكول القياسي يستبعد إمكانية دمج الجينات المعدلة وراثيا بتردد انتقال عال حيث يصعب تمييز النسبة المئوية للحيوانات المعدلة وراثيا ذات المصفوفة خارج الكروموسومات غير المتكاملة عن ذرية F1 يحمل تكاملا متغاير الزيجوت للجين المعدل في الجينوم (الشكل 1).

    نوضح هنا أنه بالنسبة لجين معين ، يعتمد عدد الخطوط المتكاملة التي تم استردادها بعد التشعيع بالأشعة فوق البنفسجية (UV) على النسبة المئوية الأولية لإرسال المصفوفة غير المتكاملة. نقدم بروتوكولا محسنا لتكامل الجينات المعدلة وراثيا بوساطة الأشعة فوق البنفسجية والذي يرتبط بشكل خاص بالخطوط التي تظهر معدلا عاليا من انتقال المصفوفة المعدلة وراثيا.

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    البروتوكول

    1. زراعة الديدان الخيطية المعدلة وراثيا قبل الاندماج

    يمكن إنشاء

    الخطوط المعدلة وراثيا كما هو موضح في1. تحتوي هذه الخطوط عادة على بلازميد علامة الحقن المشترك يؤدي إما إلى التعبير عن بروتين فلوري أو إلى نمط ظاهري سلوكي أو مورفولوجي معين في مرحلة تطورمعينة 1،3. يمكن تطبيق بروتوكول التكامل هذا على السلالات التي تعبر عن علامات الحقن المشترك الفلورية أو غير الفلورية. في المثال التالي ، تم استخدام سلالة ذات علامة حقن الفلورسنت.

    1. تحضير لوحات الثقافة:
      1. قم بإعداد حوالي 500 60 مم من أطباق بتري كبيرة مصبوبة بشكل معقم مع 10 مل لكل من وسط نمو الديدان الخيطية (NGM) 6،7.
      2. قم بزرع كل طبق ب 0.3 مل من الإشريكية القولونية المشبعة OP50 باتباع الإجراء القياسي6،7.
    2. تقييم معدل انتقال الخط المعدل وراثيا المراد دمجه:
      1. لكل خط معدل وراثيا ، اختر عشرة بالغين من الفلورسنت في عشر لوحات استزراعية منفصلة تحت مجسم الفلورسنت باستخدام معول دودة كما هو موضح في7.
      2. استزراع في حاضنة للديدان عند 15-25 درجة مئوية (حسب الخلفية الجينية) للسماح للديدان بالتكاثر.
      3. راقب النسل كل يوم لتقييم المرحلة التنموية التي يتم فيها التعبير عن علامة الحقن المشترك ويمكن ملاحظتها بشكل أفضل. لوحظ التعبير عن معظم علامات الحقن المشترك المستخدمة حاليا في مرحلة اليرقات L4 أو في مرحلة البلوغ.
      4. تقييم معدل انتقال النسل من خلال تحديد النسبة المئوية لذرية الفلورسنت عن طريق الملاحظة تحت مجسم الفلورسنت.
    3. اختر خطا معدليا وراثيا لتكامل الجينات المعدلة وراثيا:
      1. حدد الخط المعدل وراثيا بأعلى معدل نقل ممكن (من الناحية المثالية ≥80٪).
    4. الحصول على مجموعة من المعدلة وراثيا متزامنة في مرحلة اليرقات L4 للتكامل:
      1. اختر 30 بالغا من الفلورسنت في خمس أطباق استزراعية (ستة حسب الطبق).
      2. دع الديدان تضع البيض لمدة 3-4 ساعات عند 15 درجة مئوية.
      3. تخلص من البالغين من الأطباق بعد التحقق من وجود 30 بيضة على الأقل حسب الطبق.
      4. استزراع في حاضنة للديدان عند 15-25 درجة مئوية حتى يصل النسل إلى مرحلة اليرقات L4 (96 ساعة عند 15 درجة مئوية أو 36 ساعة عند 25 درجة مئوية).
    فئة

