Method Article

طريقة كمية حساسة ومحددة لتحديد بروتين ربط الميوسين القلبي في المصل C عن طريق المقايسة المناعية الكهربائية الكيميائية

DOI:

10.3791/50786

⸱

August 8th, 2013

 ,  ,  , 
1Department of Cell and Molecular Physiology, Loyola University Chicago

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قياس المؤشرات الحيوية في العينات البيولوجية المعقدة يوجه بشكل متزايد عملية صنع القرار السريري. نصف طريقة حساسة للغاية لقياس البروتين المرتبط بالميوسين القلبي في وقت واحد ، والكرياتين كيناز MB ، والتروبونين القلبي I في عينات المصل من الأشخاص الذين يعانون من احتشاء عضلة القلب والأشخاص الأصحاء للتحكم في نفس الوقت.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أصبحت المؤشرات الحيوية أكثر أهمية في صنع القرار السريري ، وكذلك العلوم الأساسية. إن تشخيص احتشاء عضلة القلب (MI) مدفوع إلى حد كبير باكتشاف البروتينات الخاصة بالقلب في مصل الدم أو البلازما للمرضى كمؤشر على إصابة عضلة القلب. بعد أن أظهرنا مؤخرا أن بروتين ربط الميوسين القلبي-C (cMyBP-C) يمكن اكتشافه في المصل بعد MI ، فقد اقترحناه كمؤشر حيوي محتمل ل MI. عادة ما يتم اكتشاف المؤشرات الحيوية عن طريق فحوصات الممتز المناعي التقليدية المرتبطة بإنزيم الساندويتش. ومع ذلك ، تتطلب هذه التقنية حجم عينة كبير ، ولها نطاق ديناميكي صغير ، ويمكنها قياس بروتين واحد فقط في كل مرة. < p class = "jove_content">هنا نعرض مقايسة مناعية متعددة الإرسال يمكن من خلالها قياس ثلاثة بروتينات قلبية في وقت واحد بحساسية عالية. قياس cMyBP-C في أحادي أو مع الكرياتين كيناز MB والتروبونين القلبي أظهرت حساسية مماثلة. تستخدم هذه التقنية طريقة Meso Scale Discovery (MSD) لتعدد الإرسال في صفيحة مكونة من 96 بئرا جنبا إلى جنب مع التلألؤ الكيميائي الكهربائي للكشف. في حين أن أحجام العينات الصغيرة فقط مطلوبة ، يتم تحقيق حساسية عالية ونطاق ديناميكي كبير. باستخدام هذه التقنية ، قمنا بقياس مستويات cMyBP-C والكرياتين كيناز MB والتروبونين القلبي I في عينات مصل من 16 شخصا مصابا ب MI وقارنا النتائج مع 16 شخصا تحكميا. تمكنا من اكتشاف جميع العلامات الثلاث في هذه العينات ووجدنا أن جميع المؤشرات الحيوية الثلاثة تزداد بعد MI. لذلك ، فإن هذه التقنية مناسبة للكشف الحساس عن المؤشرات الحيوية للقلب في عينات المصل.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قياس الكميات المنخفضة من البروتين في العينات البيولوجية المعقدة ، مثل المصل ، له أهمية سريرية متزايدة لإدارة المرضى ، وكذلك العلوم الأساسية. على سبيل المثال ، تتوافق الزيادة في مستويات مصل المؤشرات الحيوية للقلب ، مثل التروبونين I ، في بيئة سريرية مع احتشاء عضلة القلب الحاد (MI) 1. للكشف عن البروتينات في عينات المصل ، فإن مقايسة الممتز المناعي القياسية المرتبطة بالإنزيم (ELISA) هي التقنية الأكثر استخداما لأنها تتمتع بحساسية عالية وتسمح بالقياس الكمي المطلق للمادة التحليلية. ومع ذلك ، تتطلب ELISAs التقليدية كمية كبيرة نسبيا من العينة (عادة 100 ميكرولتر) ، ولها إشارة خلفية عالية في بعض السوائل البيولوجية ، وتقتصر على قياس مادة تحليلية واحدة فقط لكل ELISA

