مقالة منهجية

طريقة إعداد الشرائح للحفاظ على هندسة الكروماتين ثلاثية الأبعاد للخلايا الجرثومية الخصية

DOI:

10.3791/50819

⸱

يناير 10, 2014

1Division of Reproductive Sciences, Division of Developmental Biology, Perinatal Institute, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصف المادة هنا طريقة تم تطويرها للحفاظ على بنية الكروماتين ثلاثية الأبعاد للخلايا الجرثومية الخصية. وقد أطلق على هذا الأسلوب الشريحة ثلاثية الأبعاد (3D). هذه الطريقة تحسن الحساسية للكشف عن الهياكل شبه النووية وتنطبق على الفلورة المناعية والحمض النووي وفلور الحمض النووي الريبي في التهجين الموقعي (FISH).

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أثناء تمايز الخلايا الجرثومية الخصية ، يتغير هيكل الكروماتين النووي بشكل ديناميكي. يصف التالي طريقة مصممة للحفاظ على ترتيب الكروماتين ثلاثي الأبعاد للخلايا الجرثومية الخصية الموجودة في الفئران؛ تم وصف هذا الأسلوب كطريقة الشريحة ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد). في هذه الطريقة ، يتم التعامل مباشرة مع أنابيب الخصية مع خطوة permeabilization أن يزيل المواد السيتوبلازمية ، تليها خطوة التثبيت الذي يصلح المواد النووية. ثم يتم فصل الأنابيب، وتعليق الخلية هو cytospun، والخلايا تلتزم الشرائح. هذه الطريقة تحسن الحساسية تجاه الكشف عن الهياكل دون النووية وتنطبق على الفلورة المناعية والحمض النووي وفلور الحمض النووي الريبي في التهجين الموقعي (FISH) والجمع بين طرق الكشف هذه. كمثال على تطبيق محتمل لأسلوب الشريحة ثلاثية الأبعاد، يظهر جهاز COT-1 RNA FISH للكشف عن الحمض النووي الريبي الوليد. تسهل طريقة الشريحة ثلاثية الأبعاد الفحص التفصيلي للعلاقات المكانية بين بنية الكروماتين والحمض النووي والحمض النووي الريبي أثناء تمايز الخلايا الجرثومية الخصية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في الخصية، الخلايا الجرثومية تفرق من الحيوانات المنوية ثنائية الفصيلة من خلال الميوس إلى ناضجة، الحيوانات المنوية haploid. خلال هذه العملية، يتم تشكيل هيكل الكروماتين النووي للخلايا الجرثومية بشكل مستمر وديناميكي. ينتشر السطح عادة ما تستخدم للفحص الخلوي للخلايا المنوية الفردية. وهناك طريقة سائدة من ينتشر السطح يستخدم العلاج hypotonic التي تنتشر الخلايا المنوية الفردية وسويت1. هذه الشروط هي الأمثل للتحليل التفصيلي للكروموسومات المريوتيكية. الميزات الكروموسومية مثل حالة متشابك و بؤر إعادة التركيب يمكن ملاحظتها بسهولة باستخدام هذه الطريقة. ومع ذلك ، فإن العلاج تحت الحجري يعطل بنية الكروماتين دون النووية ، وبالتالي فإن هذه التقنية ليست مناسبة للتحليل الهيكلي للنوى. وبالتالي، تم تصميم طريقة محسنة للحفاظ على بنية الكروماتين ثلاثية الأبعاد للخلايا الجرثومية الخصية. وقد وصفت هذه الطريقة بأنها طريقة الشريحة ثلاثية الأبعاد (3D)(الشكل 1). وقد مكنت طريقة الشريحة 3D الكشف عن توطين الحمض النووي الريبي الوليدة في النوى لأنه تم الأمثل في البداية لفحص التعبير الجيني وحالات الكروماتين خلال تمايز الخلايا الجرثومية الخصية من قبل RNA مضان في التهجين الموقعي (FISH)2,3. هذه الطريقة ثلاثية الأبعاد تنطبق أيضا على الجمع بين الفلورة المناعية والحمض النووي والأسماك الحمض النووي الريبي. بالإضافة إلى ذلك ، ساعدت هذه الطريقة في اكتشاف كروماتين الجنس بعد ميوتيك (PMSC) ، وهي مقصورة صامتة من الكروموسومات الجنسية الموجودة في الحيوانات المنوية بعد ميوتيك2.

