في المختبر المقايسة المشتركة لتقييم الهجرة العدلية المستحثة المسببة للأمراض عبر الظهارية

السطوح المخاطية بمثابة حواجز مادية ومناعية توفر الحماية من التهديدات الخارجية المنتشرة في البيئة^1،2. يمكن اختراق هذا الحاجز الظهاري الواقي عندما تغزو الكائنات المسببة للأمراض^2. في حالة الممرض البكتيري ، غالبا ما يحرض هذا اللقاء على عملية التهابية عن طريق تنشيط الجهاز المناعي الفطري مما يؤدي إلى تعبئة سريعة للخلايا الحبيبية المستجيبة الأولى المعروفة باسم العدلات^2-4. يتم إنتاج عوامل العلاج الكيميائي التي تسهل تجنيد العدلات جزئيا من قبل الخلايا الظهارية المخاطية التي تسعى لتخليص المضيف من الممرض المخالف^2-4. يمكن أن يسبب تسلل العدلات المفرط أو غير المحسوم للسطح الظهاري المخاطي أمراضا كبيرة^1،5. هذا هو نتيجة لتلف الأنسجة غير محددة الناجمة عن ترسانة العدلات المضادة للبكتيريا^5-7. في مثل هذه الحالات ، تطغى قدرة إزالة البكتيريا من العدلات من خلال تدمير الأنسجة المضيفة أثناء الإهانة المعدية.  يمكن أن يؤدي تعطيل وظيفة الحاجز الظهاري الواقي إلى تعزيز تعرض الأنسجة الأساسية للكائنات الحية الدقيقة و / أو السموم ، مما يزيد من تفاقم أمراض الأمراض^8،9. ويمكن ملاحظة هذه العواقب في أجهزة متعددة بما في ذلك الرئة والجهاز الهضمي^1,5. وعلاوة على ذلك ، تتميز الحالات الالتهابية غير المعدية مثل نوبات الربو الشديدة ومرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD) ومتلازمة الضائقة التنفسية الحادة (ARDS) ومرض التهاب الأمعاء (IBD) بالاختراق المرضي للحاجز الظهاري المخاطي من خلال استجابة العدلات^{المفرطة 4،5،10-12}.

عملية معقدة من تجنيد العدلات بعد العدوى المخاطية ينطوي على عدة خطوات مجزأة^1,5,13,14. أولا، العدلات يجب أن تخرج عن الدورة الدموية عن طريق سلسلة من التفاعلات بين الخلايا التي تسهل الهجرة عبر البطانية^1،13. العدلات المقبل التنقل الفضاء الخلالي القائمة التي تحتوي على مصفوفة خارج الخلية^1,14. للوصول إلى تجويف الغشاء المخاطي المصاب ، يجب أن تهاجر العدلات عبر الحاجز الظهاري^1،4،5. وغالبا ما يتم التحقيق في هذه الظاهرة متعددة الخطوات المعقدة في المجموع باستخدام نماذج حيوانية في الجسم الحي للعدوى^15. هذه النماذج مفيدة لتحديد ضرورة وجود عوامل محددة، مثل chemokines، جزيئات التصاق، أو مسارات الإشارات التي تشارك في العملية الشاملة ولكنها غير كافية إلى حد كبير لحل المساهمات الجزيئية الحاسمة لكل خطوة مجزأة متميزة¹⁶. وقد شارك في زراعة نظم المختبر النمذجة عبر البطانية، عبر مصفوفة، أو الهجرة عبر الظهارية من العدلات مفيدة بشكل خاص في هذا الصدد^{1،14،16،17}.

وقد تم تطوير نظام قوي للثنايا المشتركة للتحقق من شفرة الآليات المسؤولة عن الهجرة عبر الظهارية العدلات استجابة للعدوى المسببة للأمراض^18-22. هذا النموذج ينطوي على إصابة السطح apical من طبقات الخلايا الظهارية البشرية المستقطبة مع مسببات الأمراض البكتيرية تليها تطبيق العدلات البشرية المعزولة حديثا على سطح basolateral^18-22. تهاجر العدلات عبر الحاجز الظهاري استجابة للمنتجات الكيميائية المشتقة من الظهارية التي تفرز بعد العدوى المسببة للأمراض^18،21-23. وقد تم استخدام هذا النظام النموذجي باستخدام الثقافات الظهارية المعوية والرئة المعرضة لمسببات الأمراض البكتيرية المناسبة الأنسجة محددة وكشف النقاب عن آليات جزيئية جديدة من المرجح أن تكون مهمة لعملية تجنيد العدلات خلال العدوى المخاطية^3,8,19,24-28. قوة هذا النموذج في المختبر الزراعة المشتركة هو أن النهج الاختزالي تمكن المحقق من التلاعب تجريبيا الممرض، حاجز الظهارية، و / أو العدلات في نظام تسيطر عليها بشكل جيد، استنساخ عالية، وغير مكلفة إلى حد ما. يمكن الاستفادة من البصيرة التي تم جمعها من هذا النهج بشكل فعال لإجراء تحليل مركز للأحداث المجزأة أثناء توظيف العدلات باستخدام نماذج عدوى الجسم الحي ^22,29,30.