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. فحص Uniplex cMyBP-C

  1. في اليوم السابق للتجربة ، قم بتغطية اللوحة القياسية العارية MSD المكونة من 96 بئرا بجسم مضاد ملتقط. بالنسبة إلى cMyBP-C ، استخدم حجما 30 ميكرولتر من الجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد ل cMyBP-C (خال من الجيلاتين) بتركيز 5 ميكروغرام / مل مخفف في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
  2. نظرا لأن البئر كاره للماء ، ضع ماصة المحلول في الزاوية السفلية من البئر ؛ ثم اضغط على جوانب اللوحة لنشر المحلول على البئر بأكمله.
  3. اللوحة مغطاة بمادة مانعة للتسرب ومحتضنة O / N عند 4 درجات مئوية دون اهتزاز.
  4. قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الملتقطة عن طريق النقر على المحلول فوق الحوض ثم على كومة من المناشف الورقية. يتم حظر الارتباط....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم عرض المبادئ الأساسية وسير عمل المقايسة 3-plex في الشكل 1، ويتم وصف سير العمل الكلي في الجدول 1. تعمل فحوصات Uniplex وفقا لنفس المبدأ باستثناء أن البئر السفلي بأكمله مغطى بجسم مضاد واحد للالتقاط. يتم الكشف عن الإشارة عن طريق ECL حيث يتم تطبيق إشارة كهربائية على قاع البئر. وهذا بدوره يبدأ الإنتاج المحلي للضوء من خلال تفاعل كيميائي للمخزن المؤقت للقراءة باستخدام ملصق SULFO-TAG على الجسم المضاد للكشف. هذا يؤدي إلى الخلفية المنخفضة والحساسية العالية للمقايسة. في الشكل 2 ،

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الدراسة ، نظهر قابلية تطبيق المقايسة المناعية متعددة الإرسال للكشف عن المؤشرات الحيوية القلبية المتعددة في المصل من المرضى. هذه التقنية لها مزايا عديدة مقارنة ب ELISA التقليدية. أولا ، يتم استخدام ECL في مجموعة الفحص بدلا من الكشف عن القياس اللوني. في ECL ، تحفز الإشارة الكهربائية الإنتاج المحلي للخاصية المقاسة (الضوء) ، وبالتالي فصل حدث التحفيز عن الإشارة ، مما يقلل من الخلفية14. هذا يسمح بحساسية عالية ، كما يتضح من الجدول 2.

لا يؤدي تعدد الإرسال للمقايسة إل.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولا يزال طلب البراءة الكامل معلقا (الطلب المسلسل رقم 13/464,466، العدد المنشور. الولايات المتحدة 2012/0282618 A1 والتاريخ: 05/04/12) لتحديد عوامل الخطر المرتبطة بتدهور cMyBP-C وإطلاقه في سوائل جسم الإنسان وتحديد مستوى cMyBP-C في سوائل جسم الإنسان.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذه الدراسة من قبل منح المعاهد الوطنية للصحة R01HL105826 و K02HL114749 (الدكتور سادايابان) ، وزمالات الغرب الأوسط لجمعية القلب الأمريكية ؛ 11PRE7240022 (السيد بارفيلد) و 13POST14720024 (دكتور جوفيندان). يقر المؤلفون بامتنان بمساعدة الدكتور جيمي بيج وجيل كلامبيت والدكتور جون هدسون ، MSD ، لدعمهم الفني والأدبي الممتاز في تطوير الفحص.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article Name Company Catalog Number Comments الجيلاتين < td colspan = "4" >< قوي > لوحات ومعدات < / قوي > الحياة

Recodes< / strong>
MSD Read-Buffer T (4X) مع اكتشاف مقياس Meso الخافض للتوتر السطحيR92TC-2  ؛
Tween-20Acros9005-64-5 
MSD Blocker AMeso Scale DiscoveryR93BA-1& nbsp;
محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، 10XFisher BioReagentsBP399-4مرشح قبل الاستخدام
الجسم المضاد لبروتين ربط الميوسين C ، فأر أحادي النسيلة (E7) ، خال من الجيلاتينسانتا كروزSC-137180Lللطلاء ، يجب أن يكون الجسم المضاد خاليا من
متعدد المصفوفات 96 جيدا لوحةقياسية Meso Scale DiscoveryL15XA-3 ؛
نموذج أولي 3-plex ، أربعة نقاط ، 96 بئر لوحة مع cMyBP-C و cTnI و CK-MBMeso Scale DiscoveryN452A-1  ؛
شركة ThermaSeal لختم فيلممنتجات علومST-3098 
MSD SECTOR Imager 2400AMeso Scale Discovery 
MTS 2/4 شاكر ميكروتيتر رقميIKA3208001 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thygesen, K., et al. Third universal definition of myocardial infarction. Eur. Heart J. 33, 2551-2567 (2012).
  2. Leng, S. X., et al. ELISA and multiplex technologies for cytokine measurement in inflammation and aging research. J....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cardiac Myosin Binding Protein CElectrochemiluminescence ImmunoassayMultiplex ImmunoassaySerum Biomarker DetectionMeso Scale Discovery96 Well PlateCalibrator Standard CurveDetection Antibody LabelingReid Buffer AdditionCross Reactivity Analysis

Related Articles