تم تحسين طريقة الشريحة ثلاثية الأبعاد في الأصل من خلال الجمع بين خطوتين أساسيتين لإعداد الشرائح المستخدمة عادة للتلطيخ النووي: خطوة التثبيت المصممة لإصلاح المواد النووية وخطوة الثبات التي تهدف إلى إزالة المواد السيتوبلازمية من أجل تحسين إمكانية الوصول إلى الكواشف التلطيخية ، مثل الأجسام المضادة ومسابير FISH. كما سبق وصفه في منشور آخر 3 ، فقد تقرر أن خطوة permeabilization يجب أن تسبق خطوة التثبيت من أجلالحصولعلى أفضل النتائج مع خلفية السيتوبلازمية منخفضة. في طريقة الشريحة ثلاثية الأبعاد هذه ، يتم تنفيذ خطوة permeabilization وخطوة التثبيت اللاحقة مباشرة على الأنابيب شبهiferous ويتبعها الانفصال الميكانيكي للخلايا الجرثومية مع ملقط قبل السيتوسبينينغ على الشرائح. تم تطوير طريقة بديلة لأسماك الحمض النووي الريبي من الخلايا المنوية في مختبر آخر4. في هذا الأسلوب، بما يتفق مع الأسلوب 3D، يجب أن تسبق خطوة permeabilization خطوة التثبيت من أجل الحصول على أفضل النتائج من RNA FISH.

يصف البروتوكول التالي طريقة الشريحة ثلاثية الأبعاد ويقدم مثالا على تطبيق محتمل، Cot-1 RNA FISH للكشف عن الحمض النووي النووي الريبي الناشئ. يتكون الحمض النووي ل Cot-1 من عناصر متكررة في الجينوم. هنا، يتم تهجين مسبار الحمض النووي Cot-1 إلى intron و UTR من النصوص الوليدة، وبالتالي الكشف عن المناطق النشطة نسخيا في النواة5،6. الشرائح ثلاثية الأبعاد متعددة الاستخدامات ويمكن تطبيقها على مزيج من تقنيات immunofluorescence والحمض النووي وRNA FISH من أجل الحصول على فحص مفصل للعلاقات المكانية بين هندسة الكروماتين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.3D إعداد الشرائح

