يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

?????? PCR ????? ??????? ?? ?????????? ????? ???????? ????? ?? ????? ??? ?????? ?? ????????? ??????

11.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/50779

⸱

سبتمبر 5, 2013

 ,  , 
1Centre for Antimicrobial Resistance, Alberta Health Services / Calgary Laboratory Services / University of Calgary, 2Department of Pathology & Laboratory Medicine, University of Calgary, 3Department of Microbiology, Immunology and Infectious Diseases, University of Calgary, 4Department of Medicine, University of Calgary, 5The Calvin, Phoebe and Joan Snyder Institute for Chronic Diseases, University of Calgary

في هذه المقالة

إشعار تصحيح

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

ملخص

نعرض مقايسة تفاعل البوليميراز المتسلسل البسيطة متعددة الإرسال للفحص السريع والكتابة لأنواع المكورات العنقودية المكورات العنقودية (SCCmec) من النوع I-V للمكورات العنقودية الذهبية المقاومة للميثيسيلين ، ونوفر بعض الخطوات الحيوية والفروق الدقيقة الإجرائية التي تجعلها ناجحة في تكييف هذا الاختبار مع المختبرات الفردية.

الملخص

?????????? ????? ???????? MEC (SCC MEC) ??????? ?? ???? ?????? ???? ??? ???? ??????? ???????? ????? ??????? ?? ????????? ?????? ???????? ????????? ??????? (????????)? ????? ?? ???? ??????? ?? ??????? ???????? MRSA (CA-MRSA) ???? ???? ??? ?????? ???????. ?????? ??????? PCR ????????? ????? SCC MEC ?? ???? ??????? ?????? MEC ??????? ?CCR ????? ????? ?????? ???? ????? ??????? ?????? ?? ??????? ???????? ??????? ??????? PCR ???????. ???? ?????? ???? ?????? ????? ???? PCR ???? ??? ????? ?????? MEC SCC ???????? ??????? ?? ????? ??? ??????? ???? ?????? ??? ???? ????????? ????? ??????? ???????. ??? ????? ???? ??????? ??????? ????? MEC SCC ?? ?? ??? ????? ?? ????? ????? ???????? ??? ???? ???? ?? ???? ????? ??????. ??? ???? ????? ?NAT ????????? ?????? ?? ????? ?????? ?????? ?? ??????? ?????? ?? ?? ???? ???? ?????? ??????? ?????? ?? ??? ???????? ?????? ???????. ?????? ????? ????? MRSA SCC MEC ??????? ???? ??? ???? ????? ????? ????? ?????? PCR ??????? ??????? ??? ??????? ??????? ??????? ??????? ????????? ???? ???????.

المقدمة

??? ????? ????????? ?????? ???????? ????????? ??????? (????????) ?????? ?? ??????? ?????? ??????? ?????? ??????? 21-67 ???? ????? ???? ???????? ????? ?????????? MEC (SCC MEC) ???? ???????? ????????? (MECA) ??????? ?????? ?? ???????? ???????? ???????? ??????? 1 . ????? SCC MEC ?? ???? ???? ???? ???????? ????????? ?????? ?? ???????? ??????? ???????? (???? ??????? MEC ????? ??????? CCR)? ?-J ??????? (????? 1). ?????? ?????? ?? ??????? MEC IS 431mec? ????? ???????? ????? ?? ?????? ?? ??????? ?????????? mecR1 ?MECI? ?? ??? ?? ???? ??????? CCR ?????? recombinases (CCR / ccrAB) ???? ????? ????? SCC MEC ?? ??????? ??? ?? ???????? ????????? 1. ????? ????? ?? ????? MEC ??????? ???????? (mecB ????? ????? ????? ??????) ????? ????? ???? ?????? ????? ????? ?? MECA ????? 2. ?????? ???? ?????? MEC SCC ?? ??????? J (J1? J2? ?J3) ???? ??? ??? ????? ??????? ????????? CCR ???? ?????? ??? ??????? ??????? ?? ?????. ???? ??? ????? ?? MEC ??????? (??? A? B? C? D ? E) ?allotypes ?? ???? ?????? ????????? ??????? (??? 1-8) ?????. ??????? ?????? ?? ??? ?????? ?allotypes ???? ????? ????? ????? MEC SCC. ???? ??????? ????????? ?? SCC MEC ??????? ???????? ?? ??? ?????? ????? ??????? ???? ????? ?????????? ????? ????? ???????? (IWG-SCC)? ??? ????? SCC ????? MEC ??? ????? ????? ??? ????? MEC ??????? ??????? CCR? ????? ???? ?? ??????? ??? ????? ????? ???? ?????????? ?? ????? ?????? J ??????? 1. MRSA??? ???? ????? ????????? ????????? ?? ??? ????? SCC ????????? ??????? MEC ???????? ?? ??? ???? ????? (??? / ??????) ?????? ??????? ?????? ??? ???????? ??? multilocus ??????? ????? (ST) ? / ?? ?????? ?????????? A ????? (SPA) ??????? (??? ???? ?????? ST8 -T008-MRSA-IVA). ?????? SCC MEC ??????? ?? ???? ?????? ???? ??? ???? ??????? ???????? ?????? ????? ?? MRSA? ?? ???? ?? ???? ??????? ?? ??????? ???????? MRSA (CA-MRSA) ???? ???? ??? ?????? ???????.

