طريقة كمية حساسة ومحددة لتحديد بروتين ربط الميوسين القلبي في المصل C عن طريق المقايسة المناعية الكهربائية الكيميائية

قياس الكميات المنخفضة من البروتين في العينات البيولوجية المعقدة ، مثل المصل ، له أهمية سريرية متزايدة لإدارة المرضى ، وكذلك العلوم الأساسية. على سبيل المثال ، تتوافق الزيادة في مستويات مصل المؤشرات الحيوية للقلب ، مثل التروبونين I ، في بيئة سريرية مع احتشاء عضلة القلب الحاد (MI) ¹. للكشف عن البروتينات في عينات المصل ، فإن مقايسة الممتز المناعي القياسية المرتبطة بالإنزيم (ELISA) هي التقنية الأكثر استخداما لأنها تتمتع بحساسية عالية وتسمح بالقياس الكمي المطلق للمادة التحليلية. ومع ذلك ، تتطلب ELISAs التقليدية كمية كبيرة نسبيا من العينة (عادة 100 ميكرولتر) ، ولها إشارة خلفية عالية في بعض السوائل البيولوجية ، وتقتصر على قياس مادة تحليلية واحدة فقط لكل ELISA².

في الآونة الأخيرة ، تم تقديم تقنية جديدة للمقايسة المناعية تتحايل على العديد من هذه العيوب. يستخدم هذا الاختبار المعدل ، الذي طورته MSD ، التلألؤ الكيميائي الكهربائي (ECL) للكشف عن الإشارة ، مما يسمح بخلفية منخفضة جدا وحساسية متزايدة ، مما يتيح استخدام أحجام عينات صغيرة. يعتمد التلألؤ الكيميائي الكهربائي على جزيء المراسل الروثينيوم (II) trisbipyridal ، والذي يرتبط بالأجسام المضادة للكشف. ينبعث جزيء المراسل هذا من الضوء عند 620 نانومتر عند التحفيز الكهربائي لقاع اللوحة المكونة من 96 بئرا والتي تحتوي على أقطاب كهربائية كربونية مدمجة^{فيها 3}. أيضا ، باستخدام الطلاء الموضعي ، يمكن طلاء الأجسام المضادة المتعددة في بئر واحد (حتى 10 على لوح مكون من 96 بئرا) ، مما يسمح بالقياس الكمي المتزامن للبروتينات المختلفة في عينة^{واحدة 4}. تم استخدام هذه التقنية مؤخرا لقياس ملامح السيتوكين المسببة للالتهابات في المصل^5،6. تقارن لوحات تعدد الإرسال من MSD بشكل إيجابي مع منصات الفحص المتعدد الأخرى⁷.

< p class = "jove_content">باستخدام MSD كمنصة اختبار أساسية ، قمنا بتطوير لوحة 3-plex مخصصة يمكنها تحديد مستوى بروتين ربط الميوسين القلبي C (cMyBP-C) ، والكرياتين كيناز MB (CK-MB) ، والتروبونين القلبي I (cTnI) ، وتمت مقارنة النتائج بالكشف الأحادي عن cMyBP-C. CK-MB و cTnI هي مؤشرات حيوية راسخة ل MI. ومع ذلك ، يمكن أن تحدث الزيادات في هذه المؤشرات الحيوية بسبب أمراض أخرى غير MI ، مثل التهاب عضلة القلب أو الفشل الكلوي⁸. هذا يجادل في إضافة مؤشرات حيوية إضافية لزيادة خصوصية تشخيص MI. لقد أظهرنا مؤخرا أن cMyBP-C هو أيضا مؤشر حيوي محتمل ل MI⁹. cMyBP-C هو بروتين مرتبط بخيوط سميكة يتم التعبير عنه في القلب ، ^10-12 ولكن ليس في العضلات الهيكلية أو الملساء. وبالتالي ، فإن زيادة مستوى cMyBP-C في الدورة الدموية هو مؤشر محدد لتلف القلب¹³.

في هذه الدراسة ، قارنا الكشف أحادي الإرسال ل cMyBP-C باستخدام اختبار 3-plex مخصص لقياس مستويات مصل cMyBP-C و CK-MB و cTnI في مصل المرضى الذين يعانون من MI. في المستقبل ، يمكن استخدام تقنية التوقيع هذه لتشخيص عضلة القلب في المرضى الذين يعانون من ألم في الصدر في غرفة الطوارئ.