    2. التشعيع بالأشعة فوق البنفسجية واستعادة الديدان المعدلة وراثيا

    1. تشعيع الدودة:
      1. اختر 30-100 فلورسنت معدل وراثيا L4 على ألواح استزراع منفصلة (15-20 حسب الطبق).
      2. ضع الألواح ، مع إزالة الأغطية ، في رابط متقاطع للأشعة فوق البنفسجية. تشعيع الديدان عند 0.012 جول / سم2. لاحظ أن السلالات أكثر أو أقل حساسية للأشعة فوق البنفسجية وأن النتائج يمكن أن تكون متغيرة اعتمادا على جهاز الأشعة فوق البنفسجية المستخدم. يمكن اختبار نطاق الجرعة بين 0.010-0.015 جول / سم2.
    2. تعافي الديدان بعد التشعيع:
      1. ضع الأطباق التي تحتوي على ديدان مشعة طوال الليل عند 15 درجة مئوية للتعافي.
      2. تحقق من عدد الحية. في أيدينا ، يتم تكييف معدل البقاء على قيد الحياة من حوالي 80-90٪ من أجل تشعيع فعال.
      3. قم بزراعة المشععة عند 15-25 درجة مئوية حتى يصل النسل إلى مرحلة النمو مما يسمح بملاحظة تعبير علامة الحقن المشترك ، كما هو موضح في الخطوة 1.2.

    3. عزل الخطوط المعدلة وراثيا المتكاملة

    1. اختيار F1:
      1. مفردة من 150-200 فلورسنت F1 على ألواح استزراع منفصلة. بالنسبة لخطوط الإرسال العالية (≥80٪) ، تكفي 100 F1.
      2. احتفظ بألواح F1 هذه عند 15-25 درجة مئوية حتى يصل النسل إلى المرحلة المناسبة لمراقبة F2 الفلورية.
      3. تخلص من جميع لوحات F1 التي تظهر إما أنا) لا يوجد ذرية ، مما يشير إلى أن F1 كان معقما أو مات ، أو ب) لا يوجد أو فقط عدد قليل من الفلورية F2 ، مما يشير إلى أن F1 لم ينقل الجين المعدل بالمعدل المتوقع. هذه الخطوة سريعة وتمثل ميزة حقيقية عند مقارنتها بالبروتوكول القياسي الذي يتطلب تقديرا للنسبة المئوية لديدان F2 الفلورية من أجل تحديد لوحات F1 التي تظهر ≥75٪ ذرية فلورية (الجدول 1).
    2. اختيار F2:
      1. أربعة فلورية معدلة وراثيا F2 من كل لوحة F1 مختارة. عند استخدام الجينات المعدلة والفلورسنت (على سبيل المثال mCherry8 أو gfp9 أو dsRed10) ، اختر ديدان F2 ذات المستوى العالي من التألق لأن هذا قد يشير إلى أن هذه متماثلة اللواقح للمصفوفة المتكاملة. لاحظ أنه عند قطف F2 ، من الأهمية بمكان عدم حمل البيض أو اليرقات ، لتجنب السلبيات الكاذبة في الخطوة التالية.
      2. تنمو F2 عند 15-25 درجة مئوية.
    3. عزل السلالات المعدلة وراثيا المتكاملة والتحقق من صحتها:
      1. لوحات الشاشة F2 للديدان الفلورية المعدلة وراثيا F3 بنسبة 100٪. الشاشة سريعة جدا لأن وجود دودة واحدة غير فلورية يشير إلى أنه يجب التخلص من اللوحة. سيعطي F2 متماثل اللواقح للجين المعدل المتكامل ذرية فلورية متماثلة اللواقح بنسبة 100٪.
      2. ثمانية فلورية F3 مفردة من لوحات مختارة لتأكيد وراثة الجين المعدل وراثة بنسبة 100٪. من الناحية النظرية ، يكفي اختيار واحد في هذه الخطوة. ومع ذلك ، قد يكون اختيار ثمانية فلورية F3 ضروريا لتجنب اختيار غير الخصبة أو غير الصحية لأن التشعيع يمكن أن يؤدي بشكل عشوائي إلى حدوث طفرات تؤثر على الجينات المهمة لفسيولوجيا الديدان.
      3. إذا أمكن ، احتفظ بالعديد من السلالات المعدلة وراثيا المتكاملة المستقلة ، أي السلالات المستردة من F1 المختلفة.

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    النتائج

    أُجريت عمليات دمج الجينات المنقولة في خطين مختلفين ينقلان مصفوفات خارج صبغية بتردد متماثل تقريباً (50-60%) باستخدام البروتوكول القياسي والبروتوكول المطور (الجدول 1). أتاح البروتوكول القياسي استعادة ثلاثة خطوط مدمجة مستقلة بعد تعريض 91 حيواناً من المرحلة L4 المعدلة وراثياً للأشعة فوق البنفسجية، بينما أتاح البروتوكول المطور استعادة خط مدمج واحد بعد تعريض 30 حيواناً من المرحلة L4 المعدلة وراثياً للأشعة فوق البنفسجية. يشير هذا إلى أن كفاءة الدمج متشابهة في كلا البروتوكولين (خط مدمج واحد لكل 30 حيوان L4 معرض ...

