يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

باستخدام الكيمياء فوق لقياس تأثير عدوى فيروسية في خلية المضيف RNA التجميعي

11.7K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/50809

⸱

أغسطس 9, 2013

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Sealy Center for Vaccine Development, Center for Biodefense and Emerging Infectious Diseases, University of Texas Medical Branch

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا الأسلوب استخدام الكيمياء فوق لقياس التغيرات في النسخ الخلية المضيفة بعد الإصابة مع بفيروس حمى الوادي المتصدع (RVFV) سلالة MP-12. النتائج يمكن تصور نوعيا عبر المجهر مضان أو التي تم الحصول عليها من الناحية الكمية من خلال التدفق الخلوي. هذه الطريقة غير قابلة للتكيف للاستخدام مع الفيروسات الأخرى.

الملخص

وقد تطورت العديد من فيروسات الحمض النووي الريبي القدرة على منع النسخ الخلية المضيفة كوسيلة للتحايل على الدفاعات الخلوية. لدراسة هذه الفيروسات، ولذلك فمن المهم أن يكون هناك طريقة سريعة وموثوق بها لقياس النشاط النسخي في الخلايا المصابة. تقليديا، وقد تم قياس النسخ إما عن طريق إدماج نوكليوسدس المشعة مثل H-3 يوريدين تليها كشف عن طريق تصوير الإشعاع الذاتي أو التلألؤ العد، أو إدماج المهلجنة النظير يوريدين مثل 5 bromouridine (برو)، يليه كشف عبر المناعية. استخدام النظائر المشعة، ومع ذلك، يتطلب معدات متخصصة وغير مجدية في عدد من بيئة معملية، في حين كشف برو يمكن أن تكون مرهقة، وربما يعانون من حساسية منخفضة.

وضعت مؤخرا ضغطة والكيمياء، والذي ينطوي على تشكيل الترايازول النحاس المحفزة من أزيد وآلكاين، والآن يوفر سريعة وHIGHLY بديلة حساسة لهاتين الطريقتين. اضغط الكيمياء هي عملية من خطوتين التي وصفت أول الحمض النووي الريبي الوليدة عن طريق إدماج يوريدين التناظرية 5 ethynyluridine (الاتحاد الأوروبي)، ثم من خلال الكشف عن التسمية مع أزيد الفلورسنت. كما تتوفر العديد من fluorophores مختلفة هذه azides، مما يسمح لمجموعة واسعة من الخيارات لالتصور.

يصف هذا البروتوكول وسيلة لقياس قمع النسخي في الخلايا المصابة مع بفيروس حمى الوادي المتصدع (RVFV) سلالة MP-12 باستخدام الكيمياء فوق. وفي الوقت نفسه، يتم تحديد التعبير عن البروتينات الفيروسية في هذه الخلايا المناعية من قبل الخلايا الكلاسيكية. الخطوات من 1 إلى 4 بالتفصيل طريقة لتصور قمع النسخي عبر المجهر مضان، بينما الخطوات من 5 إلى 8 بالتفصيل طريقة لقياس قمع النسخي عبر التدفق الخلوي. هذا البروتوكول هو قابل للتكيف بسهولة للاستخدام مع الفيروسات الأخرى.

المقدمة

تقليديا، وقد تم قياس النشاط النسخي من خلال إدماج إما المشعة (3 H-يوريدين) 1 أو المهلجنة (برو) 2 نوكليوسدس في الحمض النووي الريبي الوليدة. وتؤخذ هذه يوريدين النظير من قبل الخلايا، وتحويلها إلى يوريدين-ثلاثي الفوسفات (UTP) من خلال مسار الإنقاذ نوكليوزيد، وتدرج لاحقا في تصنيعه حديثا RNA. 3 H-يوريدين يمكن الكشف عنها بواسطة تصوير الإشعاع الذاتي، الذي يمكن أن يكون مضيعة للوقت، أو التلألؤ عد، الأمر الذي يتطلب معدات متخصصة. وعلاوة على ذلك، واستخدام النظائر المشعة قد لا يكون من العملي في عدد من بيئة معملية، بما في ذلك ارتفاع معامل الاحتواء السلامة الأحيائية. ويمكن الكشف عن برو من خلال المناعية مع الأجسام المضادة المقاومة للبرو، والتي قد تتطلب permeabilization قاسية لضمان وصول الأجسام المضادة للنواة أو تمسخ جزئي من الحمض النووي الريبي، وبنية الحمض النووي الريبي الثانوية قد يكون عائقا الفراغية للربط الأجسام المضادة.