وافق مجلس مراجعة المؤسسة (IRB) التابع لجامعة لويولا في شيكاغو على الدراسة لاستخدام عينات بشرية مجهولة الهوية واستخدام المقايسة المناعية (LU # 20392).

1. فحص Uniplex cMyBP-C

1. في اليوم السابق للتجربة ، قم بتغطية اللوحة القياسية العارية MSD المكونة من 96 بئرا بجسم مضاد ملتقط. بالنسبة إلى cMyBP-C ، استخدم حجما 30 ميكرولتر من الجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد ل cMyBP-C (خال من الجيلاتين) بتركيز 5 ميكروغرام / مل مخفف في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
2. نظرا لأن البئر كاره للماء ، ضع ماصة المحلول في الزاوية السفلية من البئر ؛ ثم اضغط على جوانب اللوحة لنشر المحلول على البئر بأكمله.
3. اللوحة مغطاة بمادة مانعة للتسرب ومحتضنة O / N عند 4 درجات مئوية دون اهتزاز.
4. قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الملتقطة عن طريق النقر على المحلول فوق الحوض ثم على كومة من المناشف الورقية. يتم حظر الارتباط غير المحدد باللوحة عن طريق إضافة 150 ميكرولتر من محلول مانع 5٪ (وزن / حجم) A (BSA عالي الجودة) في PBS إلى كل بئر.
5. أغلق اللوحة واحتضانها لمدة 1 ساعة في RT أثناء الاهتزاز عند 700 دورة في الدقيقة.
6. أثناء خطوة الحجب ، قم بإعداد المعايير والعينات. اصنع السلسلة القياسية عن طريق تخفيف جزء بروتين cMyBP-C المؤتلف (الأحماض الأمينية 1 - 271) إلى تركيز يبدأ قدره 2,000 نانوغرام / مل في حاصرات A / PBS بنسبة 1٪ (وزن / حجم). ثم يخفف بشكل متسلسل بمعامل 5 في 1٪ (وزن / حجم) مانع A / PBS. تم استخدام ما مجموعه 7 معايير + 1 فارغ (1٪ (وزن / حجم) مانع A / PBS وحده).
7. قم بإزالة محلول المنع واغسل اللوحة 3x مع 150 ميكرولتر 0.05٪ (حجم / حجم) Tween-20 / PBS. في كل مرة ، قم بإزالة محلول الغسيل عن طريق قلب اللوحة فوق الحوض. بعد خطوة الغسيل الثالثة ، قم بنفض الغبار بقوة فوق الحوض واترك الطبق بقوة على طبقة من المناشف الورقية حتى يجف تماما. هذه خطوة حاسمة ، حيث أن أحجام الحضانة صغيرة ، وأي محلول غسيل متبقي سيخفف بشكل كبير من الحضانة التالية.
8. الماصة 25 ميكرولتر من المعايير والعينات في الآبار. أغلق اللوحة واحتضانها عند RT ، مع الرج عند 700 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة.
9. قم بإعداد محلول الأجسام المضادة للكشف عند 1 ميكروغرام / مل في حاصرات A / PBS بنسبة 1٪. يعمل الجسم المضاد cMyBP-C المصنوع خصيصا (الأحماض الأمينية الهاتمة 2-14) مع وضع العلامات على MSD SULFO-TAG كجسم مضاد للكشف. تتوفر المجموعات لوضع العلامات على SULFO-TAG ، مما يجعله إجراء بسيطا نسبيا لتسمية أي جسم مضاد.
10. كرر خطوة الغسيل كما هو موضح في الخطوة 1.4.
11. أضف 25 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة للكشف إلى كل بئر ، وأغلق اللوحة ، واحتضن في RT لمدة ساعة واحدة على شاكر لوحة مضبوطة عند 700 دورة في الدقيقة.
12. خلال فترة الحضانة ، قم بتشغيل لوحة العرض التوضيحي ل MSD (لوحة مع مصابيح LED) لضمان الوظيفة المناسبة لجهاز تصوير القطاع والبرامج (راجع قسم الكاشف). أيضا ، قم بتخفيف المخزن المؤقت للقراءة ، الذي توفره MSD ، عن طريق إضافة 5 مل من المخزن المؤقت للقراءة 4x إلى 15 مل من الماء المقطر.
13. كرر خطوة الغسيل كما هو موضح في الخطوة 1.4.
14. أضف 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت للقراءة إلى كل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات. تأكد من تجنب فقاعات الهواء (سحب العينات العكسي طريقة مناسبة). بعد إضافة المخزن المؤقت للقراءة، امسح اللوحة ضوئيا على الفور في Sector Imager.