?????? ??????? PCR ????????? ????? SCC MEC ?? ???? ??????? ?????? MEC ??????? ?CCR ????? ????? ?????? ???? ????? ??????? ???? ?? (20 ??? 30) ??????? ???????? ??????? ??????? ??????? PCR. ?????? ??????? ??? ???? ??????? ???? 21 ??????? ??????? ?? ????? ??????? PCR ???? ?? ????? SCC MEC I-??? 3. ????? ??????. ??????????? quently ??? ???? ??????? ?????? ???? ?????? ?????????? MEC? ????????? ????? ?? ??????? J-? ????? ????? ???? ??? ??? ???? ?? ??????? ????? ????? PCR ?????? 4. ?????? SCC MEC ???????? ??? ???? ?????? PCR (M-PCR) ????????? ?????? ??????? ???? ???? ??????? ?? ????? PCR ????. ?? Lencastre ??????? ?????? M-PCR ???? ???? ??SCC MEC I-IV? ???????? ?? ??? ???? ?SCC MEC ??????? ?? ?????? M-PCR ?????? SCC MEC ????? ?????? 5?6?7. ??? ???? ??? ????????? ???? ????? ?? ?????? ????? 2 ???? ????? ?? ??? ????? SCC MEC ????? ??????? ????? ??? ??? ????? ????? ??? typeable. ?? ?????? ?????? SCC MEC ???????? ???? ?????? ???? ?????? ????? ??? PCR ???? ???? ?? ????? ?????? MEC SCC ???????? ??????? ?? ????? ??? ?????? 8? ???? ????????? ??? ????? ????????? ??????? ?ecame ??????? 9. ??? ????? ???? ??????? ??????? ????? MEC SCC ?? ?? ??? ????? ?? ????? ????? ???????? ??? ???? ???? ?? ???? ????? ?????? (337 ?? SCOPUS? ????? 30 ????? 2013). ??? ??????? ??????? ?????? ?????? ?? ??????? ?????? ??? ???????? ?? ?????? ????? ??? ???????? ???? ?? ?? ?????? MRSA SCC MEC ???????. ???? ?????? ?????? ????? ???? ???? ?? ??????? ?????? ?? ?? ???? ???? ?????? ??????? ?????? ?? ??? ???????? ?????? ???????. ?????? ????? ????? MRSA SCC MEC ??????? ???? ???? ???? ????? ????? ????? M-PCR ?SCC MEC ???????? ???? ?? ?????? ??? ??????? ??????? ??????? ??????? ????????? ???? ???????.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

?????? ????? ??? ????????? ?? ???? ??????? ????????? ????? 2 ????? ?????. ????? ??????? ??????? ???????? ??? ???????? ???????? ????? ????? ?? ?????? ?? ???? ???????.