_content "> بروتوكول الموصوفة هنا يستخدم يعتمد ضعت مؤخرا الكيمياء فوق 3 لقياس النشاط النسخي في الخلايا المصابة مع سلالة RVFV MP-12. اضغط الكيمياء على النحاس انتقائية للغاية وفعالة (I) المحفزة رد فعل الاضافه الحلقيه بين آلكاين و وشاردة أزيد 4،5. في هذا البروتوكول، هو المسمى الحمض النووي الريبي الوليدة في الخلايا المصابة أولا من خلال إدماج يوريدين التناظرية الاتحاد الأوروبي. وفي الخطوة الثانية، يتم الكشف عن الاتحاد الأوروبي أدرجت خلال تفاعل مع أزيد الفلورسنت. المزايا الرئيسية لهذا الأسلوب هي: (1) أنه لا تتطلب استخدام النظائر المشعة و (2) أنها لا تتطلب permeabilization القاسية أو تمسخ من الحمض النووي الريبي. ذات وزن جزيئي أقل من 50 دا، والوصول إلى أزيد من الفلورسنت لا يعوقه عدم كفاية permeabilization أو RNA هيكل الثانوي. وعلاوة على ذلك، فإن الباحثين لا تقتصر في اختيارهم من الأجسام المضادة الأولية عند الجمع بين الكشف عن الحمض النووي الريبي مع فئةالمناعية كال للبروتينات الفيروسية.

ووصف اثنان من طرق مختلفة في هذا البروتوكول: واحدة لتصور النسخ عن طريق الفحص المجهري مضان (الخطوات 1-4)، واحدة لقياس النسخ من خلال التدفق الخلوي (الخطوات 5-8). كل من هذه الأساليب الجمع بين وضع العلامات من الحمض النووي الريبي الوليدة مع الخلايا المناعية لبروتينات فيروسية، والذي يسمح للعلاقة بين النشاط النسخي والعدوى الفيروسية على أساس خلية تلو خلية.

وقد استخدمت بنجاح من الكتاب بروتوكول الموصوفة هنا لتحديد النشاط النسخي في الخلايا المصابة مع سلالة RVFV MP-12 6، الخلايا المصابة مع مختلف MP-12 المسوخ 7،8، 9، والخلايا المصابة مع فيروس توسكانا (TOSV) 10. بروتوكول الموصوفة هنا يمكن تكييفها بسهولة للاستخدام مع انواع مختلفة من الفيروسات وديه القدرة على تعديلها لتشمل تلوين المناعي من البروتينات الفيروسية أو الخلوية محددة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تحليل النسخ بواسطة المجهر مضان

1. تصيب الخلايا مع MP-12 وتسمية الحمض النووي الريبي الوليدة مع الاتحاد الأوروبي

  1. مكان coverslips على مدار 12 ملم إلى 12 جيدا نسيج لوحة الثقافة، ساترة واحد لكل بئر.

ملاحظة: إذا كان لديك مشكلة خلايا التمسك coverslips على، معطف مع بولي-L-يسين (MW ≥ 70،000) قبل ان يضع في الآبار. لهذا الهدف، coverslips على يغرق في 0.1 ملغ / مل محلول معقم في H 2 O من بولي-L-يسين لمدة 5 دقائق. شطف coverslips على العقيمة مع H 2 O والهواء الجاف لا يقل عن 2 ساعة.

  1. على البذور 293 الخلايا على coverslips، إضافة 5 × 10 4 الخلايا في 1 مل المتوسطة النمو (DMEM تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني، 100 U / مل البنسلين و 100 ملغ / مل الستربتوميسين) لكل بئر. احتضان في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 O / N.
  2. تصيب الخلايا مع MP-12 في عدد وافر من العدوى (وزارة الداخلية) 3. تشمل اثنين على الأقل الآبار غير مصاب: سوف واحدة من بئرين بمثابة السيطرة المعافين، وسوف يعامل الآخر مع أكتينوميسين D (ActD) في الخطوة 1.5 كعنصر تحكم لقمع النسخي. إزالة متوسطة النمو وتمييع الأسهم فيروس بحيث الحجم الكلي تضاف إلى كل بئر هو 200 مل. احتضان لمدة 1 ساعة في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.