  1. إعداد الكواشف التالية:
    1. CSK العازلة: 100 mM NaCl, 300 mM السكروز, 10 م م أنابيب, 3 م م م2. ضبط درجة الحموضة إلى 6.8 مع 1 M NaOH. تخزين المخزن المؤقت CSK عند 4 °C.
    2. CSK العازلة مع 0.5٪ تريتون X-100: إضافة 200 ميكرولتر من تريتون X-100 إلى 40 مل من المخزن المؤقت CSK. امزج المحلول باستخدام الستيرر المغناطيسي حتى يذوب تريتون X-100 تماما. تخزين المخزن المؤقت CSK مع 0.5٪ تريتون X-100 في 4 درجة مئوية.
    3. 4٪ بارافورمالديهايد (PFA)-PBS، درجة الحموضة 7.4: حل 4 غرام من PFA في ما يقرب من 70-80 مل من الماء. من أجل تسريع عملية الذوبان، إضافة ما يقرب من 20 ميكرولتر من 4 N NaOH والحفاظ على الحل في حمام مائي عند 60 درجة مئوية حتى يذوب PFA تماما والحل شفاف. تستغرق هذه العملية حوالي ساعة واحدة. بعد PFA قد حلت تماما، إضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني 10x. ضبط حجم النهائي إلى 100 مل مع الماء وتهدئة الحل لدرجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية). استخدم الحل الطازج لكل تجربة جديدة.
      ملاحظة: الحصول على إذن مؤسسي لجميع الأعمال الحيوانية والالتزام بالمبادئ التوجيهية ذات الصلة لرعاية الحيوان.
  2. قتل الفئران الذكور. باستخدام ملقط ومقص، استئصال الخصية من الماوس. ضع testis في برنامج تلفزيوني (أو RPMI 1640). بعد إزالة الخصية، نفذ بسرعة الخطوات التالية 1.3-1.4 من أجل منع تدهور الحمض النووي الريبي.
  3. تمزق الخصية على طبق بيتري صغيرة وإزالة albuginea تونيكا. كشف الأنابيب شبهiferous في برنامج تلفزيوني على الجليد باستخدام ملقط.
  4. باستخدام ملقط، نقل العديد من الأنابيب (عدة قطع من الأنابيب حوالي 5-10 ملم في الطول) في بئر واحد من طبق 4-جيدا تحتوي على 500 مل من العازلة CSK + 0.5٪ تريتون X-100 على الجليد، واحتضان لمدة 6 دقائق. التعرض المفرط ل CSK العازلة قد يؤدي إلى تعطيل الخلايا.
  5. باستخدام ملقط، نقل جميع الأنابيب إلى بئر واحد من طبق 4-جيدا تحتوي على 4٪ PFA-PBS الحل. يمكن أن تكون هذه الخطوة مسبقا دون مجسم، ولكن اختياريا يمكن استخدامه. حضانة لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نفس الوقت بدء إعداد 12 حجرة السيتوسبين خلال فترات الحضانة.
  6. باستخدام ملقط، نقل جميع الأنابيب إلى بئر واحد من طبق 4-جيدا التي تحتوي على برنامج تلفزيوني. حضانة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  7. على الجانب الخلفي من شريحة زجاجية، نقل جميع الأنابيب إلى 30 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني (ينبغي تجنب الجزء العلوي من الشريحة بسبب تهمة cationic). باستخدام نصائح من اثنين من ملقط، المسيل للدموع الأنابيب إلى قطع. ختم الأنابيب في اتجاه أفقي عن طريق قص الأنابيب بين نصائح من اثنين من ملقط وسحب ملقط أفقيا. تابع هذه الخطوة لمدة 10-20 ثانية تقريبا.
  8. خلط تعليق عن طريق ماصة باستخدام ماصة P20.
  9. نقل التعليق إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق، تمييع مع برنامج تلفزيوني إلى ما يقرب من 1.3 مل. تطبيق 100 ميكرولتر من التعليق على كل من 12 حجرة سيتوسبين (1.2 مل المجموع). في هذه الخطوة، لا يحتاج تركيز الخلايا إلى تحديد.
  10. Cytospin العينات في 2000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد السيتوسبينينغ، الشرائح الجافة على مقاعد البدلاء المختبر لبضع دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد السماح للشرائح بالجفاف تماما لبضع دقائق ، انتقل إلى الخطوة التالية.
  11. باستخدام جرة كوبلين التي تحتوي على برنامج تلفزيوني، وغسل الشرائح لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  12. نقل الشرائح إلى جرة كوبلين التي تحتوي على 70٪ الإيثانول والانتظار على الأقل 2 دقيقة قبل بدء RNA FISH. الشرائح مستقرة لبضعة أسابيع في الإيثانول 70٪ في 4 درجة مئوية. للتخزين على المدى الطويل، والشرائح المجففة باستخدام العلاج التسلسلي مع الإيثانول 80٪ و 100٪ في الجرار كوبلين لمدة 2 دقيقة لكل منهما والهواء الجاف يجفف تماما الشرائح. تخزين في -80 درجة مئوية في مربع الشريحة.