توضح هذه المقالة الخطوات المتعددة اللازمة لنجاح إنشاء هذا النموذج القابل للاستنساخ لاستكشاف الهجرة العدلية الناجمة عن مسببات الأمراض عبر الظهارية. وترد الحواجز الظهارية الرئة المصابة بمسببات الأمراض Pseudomonas aeruginosa في هذه المقالة; ومع ذلك، يمكن استبدال الظهارة الأنسجة الأخرى ومسببات الأمراض مع تعديلات طفيفة. البذر وزراعة طبقات الخلايا الظهارية الرئة المستقطبة على الكولاجين المقلوب المغلفة مرشحات عبرويل نفاذية مفصلة هنا، كما هو نمو المسببة للأمراض P. aeruginosa وعزل العدلات من الدم كله. يتم تقديم كيفية دمج هذه المكونات لمراقبة الهجرة الناجمة عن مسببات الأمراض العدلات عبر الظهارية جنبا إلى جنب مع الضوابط الإيجابية والسلبية المناسبة لإنشاء المقايسة القابلة للاستنساخ. وتناقش براعة هذا النهج لدراسة مختلف جوانب الهجرة العدلية الناجمة عن مسببات الأمراض عبر الظهارية مع الإشارة إلى دراسات محددة في الأدبيات.

يجب تنفيذ الخطوات (1-3) في بيئة معقمة تحت غطاء تدفق صفح.

1. كولاجين طلاء Transwells

1. جعل محلول الكولاجين 30 ميكروغرام / مل. تمييع 3 ملغ / مل مخزون الكولاجين 1:100 في الإيثانول 60٪ التي تم تمريرها من خلال وحدة تصفية 0.2 ميكرومتر.
2. دوامة المخفف 30 ميكروغرام / مل الحل. ملاحظة: ليس من الضروري دوامة محلول مخزون الكولاجين 3 ملغم / مل ، لأن هذا الحل لزج للغاية ويمكن إدخال فقاعات الهواء ، مما قد يقلل من الدقة عند الأنابيب.
3. إزالة 0.33 سم² transwells منطقة النمو مع حجم المسام من 3 ميكرومتر من التعبئة والتغليف خارج ووضع لوحة 24 جيدا تحتوي على 12 transwells رأسا على عقب داخل غطاء محرك السيارة.
4. ارفعي الطبق السفلي وضعيه جانبا. ملاحظة: سوف Transwells الآن رأسا على عقب يستريح فوق غطاء لوحة 24 جيدا
5. تشغيل الموقد بونسن. لهب hemostat للعقم والسماح لتبرد.
6. مع الهموستات العقيمة، نقل transwells إلى طبق بيتري 150 ملم × 25 ملم، والاحتفاظ بها في موقف مقلوب. ملاحظة: تأكد من الحفاظ على عقم لوحة فارغة 24 جيدا بالإضافة إلى غطاء لاستخدامها لإيواء transwells مرة واحدة وقد تم بذرها مع الخلايا الظهارية.
7. ماصة 70 ميكرولتر من محلول الكولاجين 30 ميكروغرام / مل على غشاء تصفية كل transwell مقلوب. ملاحظة: يجب أن يحمل التوتر السطحي هذا الحجم من الحل في مكانه حيث لا توجد جدران حول غشاء الفلتر عند الوصول إلى سطح الجانب السفلي. كن حذرا من أن محلول الكولاجين لا يقطر أسفل جانب ترانسويل وتجنب نقل transwells أثناء إجراء الطلاء.
8. اترك غطاء طبق بيتري لمدة لا تقل عن 4 ساعات للسماح لمحلول الإيثانول بالتبخر. للحفاظ على العقم خلال هذه العملية الحفاظ على مروحة غطاء محرك السيارة والأشعة فوق البنفسجية على.
9. بعد أن تجفف الأطباق، يمكن استخدامها على الفور أو تخزينها في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى أسبوع شريطة أن يكون غطاء طبق بيتري في مكانه ويتم الحفاظ على العقم.

2. قارورة مرور الخلايا الظهارية لزرع Transwells

(يصف هذا البروتوكول على وجه التحديد التعامل مع خط الخلية الظهارية الرئة H292 لتوليد الحواجز الظهارية نمت على transwells. يمكن استخدام خطوط الخلايا الظهارية الأخرى مع تعديلات طفيفة.)

1. إعداد الثقافة المتوسطة بإضافة 10٪ الحرارة المعطل مصل البقر الجنيني (HI-FBS) و 1x البنسلين / ستريبتومايسين إلى RPMI 1640.
2. وسائل الإعلام الدافئة، تريبسين-EDTA (T-EDTA)، وD-PBS في 37 حمام مائي درجة مئوية.
3. إزالة قارورة T-75 التي تحتوي على خلايا من الحاضنة وتقييم التقاء بصريا مع المجهر مقلوب. ملاحظة: عند استخدام خلايا H292، يجب أن تكون القوارير قريبة من أو التقاء كامل.
4. أسبيرات وسائل الإعلام من القارورة. تقليل طول الوقت الذي الخلايا الجافة عن طريق وجود الحل التالي في غطاء محرك السيارة مع غطاء خففت.
5. إضافة 5 مل D-PBS إلى قارورة T-75 ودوامة. تجنب خلق فقاعات. إزالة برنامج تلفزيوني عن طريق الطموح.
6. إضافة 3 مل T-EDTA إلى قارورة T-75 ودوامة لتغطية القاع.
7. إزالة معظم T-EDTA، وترك ما يقرب من 0.3 مل في قارورة T-75.
8. توزيع الحجم الصغير المتبقي من T-EDTA على مساحة سطح الخلايا ووضعها في حاضنة مرطبة في ظل ظروف الثقافة القياسية (37 درجة مئوية، 5٪ CO₂).
9. بعد فترة من الزمن، قم بإزالة القارورة من الحاضنة. ملاحظة: يجب أن تنفصل الخلايا بسهولة عن سطح القارورة عن طريق النقر بلطف على القارورة على جانبها. يجب الآن تقريب الخلايا وتعويمها عند تصورها تحت المجهر. متوسط الوقت الذي سيستغرقه هذا لخلايا H292 هو 5-10 دقيقة.
10. إضافة 10 مل وسائل الإعلام الثقافة إلى قارورة لتحييد T-EDTA والخلايا resuspend. وضع حل الخلية في طرف ماصة وإخراج على سطح قارورة تحتوي على خلايا ما يقرب من خمس مرات لإعادة إنفاق جميع الخلايا.
11. نقل الخلايا التي أعيد إنفاقها إلى أنبوب 15 مل لزرع transwells. ملاحظة: تركيز خلايا H292 التي أعيد إنفاقها المعدة بهذه الطريقة يجب أن يتراوح بين 1 × 10⁶- 1.8 × 10⁶ خلايا / مل.