< p class = "jove_title" >2. 3-plex cMyBP-C و CK-MB و cTnI

1. يسمح للوحة 96 بئر 3 بلكس ومحاليل مخففة بالتوازن مع RT قبل الاستخدام. هذه اللوحة مغلفة مسبقا بأجسام مضادة للالتقاط ل cMyBP-C و CK-MB و cTnI بواسطة MSD.
2. أضف 25 ميكرولتر من مانع A / PBS بنسبة 1٪ (وزن / حجم) إلى كل بئر. اضغط على جوانب اللوحة للتأكد من أن البئر بأكمله مغطى بالمحلول.
3. أغلق اللوحة باستخدام مادة مانعة للتسرب ، ضع اللوحة على شاكر اللوحة ، ورجها عند 700 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.
4. في غضون ذلك ، يتم إعداد سلسلة تخفيف من أجهزة المعايرة الفردية. نظرا لأن كل بئر يحتوي على ثلاثة أجسام مضادة للالتقاط ، يجب خلط ثلاثة أجهزة معايرة وتخفيفها بشكل متسلسل قبل الاستخدام. تمييع cMyBP-C ، CK-MB (MSD) ، و cTnI (MSD) معا في 1٪ (وزن / حجم) مانع A / PBS لإنشاء عينة واحدة مع 2,000 نانوغرام / مل cMyBP-C و 100 نانوغرام / مل CK-MB و 25 نانوغرام / مل cTnI (العينة أ).
5. يتم إعداد حجم نهائي لا يقل عن 100 ميكرولتر لكل معيار. لإكمال السلسلة القياسية ، قم بتخفيف العينات بشكل متسلسل بمعامل 5. أستخدم 25 ميكرولتر من العينة A في 100 ميكرولتر 1٪ (وزن / حجم) مانع A / PBS لإنشاء العينة B. ثم استخدم 25 ميكرولتر من العينة B في 100 ميكرولتر 1٪ (وزن / حجم) مانع A / PBS لإنشاء عينة C ، وهكذا دواليك. تم استخدام عينات مصل بشرية من 16 شخصا مصابا ب MI و 16 شخصا ضابطا لقياس مستويات cMyBP-C و CK-MB و cTnI. تم تخفيف هذه العينات 2x في 1٪ (وزن / حجم) مانع A / PBS.
6. أضف 25 ميكرولتر من المعايير والعينات المخففة إلى 25 ميكرولتر الموجودة بالفعل في آبار الصفيحة 3-plex. من المهم أيضا تضمين فراغ (مخفف فقط). لإنشاء هذه التقنية ، يتم تحميل العينات في ثلاث نسخ تقنية. خلاف ذلك ، فإن التكرارات كافية.
7. أغلق اللوحة مرة أخرى (يمكن إعادة استخدام مانع تسرب الألواح) واحتضنه على شاكر اللوحة (700 دورة في الدقيقة) عند RT لمدة ساعتين.
8. قبل الانتهاء من الحضانة مباشرة ، يتم تحضير محلول الأجسام المضادة للكشف. المخفف المستخدم هو 1٪ (وزن / حجم) مانع A في PBS. يتم تخفيف جميع الأجسام المضادة الثلاثة للكشف الموسومة ب SULFO معا إلى تركيز نهائي يبلغ 1 ميكروغرام / مل لكل منها. عادة ما يتم توفير الأجسام المضادة للكشف بتركيز مخزون 50 ضعفا.
9. للحصول على لوحة كاملة مكونة من 96 بئرا ، هناك حاجة إلى 2,700 ميكرولتر من إجمالي المحلول المخفف (مع تضمين خطأ في سحب العينات). أضف 54 ميكرولتر من كل جسم مضاد للكشف إلى 2,538 ميكرولتر 1٪ (وزن / حجم) مانع A / PBS.
10. بعد ساعتين ، قم بإزالة المحاليل عن طريق النقر بقوة على اللوحة فوق الحوض. اغسل الآبار 3x ب 150 ميكرولتر من 0.05٪ Tween-20 في PBS. أضف 25 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة للكشف إلى كل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات ، ويتم النقر على جوانب اللوحة للتأكد من تغطية البئر بأكمله بالمحلول.
11. أغلق اللوحة واحتضانها لمدة 1 ساعة أثناء الاهتزاز عند 700 دورة في الدقيقة.
12. خلال فترة الحضانة ، قم بتشغيل لوحة العرض التوضيحي ل MSD (لوحة مع مصابيح LED) لضمان الوظيفة المناسبة لجهاز تصوير القطاع والبرامج. قم أيضا بتخفيف المخزن المؤقت للقراءة ، الذي توفره MSD ، عن طريق إضافة 5 مل من المخزن المؤقت للقراءة 4x إلى 15 مل من الماء المقطر.
13. كرر خطوة الغسيل الموضحة في الخطوة 2.8.
14. أضف 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت للقراءة إلى كل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات. يعد تجنب فقاعات الهواء أمرا بالغ الأهمية (سحب العينات العكسي طريقة مناسبة). بعد إضافة المخزن المؤقت للقراءة، امسح اللوحة ضوئيا على الفور في Sector Imager.