1. ????? ??????

  1. ?????? ??????? ???????? ???? ??? ???? ?????? ?? ??? ????????. ?? ????? ??? PCR ?? ???? ????? ?????? ??? ??? ??????? ????? ?? ??? ???????? ???? ??????? ??????? ?????? ?? ??????? ?? ????????? ??? ???? ?????? ????? (TSA) ????. ???? ????? ????? ?????? ??? ???? ?????. ?????? ??? ???? ?????? ?? 37 ???? ?????.
  2. ????? 75 ???????? ?? ????? ?????? ?????? ??? ????? microcentrifuge 1.5 ??. ??????? ??? ??????? ??????? ?????? ???? ????? ?? ????????? ?? ?? ??? ???? ?????? ???????. ????? ????????? ?? ????? ?????? ?????? ?? ??? (????? 2). ???? ?????? ???????.
  3. ?????? ???????? ?? ???? ??????? ?????? ???? ?? 95 ???? ????? ???? 10 ????? ???? ????????? ???????? ????? ??????.

??????: ??? ??? ?? ????????? ????? ??? ?? ????? ?????? ??? ????? ????? PCR. ???????? ??? ???? ???? ??????? ???? ?? 95 ???? ????? ?? ??????? ???? ?? 10 ????? ??? ????? ????? PCR.

  1. ????? ????? ?? ???? ??????? ??????? ?????? ?? ???? ????? ?????? ???? 5 ?????.
  2. ????? ????? ??????? ??????? ?? 13?000 ???? ?? ??????? ???? 1 ?????? ???? ?????? ??????? ????? ???? ????? ????? ??? ????? ??????. ????? ????? ??????? ?? -20 ???? ????? ?????????? ?? ????????.

??????: ??? ???????? ???? ???? ????? ????????? ?????? ????? microcentrifuge ?? ??????? ??????? ?????? ?? ???? ????? ?????? ?????? ?????? ?????. ??? ??? ?? ?? ????????? ????? ????? ????? ??????? ??????.

??????: gDNA ?? ??? ?? ????? ???? ????? ??? ?? ??? ??????? chelex 10? ?? ??????? ?????? (QIAmp DNA ??????? ???? QIAGEN) ?? ???? ?????.

itle "> 2. ????? PCR

??????: ????? ?? ???? ?? ????? ?????? ?? ????? PCR ?????? ??? ???? ?????? ?? ????? ?????? ?????? ???????? ?? ???? ??????? IIA? ???????? IVA? ???? IVC? ?????? ??? ?????? ??? ????? ?????? ????? ????? ????? ???? ???????. ????? ?????? ?????? ???? ?? ???? ??? ??????? ?? ??? ???? ???????? ?????? ????? ?? ????? ?? ???????.

  1. ????? ??????? PCR? ??? ?? ??? ?????? PCR 10X (???? MgCl 2)? 50 ??? MgCl 2? dNTPs ????????? ?? ??????? -20 ???? ????? ??????? ?????? ?????? ??? ????? ??????? PCR ????? (?? ????????? ?? ????? ?????? ????) ?? ???? ????? ??????. 0.2 ?? ?????? PCR ???? ????? ???? ?? ??? ?????.
    ??? ???? ???? ???? ??????? ????? ?? ??????? ?? dNTPs ???? ???? ?? ???? ??? ??????? ??? ????? ??????:
    1. ????? ??????? ?? ???? ????? ?????? ??????? ??? 10 ???????? ???? ???? ?????? ?????? ??????. ????? ?? ??? ?????? ???????? ????? ????? ??????? ??? ???? ????? -20 ???? ????? ?????????? ?? ???????? ?????.
    2. ????? dNTPs ?? ???? ????? ?????? ???????? ??? ?? ??????? ???? ????? ??? 2 ???????? ??? dNTP. ?? ??? ????? ??? ????? ????? / ??????? ?? dNTPs ??????? ???????? ?? 10 ???????? ??? dNTP ???? ?? ???? ??? ??????? ?? ??? ????? ? 50 ???????? ?????? ??? ?? 0.5 ?? ?????? microcentrifuge ???????? ?? -20 ???? ?????. ??? ??????? ??? ????? ????? ?? 10 ???????? ??????? ??? 2 ???????? ??? dNTP ?? ???? ????? 200 ???????? ?? ????? ?????? ???????.
  2. ????? ??? ?????? ????? ????? ????? ???? ???? ???????? ?? ????? ??? ?? ?????? ??? 1. ?? ????? ?? ??????? ???????? ?? ??????? DNA (??? ????? ?? ?? ???????) ??? ??? ??? ??? ?? ???? ??? ???? ???????. ????? ??? ????? ???? ???????? vortexed ????? ????? ???? ?aliquoted ?? ?????? PCR ???????.
  3. ????? ???? ?????? PCR ????????? ??? ????? ??????? ????? ?????. ????? ?????? ??? ?????? PCR ?????? pipetting 2 ???????? ?? ??????? ?? ??????? ????????? ???? ?????.
  4. ???????? ??? ???? ???? ??????? ???? ?????? ?? cycler ???????? ????? ?????????? ??????: 94 ???? ????? ???? 5 ?????? ????? 10 ????? ?? 94 ???? ????? ? 45 ????? ? 65 ???? ????? ? 45 ?????? 72