2. إعداد مجس الحمض النووي Cot-1 بواسطة فتيلة عشوائية

  1. إعداد الكواشف التالية:
    1. المخزن المؤقت للتهجين: امزج مكونات الإجراءات لإعداد 900 مل من مخزون المخزن المؤقت للتهجين؛ سيتم استخدام هذا الحل لتخزين المسابير. يسمح هذا المخزون العازلة التهجين لإضافة حجم 10٪ من محلول مثبطات RNase (ريبونوكليوسيد فاناديل المعقدة) قبل التهجين.
      مكونالمبلغ (ميكرولتر)التركيز النهائي
      فورماميد50050٪ (v/v)
      50٪ ديكتران20010٪ (ث/v)
      20x SSC1002x
      1٪ بكالوريوس1000.1%
      قبل التهجين، إضافة 1/10 فول من 200 mM ريبونوكليوسيد فاناديل مجمع أو الماء إلى المخزون العازلة التهجين لتتناسب مع التركيز النهائي. عند -20 درجة مئوية، هذا الخليط مستقر لأكثر من عام.
    2. 20x SSC: حل 88.2 غرام من سترات الصوديوم و 175.3 غرام من NaCl في حوالي 800 مل من الماء. ضبط درجة الحموضة إلى 7.0 باستخدام بضع قطرات من 1 M HCl. إضافة الماء لضبط حجم النهائي إلى 1 L. تعقيم عن طريق الالاستعباد التلقائي. بعد التحضير، يمكن تخزين 20x SSC في درجة حرارة الغرفة.
    3. 50٪ (ث/v) ديكتران: يحرك الماء ويضيف ببطء 50 غرام من كبريتات ديكتران. استمر في التحريك طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. أضف الماء لضبط الحجم النهائي إلى 100 مل. تخزين في درجة حرارة الغرفة.
  2. أضف المكونات التالية المذكورة أدناه إلى أنبوب PCR. باستخدام جهاز PCR، قم بمزج المحلول واحتضانه لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية.
    مكونالكمية لكل تفاعل (ميكرولتر)نهائي
    كوت-1 DNA: 1 ملغم/مل11 ميكروغرام
    التمهيدي عشوائي 9mer (من عدة)10
    الماء27
  3. الطرد المركزي لفترة وجيزة ومكان على الجليد.
  4. إضافة المكونات التالية. مزيج واحتضان لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية باستخدام جهاز PCR. (للحصول على تفاصيل عن مجموعة تستخدم انظر الجدول من الكواشف والمعدات).
    مكونالكمية لكل تفاعل (ميكرولتر)التركيز النهائي
    خليط معد من الخطوة 2.238
    5x النيوكليوتيدات العازلة (من عدة)9.2
    Cy3-dUTP (1 متر)0.816 ميكرومتر
    كلينو (من عدة)2
  5. إضافة 2 ميكرولتر من العازلة وقف (من عدة) لوقف رد الفعل.
  6. تنقية رد الفعل توقف باستخدام أعمدة microspin.
  7. أضف 50 ميكروغرام (5 ميكرولتر) من الحمض النووي للحيوانات المنوية الرنجة (50 ضعف فائض القالب Cot-1 DNA) إلى الكسر المنقى.
  8. قياس إجمالي حجم الصوت باستخدام ماصة. أضف 0.7x حجم الإيثانول 100٪ وحجم 0.1x من خلات الصوديوم 3 M (درجة الحموضة 5.2)، مزيج جيدا، والطرد المركزي لمدة 15 دقيقة بأقصى سرعة (17،000 × غرام) باستخدام جهاز طرد مركزي صغير في 4 درجة مئوية.
  9. إزالة السائل، وإضافة 200 ميكروغرام من الإيثانول 70٪، مزيج جيدا والطرد المركزي لمدة 5 دقائق بأقصى سرعة في 4 درجة مئوية.
  10. إزالة السائل الزائد. جفف الترسب لمدة 10-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  11. حل بيليه في 20 ميكرولتر من المخزون العازلة التهجين. لأن بيليه غالبا ما يكون من الصعب حل، ماصة مرارا وتكرارا. كخيار بديل، يمكن أيضا استخدام خلاط دوامة لإذابة بيليه بكفاءة. يمكن الاحتفاظ المسابير في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.