3. بذر الكولاجين المغلفة Transwells مع الخلايا الظهارية

1. إضافة 70 ميكرولتر من محلول الخلية resuspended من أنبوب 15 مل إلى كل ترانزويل المغلفة الكولاجين مقلوب. ملاحظة: سوف حلول الخلية H292 مع نطاق تركيز بين 1 × 10⁶-1.8 × 10⁶ خلايا / مل تسفر عن ما يقرب من 70،000-120،000 الخلايا / transwell.
2. اخلط تعليق الخلية عن طريق قلب الأنبوب برفق بشكل دوري لمنع الخلايا من الاستقرار إلى أسفل الأنبوب 15 مل أثناء بذر الأنابيب. ملاحظة: لا دوامة الخلايا وتوخي الحذر من أن تلميح ماصة لا يأتي في اتصال مباشر مع الكولاجين المغلفة مرشح الغشاء.
3. مرة واحدة وقد تم بذر جميع transwells مقلوب مع الخلايا الظهارية، واستبدال غطاء طبق بيتري ووضع بعناية في حاضنة ثقافة الأنسجة، رطب، 37 درجة مئوية، 5٪ CO₂. الحرص على تجنب إزعاج تعليق الخلية التي تمت إضافتها إلى غشاء فلتر الكولاجين المغلفة.
4. الحفاظ على transwells مقلوب في حاضنة زراعة الأنسجة، رطب، 37 درجة مئوية، 5٪ CO₂ بين عشية وضحاها. ملاحظة: يجب أن تظل فقاعة السائل المحتوي على خلايا مرتبطة بغشاء الفلتر النفاذ للمتحول طوال فترة الحضانة بين عشية وضحاها. إذا أصبح غشاء الفلتر جافا بسبب تبخر السائل أو لأن السائل يقطر أسفل جانب الزوال ، فقد لا تنمو الطبقات الظهارية بشكل صحيح.
5. في اليوم التالي، إضافة 1 مل وسائل الإعلام في لوحة 24-جيدا العقيمة الأصلي والوجه كل transwell مقلوب باستخدام hemostat معقمة في كل بئر تحتوي على 1 مل من وسائل الإعلام.
6. إضافة 0.2 مل وسائل الإعلام في الغرفة العليا من كل transwell والعودة إلى حاضنة زراعة الأنسجة، رطب، 37   درجة مئوية، 5٪ CO₂.
7. يمكن استخدام إعادة الزرع المقلوب H292 من 8 أيام إلى شهر واحد بعد البذر. ملاحظة: نقترح الانتظار لمدة لا تقل عن 8 أيام بعد بذر النبتة لضمان أن الطبقات الأحادية الظهارية قد تشكلت بالكامل وتظهر حاجزا وظيفيا. يمكن للمرء اختبار الحاجز الظهاري H292 عن طريق تحديد ما إذا كان أحادي الطبقة قادر على تقييد التدفق عبر الظهارية من بيروكسيديز الفجل الحصان البروتين (HRP) بعد إضافة إلى سطح البازلتريا¹⁸.

4. إعداد البكتيريا للعدوى من الطبقات الظهارية على Transwells

1. قبل يوم واحد من التجربة، استخراج مستعمرة واحدة من P. aeruginosa PAO1 من لوحة العزلة Pseudomonas أجار ومستعمرة واحدة من K12 E. القولونية MC1000 من لوحة لوريا-بيرتاني (LB) أغار ووضعها في أنابيب منفصلة تحتوي على 3 مل من مرق LB. تنبيه: P. aeruginosa هو ممرض بشري ، يجب اعتماد تدابير السلامة القياسية BSL2 عند التعامل مع هذا الكائن الحي.
2. هز بين عشية وضحاها في 225 دورة في الدقيقة في بيئة 37 درجة مئوية.
3. في اليوم التالي، إزالة 1 مل من الثقافات البكتيرية الكثيفة ووضعها في أنابيب Eppendorf 1.5 مل.
4. تدور في microfuge في 15800 × غرام لمدة 5 دقائق ثم إزالة supernatant.
5. إعداد هانكس 'متوازن محلول الملح مع الكالسيوم والمغنيسيوم (HBSS +) مقدما. أضف 23.8 غرام HEPES و97.5 غ من مسحوق HBSS+ إلى 9.5 لتر من الماء المقطر. إضافة كميات صغيرة من 10 M NaOH إلى الحل، في حين رصد pH حتى يتم التوصل إلى رقم س مستقر من 7.4. رفع مستوى الصوت إلى 10 لتر وتخزينها في 4 درجة مئوية.
6. Resuspend كل بيليه البكتيرية مع 1 مل HBSS +. دوامة للتأكد من تحقيق تعليق البكتيرية حتى.
7. تدور مرة أخرى في 15800 × ز لمدة 5 دقائق وإزالة supernatant.
8. Resuspend بيليه PAO1 مع 0.6 مل HBSS + وMC1000 بيليه مع 0.5 مل HBSS +. دوامة تعليق البكتيرية.
9. مزيد من التخفيف من PAO1 وMC1000 الكريات التي أعيد إنفاقها 1:100 في HBSS +. على سبيل المثال، إضافة 50 ميكرولتر من بيليه PAO1 0.6 مل إعادة إنفاق إلى 5 مل HBSS +. ملاحظة: باستخدام قياسات الكثافة البصرية (OD) لتحديد كثافة الثقافة وكذلك منهجية طلاء تخفيف وحدة تشكيل المستعمرة القياسية (CFU) ، فإن حلول PAO1 و MC1000 التي تم إعدادها بهذه الطريقة تسفر باستمرار بين 3 × 10⁷-6 × 10⁷ CFU / مل. ترتبط كثافة الثقافة البكتيرية بشكل إيجابي مع قياس OD للثقافة عند 600 نانومتر ويمكن استخدام هذا الارتباط لتقدير تركيز الخلايا البكتيرية. لتأكيد تركيز الخلية البكتيرية ، يمكن تخفيف الثقافة إلى تركيز مقدر منخفض للغاية ومطلي على طبق أجار بحيث يتوقع المرء وجود ما بين 30-200 خلية بكتيرية على اللوحة. تنتشر الخلايا عبر اللوحة وتحتضن بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية بحيث تشكل كل خلية مستعمرة فردية من الخلايا الكبيرة بما يكفي لتكون مرئية ويمكن بعد ذلك عد المستعمرات.