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يستطيع تفاعل M-PCR المحدث هذا تحديد (تصنيف) أنواع SCCmec من I إلى V، بالإضافة إلى الأنواع الفرعية الرئيسية لـ SCCmec IV. يستهدف الاختبار مواقع فريدة ومحددة لكل من SCCmec I وII وIII وIVa وIVb وIVc وIVd وIVE وV، مع الكشف المتزامن عن جين mecA. كما يمكن التعرف بشكل مبدئي على SCCmec VI وVIII، ولكن هذا يتطلب اختبارات إضافية للتأكيد. يوضح الشكل 3 نماذج ممثلة لـ SCCmec I-VI وVIII ومواقع كل هدف داخل العنصر.

تستهدف البادئات النوعية م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يوفر اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل المتعدد الموصوف هنا طريقة بسيطة وموثوقة لتصنيف الأنواع والأنواع الفرعية الرئيسية من المكورات العنقودية المكورات العنقودية ، مع التمييز المتزامن ل MRSA من MSSA. الفحص قوي ، ويتم إجراؤه بسهولة في تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل واحد ويسهل تفسير النتائج. يحتوي الاختبار على قيود من حيث أنه يستهدف المواقع الفردية داخل كل نوعمن أنواع SCC mec ، ولكنه لا يقدم كتابة معقدة شاملة ل ccr و mec ، وبالتالي لا يمكن اعتباره معيارا ذهبيا. بغض النظر ، أثبت ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لم يتم الإعلان عن تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

نشكر T. Ito و K. Hiramatsu و R. Daum و H. de Lencastre و D. Coleman على الهدية اللطيفة لبعض السلالات المرجعية المستخدمة في هذه الدراسة. تم دعم هذا العمل جزئيا ماليا من قبل مركز مقاومة مضادات الميكروبات (CAR) ، خدمات ألبرتا الصحية - كالجاري / خدمات مختبر كالجاري / جامعة كالجاري.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
تروبتيك فول الصويا أجارفيشر (BD)CA90002-700 (236920)
الماء المقطر المعقمLife Technologies10977-015
Platinum Taq: بما في ذلك 10x PCR المؤقت و 50 ملي مولار MgCl2< / sub>Life Technologies10966-034
100 mM dNTPLife Technologies10297-018
Tris baseSigma-AldrichT6066
حمض البوريكسيجما ألدريتشB7901
EDTALife Technologies15576-028
AgaroseLife Technologies16500-500
GlycerolLifeTechnologies 15514-011
Bromophenol blueSigma-AldrichB8026
1Kb + DNA سلمالحياة تقنيات10787-026
بروميد الإيثيديومسيجما-ألدريتشE7637
1.5 مل أنابيب الطرد المركزي VWR (Axygen Scientific)10011-700
عصي الثقافةVWRCA10805-018
أنابيب PCRDiamedAD0210-FCN (جديد #: DIATEC420-1250)
جهاز طرد مركزيEppendorf5417c
كتلة الحرارةVWR13259-030 / 13259-286
ThermalcyclerApplied Biosystems (2720)4359659
الرحلان الكهربائي للهلام الغاطسة الأفقية مع قالب هلامBioRad170-4469
مزود الطاقةBioRad164-5050
شاكر الروكVWR40000-300
الجزيئي نظام Imager Gel DocBioRad1708170
الدقيقة غرفة