يتم عرض المبادئ الأساسية وسير عمل المقايسة 3-plex في الشكل 1، ويتم وصف سير العمل الكلي في الجدول 1. تعمل فحوصات Uniplex وفقا لنفس المبدأ باستثناء أن البئر السفلي بأكمله مغطى بجسم مضاد واحد للالتقاط. يتم الكشف عن الإشارة عن طريق ECL حيث يتم تطبيق إشارة كهربائية على قاع البئر. وهذا بدوره يبدأ الإنتاج المحلي للضوء من خلال تفاعل كيميائي للمخزن المؤقت للقراءة باستخدام ملصق SULFO-TAG على الجسم المضاد للكشف. هذا يؤدي إلى الخلفية المنخفضة والحساسية العالية للمقايسة. في الشكل 2 ، تتم مقارنة المنحنى القياسي ل cMyBP-C في مقايسة أحادية الإرسال بمنحنى cMyBP-C في مقايسة 3-plex. يظهر كلا المقياسين حساسية عالية جدا ونطاقا ديناميكيا عاليا. يتم عرض مستويات الكشف ومستويات القياس الكمي في الجدول 2 وهي قابلة للمقارنة في كل من المقايسات أحادية الإرسال و 3-plex. يتم أيضا عرض مستويات الكشف عن cTnI و CK-MB في الشكل 3 والجدول 2. تم تحديد التباين بين المشغلين عن طريق قياس عينات متطابقة (ن = 2 ، 3 مكررات تقنية) بواسطة مشغلين مختلفين ووجد أن التباين منخفض (السيرة الذاتية 8.5٪). تمت دراسة التفاعل المتبادل للأجسام المضادة للكشف مع المعايرين الآخرين عن طريق احتضان المنحنيات القياسية الفردية لجميع أجهزة المعايرة الثلاثة مع الأجسام المضادة للكشف الفردي (الشكل 4). شوهدت كمية منخفضة فقط من التفاعل المتبادل بين معاير CK-MB والأجسام المضادة للكشف عن cTnI و cMyBP-C بينما لم يلاحظ أي تفاعل متبادل بين أجهزة المعايرة الأخرى والأجسام المضادة للكشف.