ملاحظة: بدلا من اصابة الخلايا، ويمكن أيضا أن الخلايا transfected مع الحمض النووي البلازميد أو في المختبر توليفها RNA ترميز البروتين الفيروسي محددة. لهذا الهدف، بالنقل الخلايا مع كاشف ترنسفكأيشن الكيميائية المناسبة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة وانتقل إلى الخطوة 1.5 في آخر 16 ساعة ترنسفكأيشن. فإنه من المستحسن لتحسين ظروف ترنسفكأيشن وفترة حضانة قبل وضع العلامات RNA والتثبيت.

  1. إزالة اللقاح وإضافة 1 مل متوسطة النمو الطازجة لكل بئر. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 15 ساعة.
ove_content "> ملاحظة: إذا التكيف مع هذا البروتوكول للاستخدام مع فيروس آخر، فإنه من المستحسن لإجراء التجربة بالطبع الوقت لتحديد نقطة زمنية الأمثل لوضع العلامات RNA وتثبيت إعداد هذا الوقت بالطبع بحيث مرات العدوى ومتداخلة وجميع يمكن أن توصف العينات، ثابتة، وملطخة في نفس الوقت.

  1. في 15 ساعة إصابة آخر (HPI)، استبدال المتوسطة النمو مع المتوسط ​​تحتوي على 1 ملم الاتحاد الأوروبي. إلى واحدة من الآبار المصابة وهمية، وأيضا إضافة 5 ميكروغرام / مل ActD. وهذا سيكون بمثابة سيطرة لقمع النسخي، كما يثبط تخليق الحمض النووي الريبي ActD التي تعتمد على الحمض النووي. عودة إلى الخلايا الحاضنة.
  2. في 16 HPI، وإزالة المتوسطة وغسل coverslips مرة واحدة مع 1 مل PBS (بوكل 0.20 ز / L، KH 2 PO 4 0.20 غرام / لتر، كلوريد الصوديوم 8.00 غ / ل، نا 2 هبو 4 1.15 غرام / لتر، ودرجة الحموضة 7.4) لكل بئر. إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 1 مل من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) لكل بئر واحتضان لمدة 30 دقيقة في RT.

> ملاحظة: لإعداد 4٪ PFA حل التثبيت، ويحل 10 غ امتصاص العرق في 150 مل H 2 O تسخينها إلى 60 درجة مئوية على محرك مغناطيسي ساخنة. إضافة 500 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم 1M ومواصلة يحرك حتى يصبح حل واضح. مرشح PFA حل من خلال ورقة الترشيح لإزالة الجسيمات وإضافة 62.5 مل الفوسفات العازلة (77 ملي ناه 2 ص 4، 287 ملي نا 2 هبو 4، ودرجة الحموضة 7.4). إضافة H 2 O يصل إلى وحدة تخزين ما مجموعه 250 مل. تجميد في -20 درجة مئوية في مأخوذة ذات الاستخدام الواحد.

  1. يغسل مرة واحدة مع 1 مل PBS لكل بئر. مطلوب أي وقت من الأوقات الحضانة لهذا وجميع الخطوات غسل اللاحقة. الشروع فورا في الخطوة 2.

ملاحظة: من المهم المضي قدما على الفور بنقرة رد فعل، حيث أن الحمض النووي الريبي ينحط إذا كان يحتفظ بها في هذه المرحلة لفترات طويلة من الزمن، ويمكن أن يكون بالفعل لوحظ فقدان مضان إشارة RNA إذا يتم الاحتفاظ الخلايا لمدة 1 ساعة عند 4 ° C . وبالمثل، إذا فيتشكيل التجربة بالطبع الوقت، تأكد من التسمية، وإصلاح، وصمة عار جميع العينات في نفس الوقت.

2. انقر فوق رد الفعل لكشف إعتبر RNA

  1. Permeabilize الخلايا عن طريق إضافة 1 مل 0.2٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني. احتضان لمدة 10 دقيقة في RT.

ملاحظة: جميع الحلول المستخدمة في الخطوات 2،1-2،3 تحتاج إلى أن تكون nuclease خالية.