المراجع

  1. IWG-SCC. Classification of staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec): guidelines for reporting novel SCCmec elements. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (12), 4961-4967 (2009).
  2. Ito, T., Hiramatsu, K., Tomasz, A., de Lencastre, H., Perreten, V., Holden, M., et al. Guidelines for Reporting Novel mecA Gene Homologues. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (10), 4997-4999 (2012).
  3. Okuma, K., Iwakawa, K., Turnidge, J. D., Grubb, W. B., Bell, J. M., O'Brien, F. G., et al. Dissemination of new methicillin-resistant Staphylococcus aureus clones in the community. Journal of Clinical Microbiology. 40 (11), 4289-4294 (2002).
  4. Kondo, Y., Ito, T., Ma, X. X., Watanabe, S., Kreiswirth, B. N., Etienne, J., et al. Combination of multiplex PCRs for staphylococcal cassette chromosome mec type assignment: rapid identification system for mec, ccr, and major differences in junkyard regions. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (1), 264-274 (2007).
  5. Oliveira, D. C., de Lencastre, H. Multiplex PCR strategy for rapid identification of structural types and variants of the mec element in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (7), 2155-2161 (2002).
  6. Milheirico, C., Oliveira, D. C., de Lencastre, H. Update to the multiplex PCR strategy for assignment of mec element types in Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (9), 3374-3377 (2007).
  7. Milheirico, C., Oliveira, D. C., de Lencastre, H. Multiplex PCR strategy for subtyping the staphylococcal cassette chromosome mec type IV in methicillin-resistant Staphylococcus aureus: 'SCCmec IV multiplex'. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 60 (1), 42-48 (2007).
  8. Zhang, K., McClure, J. A., Elsayed, S., Louie, T., Conly, J. M. Novel multiplex PCR assay for characterization and concomitant subtyping of staphylococcal cassette chromosome mec types I to V in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Journal of Clinical Microbiology. 43 (10), 5026-5033 (2005).
  9. Zhang, K., McClure, J. A., Conly, J. M. Enhanced multiplex PCR assay for typing of staphylococcal cassette chromosome mec types I to V in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Molecular and Cellular Probes. 26 (5), 218-221 (2012).
  10. de Lamballerie, X., Zandotti, C., Vignoli, C., Bollet, C., de Micco, P. A one-step microbial DNA extraction method using "Chelex 100" suitable for gene amplification. Research in Microbiology. 143 (8), 785-790 (1992).
  11. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), e3923(2012).
  12. McClure, J. A., Conly, J. M., Elsayed, S., Zhang, K. Multiplex PCR assay to facilitate identification of the recently described Staphylococcal cassette chromosome mec type VIII. Molecular and Cellular Probes. 24 (4), 229-232 (2010).
  13. Zhang, K., McClure, J. A., Elsayed, S., Conly, J. M. Novel staphylococcal cassette chromosome mec type, tentatively designated type VIII, harboring class A mec and type 4 ccr gene complexes in a Canadian epidemic strain of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (2), 531-540 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

تصحيح


Formal Correction: Erratum: Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus
Posted by JoVE Editors on 3/19/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus.  There was a typo in Table 1.

In Table 1, the Oligonucleotide sequence for Type III-F5 was updated from:

TTCTCATTGATGCTGAAGCC

To:

GAAACTAGTTATTTCCAACGG

الوسوم

SCCmec MRSA
?????? PCR ????? ??????? ?? ?????????? ????? ???????? ????? ?? ????? ??? ?????? ?? ????????? ??????
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.