5. عزل العدلات من الدم الكامل

1. حمض سيترات dextrose الحل (ACD) يستخدم كمضاد للتخثر وأعدت بإضافة 6.9 غرام حمض الستريك، 12.5 غرام سيترات الصوديوم، و 10 غرام dextrose إلى 500 مل الماء المقطر. بمجرد حل جميع المكونات ، يتم تعقيم محلول ACD عن طريق المرور عبر وحدة تصفية 0.2 ميكرومتر. تخزين حل ACD في 4 درجة مئوية.
2. قبل سحب الدم، إضافة 5 مل ACD إلى 50 مل حقنة وإرفاق 21 × 3/4 إبرة فراشة G مع 12 في الأنابيب.
3. تطبيق tourniquet، مسح الوريد مع الكحول، وإدراج إبرة. ملاحظة: يجب أن تتم الموافقة على أي بروتوكول بحثي يشمل الأشخاص من قبل مجلس مراجعة مؤسسي ويجب تقديم موافقة خطية مستنيرة من كل متبرع بالدم. على سبيل المثال، تمت الموافقة على التجارب التي أجريت باستخدام هذا البروتوكول من قبل مجلس المراجعة المؤسسية للمستشفى العام في ماساتشوستس وتم تعيين بروتوكول #1999-P-007782.
4. رسم ببطء 45 مل من الدم ضمان أن يختلط الدم مع ACD مرة واحدة في الحقنة.
5. عندما تم رسمها 45 مل (50 مل الحجم الإجمالي), فك التورنيكيت قبل إزالة الإبرة. تطبيق الضغط على الفور على الجرح بالشاش العقيم عند إزالة إبرة.
6. نقل الدم ببطء إلى أسفل الجانب من أنبوب 50 مل على مدى ما يقرب من 5-10 ثانية.
7. تدور في الطرد المركزي في 1000 × ز مع تعطيل الفرامل لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ملاحظة: خطوة إضافية تنطوي على تخفيف الدم كله في برنامج تلفزيوني- وتراكب دقيق من الدم المخفف على فيكول-باك قبل الطرد المركزي يمكن استخدامها لتحقيق مستوى أعلى قليلا من نقاء العدلات عن طريق فصل أكثر كفاءة معطف بافي من المحببات⁸. حذف هذه الخطوة يعمل على توفير الوقت دون التأثير بشكل كبير على العائد أو النقاء لأغراض هذا المقايسة، وبالتالي نحن نفضل عدم إدراج تراكب الدم على خطوة فيكول باك.
8. بينما الدم يدور، ببطء شديد إضافة 1 غرام الجيلاتين في 50 مل ساخنة هانكس 'محلول الملح المتوازن دون الكالسيوم والمغنيسيوم (HBSS(-)) لإعداد محلول الجيلاتين 2٪. حافظ على الحل عند 37 درجة مئوية.
9. أسبيرات والتخلص من البلازما من أنبوب 50 مل من الدم باستخدام طرف ماصة الزجاج الذي تم علاجه مع Sigmacote.
10. استمر في التجسس بعناية فائقة لإزالة معطف بافي ، الذي يحتوي على خلايا الدم البيضاء ، بما في ذلك الخلايا الليمفاوية.
11. كما يتم إزالة معطف برتقالي ببطء، فإن المواد الملبدة بالغيوم الصفراء بيضاء فوق خلية الدم الحمراء (RBC) طبقة تختفي. وقف الطموح مرة واحدة تتم إزالة معطف برتقالي وطبقة RBC يمكن تصورها بوضوح عند عرض من فوق الأنبوب.
12. حاول عدم إزعاج طبقة RBC حيث أن الخلايا الحبيبية ، ومعظمها العدلات ، بالقرب من سطح طبقة RBC ، ولكنها غير مرئية.
13. إلى حجم 15 مل طبقة RBC، إضافة 30 مل الحارة 2٪ حل الجيلاتين (2x حجم طبقة RBC).
14. عكس أنبوب بلطف لخلط، مع الحرص على تقليل تشكيل فقاعات.
15. احتضان في 37   درجة مئوية لمدة 25 دقيقة ملاحظة: يجب أن تجمع RBCs وتستقر في القاع. كبديل للجيلاتين، يمكن استخدام dextrans الوزن الجزيئي كبيرة لرواسب RBCs⁸.
16. بعد الحضانة، نقل الطبقة العليا حل المحمر الخفيفة التي تحتوي على الحبيبات في أنبوب 50 مل جديدة مع ماصة، مع الحرص على عدم تعكير صفو طبقة RBC الظلام استقر أثناء النقل. بمجرد فصلها، تجاهل طبقة RBC الداكنة.
17. تدور نقل محلول المحمر الخفيفة التي تحتوي على الحبيبيات وبعض RBCs في الطرد المركزي في 1000 × ز مع الفرامل تنشيط لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة من أجل بيليه الخلايا.
18. صب قبالة أو يستنشق supernatant بعناية، كما بيليه الخلية المحمر التي سوف تشكل بعد الطرد المركزي فضفاضة عموما.
19. إعداد RBC تحلل العازلة مقدما وتخزينها في 4 درجة مئوية بإضافة 8.29 غرام كلوريد الأمونيوم (NH₄Cl), 1 غرام بيكربونات الصوديوم (NaHCO_3),و 0.038 ز EDTA إلى 1 L الماء المقطر في كوب. تخزين مخزن تحلل RBC في 4 درجة مئوية.
20. Resuspend وتفتيت بيليه الخلية المحمر مع حجم صغير من الباردة تحلل RBC العازلة. مرة واحدة بيليه الخلية في الحل، وملء أنبوب إلى 50 مل مع تحلل RBC العازلة. ملاحظة: عند هذه النقطة والمضي قدما، والحفاظ على الخلايا على الجليد أو في 4 درجة مئوية.
21. تدور في أجهزة الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 10 دقيقة في   4 درجة مئوية ومن ثم صب قبالة أو يستنشق supernatant. ملاحظة: سوف يكون supernatant المحمر إلى حد ما تحتوي على RBCs lysed. يجب أن تكون الكريات بيضاء مصفرة في هذه المرحلة. إذا ظلت المركبات المفلورة المفلورة كبيرة في الكريات كما هو مبين في بيليه المحمر، يمكن تكرار الخطوة 5.20-5.21. تبقى الخلايا التكرارية الكبيرة في بيليه الخلية إذا لم يتم تقسيم بيليه المحمر من الخطوة 5.20 بما فيه الكفاية.
22. Resuspend وتفتيت بيليه بيضاء مع حجم صغير من HBSS(-) ومن ثم ملء أنبوب إلى 50 مل مع HBSS (-). ملاحظة: يجب استخدام HBSS(-) وليس HBSS+ لإعادة إنفاق بيليه الخلية البياضية. HBSS (-) يفتقر إلى الكالسيوم والمغنيسيوم.
23. تدور مرة أخرى في الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 10 دقيقة في 4   درجة مئوية.
24. صب قبالة supernatant وإعادة إنفاق بيليه إلى حجم نهائي من 1 مل HBSS (-).
25. إضافة 5 ميكرولتر من تعليق الخلية 1 مل إلى 250 ميكرولتر HBSS(-) في أنبوب Eppendorf 1.5 مل وتخلط بلطف صعودا وهبوطا عن طريق ماصة.
26. إضافة 25 ميكرولتر تعليق الخلية المخفف إلى 25 ميكرولتر 0.4٪ تريبان الأزرق.
27. أضف 12 ميكرولتر من الخليط إلى كل جانب من مقياس الدم القياسي.
28. عد عدد الخلايا الحية التي استبعدت صبغة تريبان الزرقاء ومتواجدة في المربع الأوسط من كلا الجانبين من مقياس الدم.
29. لحساب تركيز الخلية، اضرب متوسط المربعين بمقدار 100 (عامل تخفيفي) ثم اضرب ب 10⁴ لإعطاء عدد الخلايا/مل.
30. ضبط التركيز النهائي إلى 5 × 10⁷ خلايا / مل. إذا كان أكبر من 5 × 10⁷ خلايا / مل، ضبط عن طريق إضافة HBSS (-). إذا كان أقل، بيليه الخلايا وإعادة الإنفاق على حجم مناسب.
31. إبقاء الخلايا على الجليد حتى جاهزة للقيص الهجرة. ملاحظة: تمثل هذه الخلايا السكان المحببة من خلايا الدم البيضاء. غالبية الحبيبات المعزولة عن الدم البشري كله هي العدلات. يتم الاحتفاظ بالخلايا على الجليد المعلقة في HBSS(-) حتى إضافة إلى المقايسة الهجرة من أجل الحفاظ على الخلايا في حالة هادئة.