  1. يغسل ثلاث مرات مع 1 مل PBS لكل بئر.
  2. إزالة coverslips على من لوحة ال 12 أيضا ونقل إلى غرفة رطبة. تغطية كل ساترة مع 50-100 ميكرولتر نقرة حل تلطيخ (100 ملي تريس درجة الحموضة 8.5، 1 ملم كبريتات النحاس 4 و 20 ميكرومتر أزيد الفلورسنت [الإثارة / الانبعاثات القصوى: 590/617 نيوتن متر]، 100 ملي حمض الاسكوربيك) لكل منهما. احتضان لمدة 1 ساعة على RT في الظلام.

ملاحظة: لتجميع غرفة رطبة، خط أسفل ثقافة الخلية أو طبق بتري مع سم قطر 10 مع فيلم البلاستيك البارافين. تبطن داخل حافة ديSH مع مناشف ورقية مبللة. ضع coverslips على على الفيلم البارافين البلاستيك.

ملاحظة: يجب الحرص على عدم السماح للcoverslips على تجف خلال هذه أو أي خطوة أخرى في البروتوكول. فمن الأفضل لإضافة حل تلطيخ إلى كل ساترة مباشرة بعد أن تم وضعها في غرفة رطبة.

ملاحظة: إعداد ضغطة الحل تلطيخ الطازجة مباشرة قبل هذه الخطوة. قد يتم تخزين الحلول الأسهم من 1.5 M تريس درجة الحموضة 8.5، 100 ملي كبريتات النحاس 4، و 500 حمض الاسكوربيك ملم على 4 درجات مئوية. ومع ذلك، تجاهل أي حمض الاسكوربيك حل الأوراق المالية التي تحولت إلى اللون الأصفر.

ملاحظة: تأكد من تحديد fluorophore أن مباريات التصفية على المجهر الفلورسنت الخاصة بك.

  1. إزالة coverslips على من غرفة رطبة والمكان الى لوحة 12 أيضا الطازجة ويغسل ثلاث مرات مع 1 مل PBS لكل بئر.

ملاحظة: إذا لم يكن هناك ديهو المطلوب بحماية المناخ من البروتينات الفيروسية، ويمكن تركيبه coverslips على وتصويرها بعد هذه الخطوة (انتقل إلى الخطوة 3.3).

3. المناعي لكشف التعبير عن البروتينات الفيروسية

  1. إضافة 1 مل من حجب العازلة (3٪ (W / V) ألبومين المصل البقري (BSA) في PBS) إلى كل بئر واحتضان لمدة 30 دقيقة في RT في الظلام.
  2. إزالة coverslips على من لوحة ال 12 أيضا، ونقل إلى غرفة رطبة، وتغطي مع 50-100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية (المضادة للRVFV، هدية عينية من الدكتور RB تش، UTMB) المخفف في عرقلة العازلة (1:500). احتضان لمدة 1 ساعة على RT في الظلام.

ملاحظة: عندما يكون التكيف مع هذا البروتوكول للاستخدام مع فيروس مختلف، وتحديد الأمثل لتخفيف الأجسام المضادة الأولية الخاصة بك أولا.

ملاحظة: بدلا من ذلك، هذه الخطوة لا يمكن أن يؤديها O / N عند 4 درجات مئوية في الظلام.

  1. إزالة coverslips على من غرفة رطبة ومكان مرة أخرى في صفيحة ال 12 جيدا ويغسلثلاث مرات مع 1 مل PBS لكل بئر.
  2. إزالة coverslips على 12 من مكان جيدا، المكان إلى غرفة رطبة، وتغطي مع 50-100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية (المضادة للمفتش الماوس مترافق إلى صبغة الفلورسنت [الإثارة / الانبعاثات القصوى: 495/519 نيوتن متر]) المخفف في عرقلة العازلة (1: 500). احتضان لمدة 1 ساعة على RT في الظلام.

ملاحظة: تأكد من تحديد الأجسام المضادة الثانوية التي يمكن التعرف على الأجسام المضادة الأولية الخاصة بك ومباريات التصفية على المجهر الفلورسنت الخاصة بك.

ملاحظة: إذا رغبت في ذلك، يمكن إضافة 200 نانوغرام / مل دابي لتخفيف الأجسام المضادة الثانوية لتصور النوى.

  1. إزالة coverslips على من غرفة رطبة ومكان مرة أخرى في صفيحة ال 12 جيدا ويغسل ثلاث مرات مع 1 مل PBS لكل بئر.
  2. جبل coverslips على طريق وضع قطرة واحدة (CA 15 ميكرولتر) من Fluoromount-G على شريحة المجهر. تراجع ساترة إلى H 2 O، وإزالة الزائدة H 2 O عن طريق لمس ال الجانب الإلكترونية ضد منشفة ورقية، ومكان على جانب الخلية إلى أسفل داخل قطرة من Fluoromount-G. الهواء الجاف لمدة 5 دقائق.