3. كوت-1 RNA الأسماك

  1. إضافة المكونات المذكورة أدناه إلى أنبوب PCR. باستخدام جهاز PCR، احتضان لمدة 10 دقيقة في 80 درجة مئوية، تليها خطوة ما قبل التنافر من حوالي 10-30 دقيقة في 42 درجة مئوية. ابق عند 42 درجة مئوية حتى التهجين. ريبونوكليوسيد فاناديل مجمع اختياري; يمكن استبداله بالماء.
    مكونالكمية لكل تفاعل (ميكرولتر)نهائي
    مجس الحمض النووي Cot-1 (50 نانوغرام/ميكرولتر)2100 نانوغرام
    مجمع فاناديل ريبونوكليوسيد (200 متر)220 مليون متر
    المخزن المؤقت للتهجينأضيف إلى 20
  2. الشرائح المجففة في جرة كوبلين التي تحتوي على 80٪ الإيثانول لمدة 2 دقيقة، تليها جرة كوبلين تحتوي على الإيثانول 100٪ لمدة 2 دقيقة. الشرائح الجافة تماما على مقاعد البدلاء مختبر في درجة حرارة الغرفة.
  3. سخني غرفة صندوق البقشيش (مليئة ب 2-3 سم من الماء) في حاضنة 42 درجة مئوية مقدما. ضع الشريحة على غرفة صندوق البقشيش. طرد مركزي لفترة وجيزة المسابير preannealed وماصة مباشرة على الشرائح المجففة. تجنب صنع الفقاعات. قم بتغطية الشريحة برفق بقسيمة غطاء.
  4. تهجين لمدة 6 ساعات إلى ليلة واحدة (14-15 ساعة) في 42 درجة مئوية.
  5. إعداد حلول الغسيل في الجرار كوبلين (اثنين من الجرار مع كل من 2X SSC و 50٪ formamide، وجرارتين مع 2x SSC). سخني على حرارة 42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في حمام مائي.
  6. استخدم شفرة حلاقة لإزالة الغطاء من حافة الشريحة. تجنب خدش العينات. اغسل الشرائح في جرة كوبلين التي تحتوي على 2x SSC و 50٪ formamide لمدة 5 دقائق عند 45 درجة مئوية. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
  7. اغسل الشرائح في جرة كوبلين التي تحتوي على 2x SSC لمدة 5 دقائق عند 45 درجة مئوية. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
  8. أضف 20 ميكرولتر من وسائط DAPI المتصاعدة إلى الشرائح، ثم قم بتغطيتها بقسيمة غطاء. اضغط بلطف على زجاج الغطاء لإزالة وسائط التركيب الإضافية. لطخة وسائل الإعلام تصاعد اضافية مع تنظيف الأنسجة. الشرائح جاهزة لتقييم المجهر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تظهر نتيجة تمثيلية لشريحة ثلاثية الأبعاد في الشكل 2. في هذه التجربة، تم إجراء Cot-1 RNA FISH للكشف عن النسخ الوليد جنبا إلى جنب مع التلطخ المناعي باستخدام الأجسام المضادة CBX1 و γH2AX. للجمع بين RNA FISH و المناعة ، تم إجراء التلطخ المناعي أولا ، يليه RNA FISH كما هو موضح في3. CBX1 هو بروتين هيتيركروماتين الذي يحط من الهتيروماتين المحيطي والكروموسومات الجنسية الصامتة في الميوس يسمى جسم XY (أو الجسم الجنسي). γH2AX هو شكل فوسفوري من متغير الهستون H2AX ويوضع على الجسم XY. في هذه الصورة، تتراكم إش...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في إعداد الشرائح ثلاثية الأبعاد، تسبق خطوة permeabilization خطوة التثبيت. يتم تنفيذ هذه الخطوات مباشرة على الأنابيب شبهiferous، وبالتالي الحفاظ على بنية الكروماتين ثلاثي الأبعاد. خيار بديل للحفاظ على بنية الكروماتين لسمك الحمض النووي الريبي / الحمض النووي هو تنفيذ خطوة permeabilization وخطوة التثبيت في وقت واحد. وقد أجريت هذه التقنية البديلة في الخلايا الجرثومية المريخية وفي أجنة ما قبل زرع الماوس7,8. ومع ذلك، إذا كانت خطوة التثبيت تسبق خطوة permeabilization، فإنه قد يؤدي إلى خلفية السيتوبلازمية عالية. لذلك ، ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى صاحب البلاغ ما يكشف عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أشكر جيني ت. لي على الإشراف على هذا المشروع عندما كنت في مختبر لي وتايلر برويرينغ لتحرير المخطوطة. وقد تم دعم هذا العمل من قبل جائزة الباحث باسل أوكونور كاتب من مسيرة مؤسسة الدايمات ومنحة المعاهد القومية للصحة GM098605.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Cot-1 DNA Invitrogen18440-016
Stratagene Prime-It Fluor Paintinging KitAgilent300380
الحمض النووي للحيوانات المنوية للحيوانات المنوية الرنجةInvitrogen15634-017
الإيثانول. 200 دليل (مطلق)Pharmco-aaper111000200
أسيتات الصوديومSigma-AldrichS2889
فورماميد منزوع الأيوناتالتحليل الحيوي الأمريكيAB00600-00500
سترات الصوديوم ثلاثي القاعدة ثنائي الهيدراتسيجما ألدريتشC8532
مصل الأبقار الألبومينلايف بلود ميديكال77110-100
ديكستران كبريتات ملح الصوديوم من Leuconostoc spp.سيجما ألدريتشD6001
RPMI 1640InvitrogenA10491-01
السكروزسيجما ألدريتشS0389
الأنابيبسيجما ألدريتشP6757
سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيومسيجما ألدريتشM0250
تريتون X-100سيجما ألدريتشT8787
بارافورمالديهايدSigma-Aldrich76240
هيدروكسيد الصوديومSigma-Aldrich221465
فوسفات مخزن محلول ملحيSigma-AldrichP4417
VECTASHIELD Mounting Medium مع DAPIVector LaboratoriesH1200
مركب الريبونوكليوزيد الفاناديلنيو إنجلاند BiolabsS1402S
Illustra MicroSpin G-50 الأعمدة GEHealthcare27-5330-01
أجهزة الطرد المركزيالدقيقة Eppendorf5424
الملقطVWR300-050
أنابيب الطرد المركزي الدقيقةBioexpressC-3262-1
Cytospin 3Shandon
Coplin JarFisher08-815
Superfrost / Plus Microscope Slidesفيشر12-550-15
طبق 4 آبارفيشر12-566-301
غطاء زجاج   ;فيشر12-544-G
حاضنة الهواءالعلوم الثوريةRS-IF-203
محلول