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    المناقشة

    يوفر البروتوكول الموصوف هنا طريقة فعالة لدمج المصفوفات المعدلة وراثيا خارج الكروموسومات في جينوم C. ايليجانس. باستخدام خطوط مختلفة غير متكاملة ، والتي نقلت نفس الجينات المعدلة وراثيا Pdyc-1: :d yc-1 :: gfp (pKG45) بمعدلات مختلفة (10-15٪ ، 50-60٪ ، و >80٪) ، أظهرنا أن عدد السلالات المتكاملة التي تم استردادها بعد الأشعة فوق البنفسجية يعتمد على المستوى الأولي لانتقال الخط غير المتكامل (الجدول 2). لذلك ، من الأسهل دمج الجينات المعدلة وراثيا في الخطوط التي تظهر معدل انتقال مرتفع.

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    الإفصاحات

    يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصلحة مالية متنافسة.

    شكر وتقدير

    يود المؤلفون أن يعرب عن تقديرهم لكلير ليكرويسي ولوران سيغالات لتوليد Pdyc-1 غير متكامل: :d yc-1::gfp; السلالات المعدلة وراثيا Pmyo-2: :d sRed و Pmyo-3:: gfp. نشكر آندي فاير على هدية البلازميد الأحمر Pmyo-2: :d s و Pamela Hoppe على هدية البلازميد Pmyo-3:: gfp. تم تأسيس هذا العمل من قبل المركز الوطني الفرنسي للبحث العلمي (CNRS) وجامعة كلود برنارد في ليون.

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    المواد

    قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
    الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
    AgarProlabo20768.292لتحضير NGM (وسط نمو الديدان الخيطية) (6،7)
    كلوريد الصوديومChimie-Plus40045لتحضير NGM
    Bacto-peptoneBD211820لتحضير
    NGM KH2< / sub>PO4< / sub>Roth3904-1لتحضير NGM
    K2< / sub>HPO4< / sub>Prolabo26930.293لتحضير NGM
    MgSO4< / sub>RothP027.2لتحضير NGM
    CaCl2< / sub>Prolabo22317.297لتحضير NGM
    الكوليسترولRectapurلتحضير NGM
    LB-brothSigmaL3022لاستزراع OP50 معدات
    البكتيريا UV الرابط المتقاطعفيشر الطول254 نانومتر
    مجهر Stereo Discovery V8Carl Zeiss، Inc.
    أطباق بتري ، 60 ممCMLBPS55E6
    سلك بلاتينيوم 0.25 ممAlfa Aesar7440-06-4لاختيار الديدان (7)
    الموجي العلمي

    المراجع

    1. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833(2008).
    2. Mello, C., Kramer, J. M., Stinchlomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10 (12), 3959-3970 (1991).
    3. Transformation and microinjection. WormBook. Evans, T. C. , The C. elegans Research Community, WormBook. (2006).
    4. Hobert, O. PCR Fusion-Based Approach to Create Reporter Gene Constructs for Expression Analysis in Transgenic C. elegans. BioTechniques. 32, 728-730 (2002).
    5. Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).
    6. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
    7. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis. J. Vis. Exp. (47), e2293(2011).
    8. Merritt, C., Rasoloson, D., Gallo, C., Voronina, E., Ko, D., Seydoux, G. A modular vector kit for transgenesis in C. elegans. International Worm Meeting. , (2007).
    9. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Green Prasher, D. Fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
    10. Fleenor, J., Fire, A. Discosoma sp. Red Fluorescent Protein (dsRED) as a reporter in C. elegans. Worm Breeder's Gazette. 16 (3), 16(2000).
    11. Lecroisey, C., et al. ZYX-1, the unique zyxin protein of Caenorhabditis elegans, is involved in dystrophin-dependent muscle degeneration. Mol. Biol. Cell. , (2013).
    12. Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157 (3), 1217-1226 (2001).
    13. Frøkjaer-Jensen, C., et al. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nat. Genet. 40 (11), 1375-1383 (2008).
    14. Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination. Nat. Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    إعادة الطباعة والأذونات

    طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

    طلب إذن

    الوسوم

    F1 F2

    مقالات ذات صلة