ملاحظة: إذا كان التصوير على مجهر مقلوب، تسمح Fluoromount-G لترسيخ عند 4 درجة CO / N أو يضعوا لل coverslips إلى الشريحة المجهر من قبل ختم الحافة مع طلاء الأظافر الشفاف.

ملاحظة: يمكن تصوير الشرائح مباشرة أو تخزينها في 4 درجات مئوية في الظلام لمدة تصل إلى أسبوع.

4. الحصول على البيانات

  1. الصورة باستخدام المجهر الفلورسنت.

ملاحظة: تأكد من تحديد fluorophores المناسبة التي يمكن تصور باستخدام مجهر الخاص. للإشارة، وفيما يلي fluorophores ومجموعات التصفية المستخدمة للحصول على الصور المبينة في هذا المنشور.

دابي:
فلتر الإثارة: BP 330-385
مبصر اللونين مرآة: DM 400
تصفية الانبعاثات: LP 420

ق = "jove_content"> Fluorophore مع الإثارة / الانبعاثات الحد الأقصى من 495/519:
فلتر الإثارة: BP 460-490
مبصر اللونين مرآة: DM 505
تصفية الانبعاثات: LP 510

Fluorophore مع الإثارة / الانبعاثات الحد الأقصى من 590/617:
فلتر الإثارة: BP 545-580
مبصر اللونين مرآة: DM 600
تصفية الانبعاثات: LP 610

تحليل النسخ بواسطة التدفق الخلوي

5. تصيب الخلايا مع MP-12 وتسمية الحمض النووي الريبي الوليدة مع الاتحاد الأوروبي

  1. البذور 293 الخلايا في 6 جيدا لوحة زراعة الأنسجة في متوسطة النمو (DMEM تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني، 100 U / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين). احتضان في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 حتى وصلت إلى خلايا 80-100٪ confluency.
  2. تصيب الخلايا مع MP-12 في وزارة الداخلية من 3. تشمل اثنين على الأقل الآبار غير مصاب: واحدة من بئرين سيكون بمثابة السيطرة المعافين، وسوف يعامل الآخر مع ActD في خطوة5.4. إزالة متوسطة النمو وتمييع الأسهم فيروس بحيث الحجم الكلي تضاف إلى كل بئر على بعد 400 ميكرولتر. احتضان لمدة 1 ساعة في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  3. إزالة اللقاح وإضافة 2 مل متوسطة النمو الطازجة لكل بئر. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 12 ساعة.

ملاحظة: إذا كان التكيف مع هذا البروتوكول للاستخدام مع فيروس آخر، فإنه من المستحسن لإجراء التجربة بالطبع الوقت لتحديد نقطة الوقت الأمثل لوصفها والحصاد. إعداد هذه المرة بالطبع بحيث مرات العدوى ومتداخلة ويمكن أن توصف جميع العينات، تحصد، وملطخة في نفس الوقت.

  1. في 12 HPI، استبدال المتوسطة النمو مع المتوسط ​​تحتوي على 0.5 ملي الاتحاد الأوروبي. إلى واحدة من الآبار المصابة وهمية، وأيضا إضافة 5 ميكروغرام / مل ActD. وهذا سيكون بمثابة سيطرة لقمع النسخي، كما يثبط تخليق الحمض النووي الريبي ActD التي تعتمد على الحمض النووي. عودة إلى الخلايا الحاضنة.
  2. في 13 HPI، وغسل خلايا مرة واحدة الطرافةح برنامج تلفزيوني والحصاد من قبل trypsinization من الخلايا. غسل الخلايا تحصد ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 1 ملم EDTA (PBS-EDTA).

ملاحظة: خلال هذه الخطوات واللاحقة، لا أجهزة الطرد المركزي الخلايا أسرع من 500 - 1،000 x ج لمنع الكسر الخلية. أجهزة الطرد المركزي الخلايا لمدة 1 - 2 دقيقة إلى الرواسب.

ملاحظة: إذا تم التخطيط لسطح المناعية بعد النقر رد فعل، والحصاد باستخدام شرطي المطاط أو مكشطة الخلية القابل للتصرف بدلا من ذلك.