6. إعداد طبقات الخلايا الظهارية لمقاايسة الهجرة

(هذهالخطوات لا تحتاج إلى أن يتم تنفيذها داخل غطاء محرك السيارة العقيم.)

1. إزالة من الحاضنة 24 جيدا لوحة دعم الطبقات الظهارية التي تم استزراعها على الجانب السفلي من أغشية مرشح transwell لمدة ثمانية أيام على الأقل.
2. فهم حافة كل transwell مع hemostat، ورفع من لوحة 24 جيدا وعكس transwell على دلو النفايات لتجاهل وسائل الإعلام الثقافية من الغرفة الداخلية للtranswell. تراجع كل transwell في كوب غسيل يحتوي على HBSS + لملء الغرفة الداخلية من transwell مع HBSS +. تجاهل السوائل من الغرفة الداخلية في دلو النفايات.
3. كرر الخطوة 6.2 لغسل ثانية في HBSS +. بعد غسل اثنين، ضع transwells في لوحة جديدة من 24 بئرا تحتوي على 1 مل HBSS + في كل بئر. ملاحظة: يجب إجراء جميع الغسيلات باستخدام HBSS+ التي يتم تسخينها إلى 37 درجة مئوية.
4. مراقبة الغرفة العليا من كل transwell لتقييم سلامة طبقة الخلية الظهارية. ملاحظة: HBSS + لا ينبغي أن تسرب إلى وملء الغرفة العليا من transwell عند وضعها في بئر لوحة 24 جيدا تحتوي على 1 مل من HBSS +.
5. بعد مراقبة بعناية كل transwell، إضافة 0.2 مل من HBSS + في الغرفة العليا.
6. ضعه في الحاضنة عند درجة   الحرارة 37 درجة مئوية، و5٪ من ثاني أكسيد الكربون في غرفة رطبة لمدة 30-60 دقيقة لتوازن طبقات الخلايا الظهارية.