< p class = "jove_content" >كدليل على قابلية تطبيق الاختبار للكشف عن إصابة القلب ، تمت مقارنة مستويات المصل ل 16 شخصا مصابا ب MI مع مجموعة ضابطة (ن = 16). باستخدام لوحة 3-plex ، تم تحديد مستويات مصل cMyBP-C و CK-MB و cTnI. تمت زيادة جميع المؤشرات الحيوية الثلاثة في الأشخاص الذين يعانون من MI (انظر الشكل 5) من 3.7 ضعفا (cMyBP-C) إلى 12.2 ضعفا (CK-MB) ، على الرغم من أن التباين في مستويات المصل كان الأدنى في مجموعة cMyBP-C.   عملية اختبار Uniplex اختبار 3-plex يوم التجربة 0 لوحة معطف بجسم مضاد للالتقاط ضحاها غير متاح يوم التجربة 1 سد اللوحة 1 ساعة 30 دقيقة   تحضير العينات والسلاسل القياسية       احتضان العينات والمعايير 1 ساعة 2 ساعة   احتضان بالجسم المضاد للكشف 1 ساعة 1 ساعة   إضافة كاشف الكشف ولوحة القراءة     < p class = "jove_content" > الجدول 1. نظرة عامة على سير العمل لمقايسات أحادية الإرسال وتعدد الإرسال.   LLOD (نانوغرام / مل) LLOQ (نانوغرام / مل) ULOQ (نانوغرام / مل) cMyBP-C (أحادي) 0.126 ± 0.007 0.567 ± 0.073 400 نانوغرام / مل cMyBP-C (3plex) 0.057 ± 0.022 0.469 ± 0.171 400 نانوغرام / مل CK-MB (3-plex) 0.038 ± 0.014 0.587 ± 0.213 100 نانوغرام / مل cTnI (3plex) 0.033 ± 0.011 0.147 ± 0.053 25 نانوغرام / مل < p class = "jove_content" > الجدول 2. حدود الكشف عن معايرات أحادية الإرسال و 3-plex. يعرف LLOD ، الحد الأدنى للكشف ، بأنه التركيز المحسوب لإشارة الفارغة + 3 أضعاف الانحراف المعياري للعينات الفارغة. يتم تعريف LLOQ ، الحد الأدنى للقياس الكمي ، على أنه قيمة أعلى من LLOD ، مع معامل تباين (متبادلة نسبة الإشارة إلى الضوضاء) أقل من 20٪ ، واسترداد بين 80 - 120٪. يعرف ULOQ ، وهو الحد الأعلى للقياس الكمي ، بأنه أعلى تركيز تم تحليله يمكن قياسه بمعامل تباين أقل من 20٪ واسترداد بين 80 - 120٪. < p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "دائما" >
الشكل 1. نظرة عامة تخطيطية على اللوحة وسير العمل. أ) يتم عرض 96 لوحة بئر. كل بئر مغطى بثلاثة أجسام مضادة مختلفة ، أي ضد cMyBP-C و CK-MB و cTnI. لا يتم استخدام البقعة الرابعة المتاحة وهي مطلية ب BSA. ب) سير عمل 3-plex ELISA. يتم حظر الصفيحة المطلية مسبقا (الخطوة 1) ثم تضاف عينات المصل أو أجهزة المعايرة إلى كل بئر ويسمح لها بالالتصاق (الخطوة 2). cMyBP-C (الماس الأحمر) و CK-MB (المستطيل الأخضر) و cTnI (البيضاوي البرتقالي) ترتبط بالأجسام المضادة الخاصة بها. بعد غسل البروتينات غير المرتبطة ، تتم إضافة الأجسام المضادة للكشف المسمى SULFO-TAG (الخطوة 3). سوف ترتبط ببروتينات cMyBP-C أو CK-MB أو cTnI المرتبطة بالجسم المضاد الملتقط بها. بعد غسل الجسم المضاد للكشف غير المرتبط ، تتم إضافة المخزن المؤقت للقراءة ويتم تحليل اللوحة. تبدأ الإشارة الكهربائية إلى أسفل اللوحة تفاعلا كيميائيا محليا ل SULFO-TAG مع المخزن المؤقت للقراءة ، مما يؤدي إلى إنتاج الضوء (الخطوة 4). تتناسب كمية الضوء طرديا مع كمية الأجسام المضادة للكشف المسمى SULFO-TAG. يسجل جهاز تصوير CCD الضوء ويمكنه تمييز البقع المختلفة داخل كل بئر وبالتالي الإشارة القادمة من كل مادة تحليلية (الخطوة 5). < p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "دائما" >