  1. إصلاح الخلايا عن طريق إعادة التعليق عليها في 1 مل من PFA 4٪ واحتضان لمدة 30 دقيقة في RT. الرجوع إلى الخطوة 1.6 للحصول على إرشادات حول كيفية إعداد PFA 4٪.
  2. يغسل مرة واحدة مع 1 مل PBS-EDTA لكل بئر. الشروع فورا في الخطوة 6.

ملاحظة: من المهم المضي قدما على الفور بنقرة رد فعل، حيث أن الحمض النووي الريبي ينحط إذا كان يحتفظ بها في هذه المرحلة لفترات طويلة من الزمن. وبالمثل، إذا كان أداء وقت جالتجربة رسي، كن متأكدا من التسمية، وإصلاح وصمة عار جميع العينات في نفس الوقت.

6. انقر فوق رد الفعل لكشف إعتبر RNA

  1. Permeabilize الخلايا عن طريق إعادة التعليق في 0.5 مل من 0.2٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني. احتضان لمدة 10 دقيقة في RT.

ملاحظة: جميع الحلول المستخدمة في الخطوات 6،1-6،3 تحتاج إلى أن تكون nuclease خالية.

ملاحظة: إذا الخلايا لا الرواسب بشكل صحيح خلال هذه الخطوة، وزيادة وقت الطرد المركزي إلى 5 دقائق. سوف تتحسن بمجرد علقت الخلايا سلوك الترسيب في نظام مراقبة الأصول الميدانية العازلة (الخطوة 6.4).

  1. يغسل مرة واحدة مع 1 مل PBS.

ملاحظة: لا تستخدم EDTA في هذه الخطوة لأن هذا سوف خلابة على النحاس 2 + الأيونات اللازمة لفوق رد فعل.

  1. Resuspend الخلايا في 200 ميكرولتر نقرة حل تلطيخ (100 ملي تريس درجة الحموضة 8.5، 1 ملم كبريتات النحاس 4، 200nM أزيد المسمى مع صبغة الفلورسنت [مريض بالحبitation / الانبعاثات القصوى: 650/665 نيوتن متر]، 100 ملي حامض الاسكوربيك). احتضان لمدة 1 ساعة على RT في الظلام.

ملاحظة: إعداد ضغطة الحل تلطيخ الطازجة مباشرة قبل هذه الخطوة. قد يتم تخزين الحلول الأسهم من 1.5 M تريس درجة الحموضة 8.5، 100 ملي كبريتات النحاس 4، و 500 حمض الاسكوربيك ملم على 4 درجات مئوية. ومع ذلك، تجاهل أي حمض الاسكوربيك حل الأوراق المالية التي تحولت إلى اللون الأصفر.

ملاحظة: إذا الخلايا تتجمع معا خلال هذه الخطوة، resuspend بواسطة pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات.

ملاحظة: تأكد من تحديد fluorophore التي يمكن الكشف عنها بواسطة تدفق عداد الكريات الخاص بك.

ملاحظة: تعد أيضا عينة واحدة من الخلايا المصابة والتي لا تخضع لإجراءات تلطيخ فوق، وسوف تكون هناك حاجة لمعايرة عداد الكريات تدفق هذه. إما استخدام نصف من الخلايا المصابة أو تتضمن إضافية المصابين جيدا في الخطوة 5.2. هذا Conسيتم immunostained الخلايا المحول المتعدد العادي في الخطوة 7.1.

  1. يغسل مرتين مع نظام مراقبة الأصول الميدانية العازلة (PBS تحتوي على 1 ملم EDTA و 0.5٪ (W / V) BSA).

ملاحظة: إذا كان المطلوب لا المناعية من البروتينات الفيروسية والخلايا ويمكن تحليلها على الفور (انتقل إلى الخطوة 8).

7. المناعي لكشف التعبير عن البروتينات الفيروسية

  1. Resuspend الخلايا في 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية (المضادة للRVFV) المخفف في نظام مراقبة الأصول الميدانية العازلة (1:10،000) واحتضان لمدة 1 ساعة على RT في الظلام.

ملاحظة: بدلا من ذلك، هذه الخطوة لا يمكن أن يؤديها O / N عند 4 درجات مئوية في الظلام.