7. م المقايسة الهجرة عبر الظهارية العدلات

1. إزالة من الحاضنة 24-جيدا لوحة من transwells غسلها equilibrating في HBSS +.
2. فهم كل transwell مع hemostat وتجاهل السوائل في أعلى جيدا في دلو النفايات.
3. ضع كل ترانسويل رأسا على عقب في طبق بيتري مقاس 150 مم × 25 ملم.
4. إلى ستة من Transwells مقلوب، إضافة 25 ميكروغرام من HBSS +. إلى ثلاثة من transwells مقلوب، تصيب مع 25 ميكرولتر P. aeruginosa (PAO1) المخفف في HBSS + أعدت على النحو المبين في الخطوة 4. إلى النهائي ثلاثة transwells مقلوب، مع إصابة 25 ميكرولتر E. القولونية K12 (MC1000) المخفف في HBSS + أعدت على النحو المبين في الخطوة 4. هذا هو ما يقرب من 0.8 × 10⁶-1.5 × 10⁶ CFUs / طبقة الظهارية لكل نوع من الأنواع البكتيرية منذ تركيز المحاليل البكتيرية المعدة في الخطوة 4 هو ما يقرب من 3 × 10⁷-6 × 10⁷ CFU / مل.
5. حضانة في 37   درجة مئوية، 5٪ CO₂ في غرفة رطبة لمدة 60 دقيقة.
6. إعداد fMLP كتحكم إيجابي للهجرة العدلات بإضافة 5 ميكرولتر من المخزون fMLP 10 mM إلى 5 مل HBSS + إعطاء حل 10 ميكرومتر.
7. غسل transwells عن طريق استيعاب مع hemostat والتقليب مرة أخرى إلى لوحة غسل 24 جيدا التي تحتوي على 1 مل HBSS + في الغرف السفلية. أضف 0.2 مل من HBSS+ إلى الغرف العلوية.
8. فهم transwell مع hemostat وإزالة من لوحة الغسيل الأولى. قبل وضع transwells في لوحة غسل ثانية 24 جيدا تحتوي على 1 مل HBSS +، تجاهل السوائل من الغرفة العليا في دلو النفايات. إضافة 0.2 مل من HBSS + إلى الغرفة العلوية.
9. كرر الخطوات 7.8 مرة أخرى لما مجموعه 3 يغسل. ملاحظة: يجب أن تخضع جميع المتحولين جنسيا لنفس نظام المناولة والغسيل ، سواء كانوا مصابين بالبكتيريا أم لا ، لضمان أن جميع المتحولين جنسيا الذين يتم فحصهم قد تم التلاعب بهم بنفس الطريقة. عدوى 60 دقيقة مع إما PAO1 أو MC1000 لا يقلل من الجدوى أو تغيير خصائص الحاجز من أحادي الطبقة H292 كما تم تقييمها من قبل اختبار السموم القائم على اللاكتات ديهيدروجيناز ومقصات تدفق HRP، على التوالي^18،22.
10. إعداد لوحة الهجرة 24 جيدا عن طريق إضافة 1 مل HBSS + في 12 بئرا من لوحة 24 جيدا. ملاحظة: يمكن إعداد هذه اللوحة مسبقا.
11. بعد الغسيل الثالث ، تجاهل السوائل من الغرف العليا من transwells في دلو النفايات باستخدام hemostat ووضع ثلاثة من transwells غير المصابة في ثلاثة آبار من لوحة الهجرة 24 بئرا تحتوي على 1 مل HBSS + ، والذي يمثل السيطرة السلبية.
12. ماصة 10 ميكرولتر من محلول 10 ميكرومتر من fMLP في كل بئر من الآبار الثلاثة من لوحة الهجرة 24 بئرا تحتوي على 1 مل HBSS + (100 nM).
13. ضع ثلاثة من الآبار المتحولة غير المصابة في ثلاثة آبار من لوحة الهجرة ذات 24 بئرا التي تحتوي على 100 nM fMLP ، مما يمثل تحكما إيجابيا في قدرة العدلات المعزولة على الهجرة.
14. ضع ثلاثة الآبار المتحولة المصابة PAO1 وثلاثة transwells المصابة MC1000 في ثلاثة آبار لكل منها على التوالي من لوحة الهجرة 24 بئرا تحتوي على 1 مل HBSS +. إضافة 0.1 مل من HBSS + إلى الغرفة العليا من كل transwell.
15. على رأس 0.1 مل HBSS + في كل transwell، إضافة بعناية 20 ميكرولتر من تعليق العدلات (5 × 10⁷ خلايا / مل) أعدت على النحو المبين في الخطوة 5. ملاحظة: هذا يمثل ما يقرب من 1 × 10⁶ العدلات / transwell.
16. احتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ CO₂ في غرفة رطبة لمدة 2 ساعة للسماح الهجرة عبر الظهارية من العدلات.
17. إعداد منحنى قياسي لتحديد عدد العدلات التي هاجرت بعد 2 ساعة. إضافة 40 ميكرولتر من تعليق العدلات (5 × 10⁷ خلايا / مل) إلى 2 مل من HBSS(+) ونقل 1 مل إلى 1 مل HBSS(+) وإجراء المخففات التسلسلية 2 أضعاف ثماني مرات إضافية لما مجموعه 10 معايير تتراوح بين حوالي 2000 خلية / مل إلى 1 × 10⁶ خلايا / مل. تضمين 1 مل HBSS(+) للفراغ.
18. بعد 2 ساعة من الهجرة، ارفع الآبار العابرة عن طريق الإمساك بالهموستات واضغط بلطف على الجدران الداخلية للوحة الهجرة ذات ال 24 بئرا. تجاهل المتحولين جنسيا.
19. تقييم هجرة العدلات بشكل كبير في الآبار من خلال عرض آبار لوحة الهجرة 24 بئرا تحت مجهر مقلوب باستخدام الهدف 10X (انظر الشكل 1 لصور العدلات المهاجرة في كل حالة).
20. أضف 50 ميكرولتر من 10٪ تريتون X-100 إلى كل بئر مستخدم في لوحة الهجرة ذات 24 بئرا، وكل معيار، والفارغ.
21. تدوير لوحة الهجرة 24 جيدا، والمعايير، وفارغة بسرعة منخفضة لمدة 20 دقيقة في 4   درجة مئوية.
22. إعداد المخزن المؤقت سيترات 1 M مقدما. أضف 52.5 غ من حمض الستريك و73.5 غرام من سيترات الصوديوم إلى 400 مل من الماء المقطر في كوب. جلب pH إلى 4.2. إضافة الماء المقطر للحل النهائي من 500 مل. تخزين الحل في 4 درجة مئوية.
23. إعداد ABTS حل الركيزة الطازجة في ذلك اليوم. إضافة 3 أقراص ABTS (10 ملغ لكل منهما) و 5 مل من 1 متر سيترات عازلة إلى 45 مل من الماء المقطر. السماح للأقراص تذوب تماما في الحل. حجب إضافة 50 ميكرولتر من بيروكسيد الهيدروجين 30٪ حتى هناك حاجة إلى حل الركيزة ABTS (انظر الخطوة 7.27).
24. أضف 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للسيترات إلى كل بئر مستخدم في لوحة الترحيل ذات 24 بئرا، وكل معيار، والفراغ.
25. نقل 100 ميكرولتر من كل عينة بشكل جيد في تكرار إلى لوحة 96 جيدا. ملاحظة: من المهم جدا خلط المحتويات بدقة في كل عينة قبل الانتقال إلى لوحة 96 بئرا. Pipette الحل صعودا وهبوطا على الأقل خمس مرات قبل نقل.
26. نقل 100 ميكرولتر من كل معيار وفارغة إلى لوحة 96 جيدا بعد خلط (فارغة في مكررة).
27. أضف 50 ميكرولتر من بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 30٪ إلى محلول ودوامة ABTS.
28. أضف 100 ميكرولتر من محلول ركيزة ABTS إلى كل عينة على لوحة 96 بئرا.
29. السماح لوحة لتطوير لمدة 5-10 دقيقة في الظلام. ملاحظة: يجب أن يتطور اللون الأخضر في آبار معينة ، مع الارتباط بعدد العدلات الموجودة في كل بئر.
30. قراءة في الطول الموجي من 405 نانومتر باستخدام قارئ microplate.
31. حساب عدد العدلات التي هاجرت عبر الطبقة الظهارية باستخدام المعايير حيث يوجد ارتباط خطي إيجابي بين الأعداد المعروفة من العدلات المعدة كمقاييس وكمية نشاط البيروكسيداز كما تقاس بالكثافة البصرية عند 405 نانومتر (انظر الشكلين 2 و 3 للحصول على بيانات تمثيلية). ملاحظة: هذه الطريقة في القياس الكمي العدلي تستفيد من كمية كبيرة من نشاط البيروكسيداز التي تظهرها العدلات بسبب تعبير myeloperoxidase. ويمكن النظر في اتباع نهج بديلة لقياس العدلات كميا، مثل الطرق التي تنطوي على تسمية العدلات قبل الحمل ذات النشاط الإشعاعي أو مركبات الفلورسينس.