الشكل 2. تم قياس المنحنى القياسي لمعاير cMyBP-C في أحادي الإرسال أو في 3-plex. تم قياس نفس السلسلة القياسية في اختبار أحادي الإرسال ، وعلى لوحة 3-plex. بدأت السلسلة القياسية عند 2,000 نانوغرام / مل وتم تخفيفها بشكل متسلسل 5x مع أدنى تركيز هو 0.128 نانوغرام / مل. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام المخفف كعينة فارغة. يتم عرض منطقة الكشف عن الفحص باللون الرمادي. يشير الخط السفلي إلى الحد الأدنى للكشف (LLOD) ، والذي يعرف بأنه التركيز المحسوب للإشارة الفارغة + 3 أضعاف الانحراف المعياري للقيم الفارغة. يتم تعريف الحد الأعلى للكشف على أنه أعلى تركيز للسلسلة القياسية التي يمكن قياسها بشكل موثوق. كل من المنحنيات القياسية أحادية الإرسال و 3-plex cMyBP-C قابلة للمقارنة. يتم عرض حدود الكشف في الجدول 2. A.U: وحدات تعسفية. < p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "دائما" >
الشكل 3. المنحنيات القياسية ل CK-MB و cTnI. المنحنيات القياسية ل CK-MB و cTnI ، والتي تم قياسها في وقت واحد مع cMyBP-C على اللوحة 3-plex. يظهر كلا المعايرين حساسية عالية ونطاق ديناميكي كبير. باللون الرمادي يتم عرض منطقة الكشف عن المقايس. يشير الخط السفلي إلى الحد الأدنى للكشف (LLOD) ، والذي يعرف بأنه التركيز المحسوب للإشارة الفارغة + 3 أضعاف الانحراف المعياري للقيم الفارغة. يتم تعريف الحد الأعلى للكشف على أنه أعلى تركيز للسلسلة القياسية التي يمكن قياسها بشكل موثوق. يتم عرض حدود الكشف في الجدول 2. A.U: وحدات تعسفية. < p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "دائما" >
الشكل 4. التفاعل المتبادل للأجسام المضادة للكشف عن 3-plex. تم تحضير منحنيات قياسية منفصلة ل cMyBP-C و CK-MB و cTnI واحتضانها على لوحة 3-plex. تم فحص كل منحنى قياسي باستخدام الأجسام المضادة للكشف الفردية ، لتقييم مقدار التفاعل المتبادل بين الأجسام المضادة للكشف الفردية (مثل cMyBP-C) والمعايرات الأخرى (مثل CK-MB و cTnI). كان التفاعل المتبادل منخفضا في اختبار 3-plex. انقر هنا لعرض رقم أكبر. < p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "دائما" >
الشكل 5. تم قياس مستويات المؤشرات الحيوية في مصل MI والأشخاص الضابطين باستخدام مقايسة 3-plex. تم قياس مستويات cMyBP-C و CK-MB و cTnI في وقت واحد عن طريق اختبار 3-plex في عينات مصل من 16 شخصا محددا و 16 شخصا مصابا ب MI. يتم عرض البيانات عن طريق مخططات الصندوق والشعيرات (تمثل الشعيرات 10و 90بالمائة). لوحظت زيادة مستويات المؤشرات الحيوية الثلاثة في مصل الأشخاص المصابين ب MI مقارنة بالمجموعة الضابطة. نظرا لأن البيانات لم تظهر توزيعا طبيعيا (تم اختباره بواسطة D'Agostino Pearson Omnibus) ، فقد تم استخدام اختبار Mann-Whitney الإحصائي غير البارامتري لاختبار الاختلافات بين مجموعات التحكم و MI. # ص < 0.001

ولا يزال طلب البراءة الكامل معلقا (الطلب المسلسل رقم 13/464,466، العدد المنشور. الولايات المتحدة 2012/0282618 A1 والتاريخ: 05/04/12) لتحديد عوامل الخطر المرتبطة بتدهور cMyBP-C وإطلاقه في سوائل جسم الإنسان وتحديد مستوى cMyBP-C في سوائل جسم الإنسان.