ملاحظة: تعد أيضا عينة واحدة من الخلايا غير المصابة التي تم إخضاعها لإجراءات تلطيخ ضغطة ولكن لن يتم immunostained، وسوف تكون هناك حاجة إلى هذه لمعايرة قياس التدفق الخلوي. إما استخدام نصف من الخلايا المصابة وهمية أو غير مصاب تشمل بئر إضافية فيالخطوة 5.2.

ملاحظة: عندما يكون التكيف مع هذا البروتوكول للاستخدام مع فيروس مختلف، وتحديد الأمثل لتخفيف الأجسام المضادة الأولية الخاصة بك أولا.

  1. غسل الخلايا مرتين في FACS العازلة.
  2. Resuspend الخلايا في 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية (المضادة للمفتش الماوس مترافق إلى صبغة الفلورسنت [الإثارة / الانبعاثات القصوى: 495/519 نيوتن متر]) مخففة في نظام مراقبة الأصول الميدانية العازلة (1:1،000) واحتضان لمدة 1 ساعة على RT في الظلام.
  3. غسل خلايا مرة واحدة في نظام مراقبة الأصول الميدانية العازلة.

ملاحظة: عند هذه النقطة، يمكن تخزين الخلايا O / N عند 4 درجات مئوية في الظلام.

8. الحصول على البيانات

  1. Resuspend الخلايا في 500 FACS ميكرولتر العازلة، ونقل إلى 5 أنابيب البولي ستايرين مل وتحليل باستخدام تدفق عداد الكريات. استخدام MP-12 الخلايا المصابة (لا انقر رد فعل، وتلطيخ المضادة للRVFV فقط) والخلايا المصابة وهمية (انقر فوق رد فعل فقط) لمعايرة الصك.

ليسE: تأكد من تحديد fluorophores المناسبة التي يمكن الكشف عنها بواسطة الصك الخاص بك. للإشارة، وفيما يلي خطوط الليزر ومجموعات التصفية المستخدمة للحصول على البيانات الواردة في هذا المنشور.

Fluorophore مع الإثارة / انبعاث الطيف من 495/519:
الليزر: 488 نانو متر
التصفية: 530/30

Fluorophore مع الإثارة / انبعاث الطيف من 650/665:
الليزر: 640 نانو متر
التصفية: 670/20

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

البروتين NSS من RVFV (عائلة الفيروسات البنياوية، جنس الفاصدة Phlebovirus) 11 يمنع المضيف الخلية النسخ العامة من خلال آليتين متميزتين: (ط) من خلال عزل الوحيدات P44 من عامل النسخ القاعدية TFIIH 11 و (ثانيا) من خلال تشجيع تدهور proteasomal من P62 الوحيدات من TFIIH 6. وRVFV MP-12 لقاح السلالة 13 قد استخدمت للتجارب الموصوفة في هذا البروتوكول منذ MP-12 سلالة يمكن التعامل معها في مستوى السلامة الحيوية في المختبرات 2 ويتم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يصف البروتوكول تنص على طريقة لقياس تأثير عدوى فيروسية في النسخ الخلية المضيفة عن طريق إدماج يوريدين التناظرية الاتحاد الأوروبي في الحمض النووي الريبي الوليدة. هذا الأسلوب له مزايا عديدة أكثر من الطرق السابقة: فهي سريعة وحساسة، وأنها لا تعتمد على استخدام النظائر المشعة. وعلاوة على ذلك، يمكن تكييفها طريقة لانتاج البيانات النوعية من خلال الفحص المجهري مضان أو البيانات الكمية عن طريق التدفق الخلوي باستخدام أساسا نفس الكواشف. عندما جنبا إلى جنب مع تلوين المناعي للمستضدات فيروسية، وهذا ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