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline. Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).
  2. Namekawa, S. H., et al. Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice. Curr Biol. 16, 660-667 (2006).
  3. Namekawa, S. H., Lee, J. T. Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos. Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).
  4. Mahadevaiah, S. K., Costa, Y., Turner, J. M. Using RNA FISH to study gene expression during mammalian meiosis. Methods in molecular biology. 558, 433-444 (2009).
  5. Hall, L. L., et al. An ectopic human XIST gene can induce chromosome inactivation in postdifferentiation human HT-1080 cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 8677-8682 (2002).
  6. Huynh, K. D., Lee, J. T. Inheritance of a pre-inactivated paternal X chromosome in early mouse embryos. Nature. 426, 857-862 (2003).
  7. Namekawa, S. H., VandeBerg, J. L., McCarrey, J. R., Lee, J. T. Sex chromosome silencing in the marsupial male germ line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9730-9735 (2007).
  8. Namekawa, S. H., Payer, B., Huynh, K. D., Jaenisch, R., Lee, J. T. Two-step imprinted X inactivation: repeat versus genic silencing in the mouse. Mol Cell Biol. 30, 3187-3205 (2010).
  9. Ichijima, Y., et al. MDC1 directs chromosome-wide silencing of the sex chromosomes in male germ cells. Genes Dev. 25, 959-971 (2011).
  10. Sin, H. S., et al. RNF8 regulates active epigenetic modifications and escape gene activation from inactive sex chromosomes in post-meiotic spermatids. Genes Dev. 26, 2737-2748 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

COT 1 XY

مقالات ذات صلة