وقد أظهرت العديد من الدراسات أن الطبقات الظهارية المصابة بمسببات الأمراض تسهل الهجرة عبر الظهارية العدلية3,8,19,24-28,31,32. يحدث هذا عن طريق تحريض ممرض محدد لتدرج كيموتاتاتيك مشتق من الخلايا الظهارية3,23. على سبيل المثال، المسببة للأمراض P. aeruginosa التفاعل مع السطح apical من خلايا الظهارية الرئة يسبب عددا كبيرا من العدلات للهجرة عبر الطبقة الظهارية18،22،25،26،33،34. يمكن التلاعب بنظام الفحص هذا ذي الصلة سريريا بطرق عديدة للكشف عن مسببات الأمراض الرئيسية واستضافة المساهمين الجزيئيين عند إقرانه بضوابط مناسبة.

العدلات المضافة إلى طبقات الخلايا الظهارية المستقطبة التي لم يتم الإصابة بها تفشل في الهجرة عبر بأعداد كبيرة. ومع ذلك ، فإن تطبيق تدرج مثبط للعلاج الكيميائي عبر طبقة ظهارية غير مصابة سيدفع أعدادا كبيرة من العدلات عبرها. من المهم إدراج كل من هذه الضوابط السلبية والإيجابية على التوالي داخل كل مقايسة عند التحقيق في هجرة العدلات عبر الطبقات الظهارية المصابة بمسببات الأمراض. يحدد التحكم السلبي عدد الخلفية من العدلات التي تعبر الطبقة الظهارية في غياب الإشارة. يجب أن يكون هذا العدد منخفضا جدا عندما تكون الخلايا الظهارية المستزرعة قد أنشأت حاجزا وظيفيا. الهجرة الخلفية العالية تعقد تفسير النتائج التي تحققت مع الظهارة المصابة بمسببات الأمراض. تتضمن السيطرة الإيجابية تطبيق تدرج من الجاذب الكيميائي العدلي مثل fMLP عبر الطبقة الظهارية وتعمل على تأكيد أن العدلات المعزولة وظيفية. وعلاوة على ذلك، في حالة معالجة الطبقات الظهارية مسبقا بكواشف معينة لتقييم آثارها على الهجرة عبر الظهارية الناجمة عن مسببات الأمراض، يعمل تدرج fMLP على التحكم في أي آثار قد يكون للكواشف على قدرة العدلات على التنقل في الطبقة الظهارية بغض النظر عن الآثار الوسيطة المسببة للأمراض. تتضمن الرقابة الإضافية المستخدمة في كثير من الأحيان داخل نظام الفحص هذا عدوى الطبقات الظهارية بالبكتيريا غير المسببة للأمراض بالتوازي مع مسببات الأمراض. ويمكن استغلال هذه السيطرة للتمييز بين الاستجابات الظهارية ذات الصلة بعد التفاعل مع البكتيريا وكذلك المساعدة في تحديد العوامل المسببة للأمراض اللازمة لتحفيز الهجرة عبر الظهارية العدلية.