نشكر RB تش لتوفير الماوس بولكلونل مكافحة RVFV مصل وM. غريفين من التدفق الخلوي UTMB مرفق الأساسية للحصول على مساعدة مع التدفق الخلوي. وأيد هذا العمل من قبل 5 U54 AI057156 من خلال مركز إقليمي للتميز الغربية، المعاهد الوطنية للصحة منح R01 AI08764301، وبتمويل من مركز سيلي استحداث اللقاحات في UTMB.BK كان مدعوما من قبل صندوق جيمس دبليو ماكلولين زمالة في UTMB.OL كان مدعوما بواسطة R. هيلمان في مرحلة مبكرة جائزة الباحث الوظيفي موريس.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
5-إيثينيل يوريدينبيري أسوشيتسPY 7563تذوب في DMSO لمخزون 100 ملي
أغطية مستديرة مقاس 12 ممفيشربراند12-545-82
5 مل أنابيب البوليسترين BDBiosciences352058
Actinomycin D (ActD)Sigma9415تذوب في DMSO مقابل 10 ملي من
الأسهم Alexa Fluor 488 الماعز المضادة للفأر IgGInvitrogenA-11029
ألبومين مصل البقر (BSA) سانتا كروزsc-2323
CuSO4< / sub>SigmaC-8027يذوب في H2< / sub>O لمخزون 100 ملي مولار
DAPI SigmaD-9542يذوب في H2< / sub>O مقابل 5 مجم / مل
مخزون DMEM Invitrogen11965092
FBSأزيدالفلورسنت 16000044
(Alexa Fluor 594-مقترن)InvitrogenA10270
أزيد الفلورسنت (Alexa Fluor 657-مقترن)InvitrogenA10277
Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01
L-ascorbic acidSigmaA-5960يذوب في H2< / sub>O لمدة 500 ملي مولار
مرشح الورقVWRbrand28333-087
بارافورمالدهيد سيجما158127
البنسلين الستربتومايسينإنفيتروجين15140122
بولي إل ليسين (ميغاواط &# 8805 ؛ 70000)سيجماP1274
تريتون X-100سيجماT-8787
قاعدة تريزماسيجماT-1503يذوب في H2< / sub>O لمخزون 1.5 متر ، درجة الحموضة 8.5
Trypsin-EDTAInvitrogen25200056
Fluorescence Microscope على سبيل المثال < em > Olympus IX71
Flow Cellular على سبيل المثال < / em> BD Biosciences LSRII Fortessa
متر Invitrogen

المراجع

  1. Fakan, S. Structural support for RNA synthesis in the cell nucleus. Methods Achiev. Exp. Pathol. 12, 105-140 (1986).
  2. Jensen, P. O., Larsen, J., Christiansen, J., Larsen, J. K. Flow cytometric measurement of RNA synthesis using bromouridine labelling and bromodeoxyuridine antibodies. Cytometry. 14, 455-458 (1993).
  3. Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 15779-15784 (2008).
  4. Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 41, 2596-2599 (2002).
  5. Tornoe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(i)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides. J. Org. Chem. 67, 3057-3064 (2002).
  6. Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. NSs protein of rift valley fever virus promotes posttranslational downregulation of the TFIIH subunit p62. J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).
  7. Kalveram, B., et al. Rift Valley fever virus NSs inhibits host transcription independently of the degradation of dsRNA-dependent protein kinase PKR. Virology. , (2012).
  8. Head, J. A., Kalveram, B., Ikegami, T. Functional analysis of Rift Valley fever virus NSs encoding a partial truncation. PLoS One. 7, e45730(2012).
  9. Lihoradova, O. A., et al. Characterization of Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain Encoding NSs of Punta Toro Virus or Sandfly Fever Sicilian Virus. PLoS Negl Trop Dis. 7, e2181(2013).
  10. Kalveram, B., Ikegami, T. Toscana Virus NSs Protein Promotes Degradation of Double-Stranded RNA-Dependent Protein Kinase. J. Virol. , (2013).
  11. Schmaljohn, C., Nichol, S. In Fields Virology. Knipe, D. M., et al. , Lippincott Williams and Wilkins. 1741-1789 (2007).
  12. Le May, N., et al. TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus. Cell. 116, 541-550 (2004).
  13. Caplen, H., Peters, C. J., Bishop, D. H. Mutagen-directed attenuation of Rift Valley fever virus as a method for vaccine development. J. Gen. Virol. 66, 2271-2277 (1985).
  14. Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rescue of infectious Rift Valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene. J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).
  15. Vyboh, K., Ajamian, L., Mouland, A. J. Detection of viral RNA by fluorescence in situ hybridization (FISH). J. Vis. Exp. , e4002(2012).
  16. Reich, E., Goldberg, I. H. Actinomycin and nucleic acid function. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 3, 183-234 (1964).
  17. Holmes, K. L., Lantz, L. M., Russ, W. Conjugation of fluorochromes to monoclonal antibodies. Curr. Protoc. Cytom. Chapter 4 (Unit 4 2), (2001).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

باستخدام الكيمياء فوق لقياس تأثير عدوى فيروسية في خلية المضيف RNA التجميعي
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.