ويمكن تقييم الهجرة عبر الظهارية العدلية نوعيا وكميا. عند الانتهاء من حضانة 2 ساعة بعد إضافة العدلات إلى سطح البازلت، تتم إزالة transwells ويمكن النظر إلى العدلات التي هاجرت بشكل كامل عبر الطبقة الظهارية إلى غرفة apical في البئر السفلي من لوحة الهجرة 24 جيدا. يتم عرض صورة تمثيلية لكل حالة في الشكل 1، تصور باستخدام المجهر الخفيف المقلوب. لوحظ عدد قليل جدا من العدلات للهجرة عبر طبقة الظهارية غير المصابة دون التدرج الكيميائي المفروض (HBSS +) وتمثل مستويات الخلفية في المقايسة(الشكل 1A). وعلى النقيض من ذلك، كانت وفرة من العدلات المتحولة واضحة عند توفير تدرج fMLP(الشكل 1B). أدت عدوى الظهارة مع غير باعث E. coli MC1000 في عدد قليل من العدلات المتحولة مرئية، في حين أن العديد من العدلات المتحولة جنسيا كانت ملحوظة عندما أصيبت الطبقات الظهارية مع الرئة المسببة للأمراض P. aeruginosa (PAO1) (الشكلين 1C و 1D).

يتم قياس العدلات التي هاجرت في التجربة من خلال قياس نشاطها myeloperoxidase. ويستخدم منحنى قياسي لتمكين تقدير عدد العدلات المتحولة جنسيا. يرتبط عدد العدلات بشكل إيجابي مع كمية نشاط البيروكسيداز التي تقاس بعد تحلل العدلات مع القيم التي تظهر علاقة خطية في نطاق أرقام العدلات المختارة للمنحنى القياسي (2 × 103-1 × 106 خلايا / مل) (الشكل 2). يهاجر عدد كبير من العدلات عبر الطبقات الظهارية استجابة لتدرج fMLP المقدم أو استجابة لطبقة ظهارية مصابة ب PAO1 (الشكل 3). عدد العدلات التي تهاجر في غياب المحفزات (HBSS +) أو بعد العدوى الظهارية apical مع غير باعث على الحيوانات E. القولونية MC1000 هو أقل من الحد الأقصى للكشف عن المقايسة (الشكل 3). تمثل البيانات المعروضة في الشكل 3 متوسط عدد العدلات المتحولة مع قضبان الخطأ التي تمثل الانحراف المعياري لثلاث آبار / حالة مستقلة. البيانات الكمية المبينة في الشكل 3 تتفق مع صور الآبار التمثيلية المعروضة في الشكل 1.

الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام 1 صورة العدلات بعد الهجرة عبر الظهارية. تم عرض الصور بمجهر خفيف مقلوب عند تكبير 10X للخ بئر القاع (غرفة apical) من لوحة الهجرة ذات 24 بئرا بعد فترة حضانة ساعتين مع إضافة العدلات إلى البئر العلوي (غرفة البازلتات). (أ) التحكم السلبي HBSS +. (ب) فرض رقابة إيجابية fMLP التدرج الكيميائي. (ج) طبقات الخلايا الظهارية المصابة غير باعتلال E. القولونية K12 (MC1000). (د) طبقات الخلايا الظهارية المصابة المسببة للأمراض P. aeruginosa (PAO1). انقر هنا لعرض صورة أكبر.

الشكل 2 - الأرقام 2- الأرقام التي تم تعرضت العدلات بتركيز يبدأ من 1 × 106 لتسعة تمييعات 2 أضعاف. بعد التحلل، تم تحديد كمية نشاط البيروكسيداز ورسم عدد العدلات على المحور x مع نشاط البيروكسيداز على المحور ص. يمكن استخدام المعادلة المصورة لتحديد عدد العدلات الموجودة في كل بئر بعد الهجرة على أساس كمية نشاط البيروكسيداز التي تقاس في كل بئر. انقر هنا لعرض صورة أكبر.

الشكل 3 - الأرقام 3- الأرقام التي يمكن أن القياس الكمي للنيوتروفيليا المتحولة. يتم قياس عدد العدلات المتحولة كميا من خلال نشاط الميالوبيروكسيداز النسبي إلى منحنى قياسي خطي للأعداد المعروفة من العدلات. لوحظت أعداد كبيرة من العدلات المتحولة جنسيا بعد عدوى الخلايا الظهارية مع P. aeruginosa المسببة للأمراض (PAO1) أو إنشاء تدرج apical إلى basolateral من fMLP الجذاب الكيميائي العدلي. لوحظت أعداد لا يمكن اكتشافها من العدلات المتحولة بعد عدوى الخلايا الظهارية مع العلاج غير المرضي E. coli K12 (MC1000) أو حاجز التحكم السلبي فقط (HBSS+). انقر هنا لعرض صورة أكبر.

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.