في المختبر المقايسة المشتركة لتقييم الهجرة العدلية المستحثة المسببة للأمراض عبر الظهارية

ملخص

الهجرة عبر الظهارية العدلات استجابة للعدوى البكتيرية المخاطية يساهم في الإصابة الظهارية والأمراض السريرية. وقد تم تطوير نموذج في المختبر يجمع بين مسببات الأمراض، والعدلات البشرية، وطبقات الخلايا الظهارية البشرية المستقطبة التي تزرع على مرشحات عبرويل لتسهيل التحقيقات نحو كشف الآليات الجزيئية التي تنسق هذه الظاهرة.

الملخص

الأسطح المخاطية بمثابة حواجز واقية ضد الكائنات المسببة للأمراض. يتم تنشيط الاستجابات المناعية الفطرية عند استشعار مسببات الأمراض مما يؤدي إلى تسلل الأنسجة مع الخلايا الالتهابية المهاجرة ، في المقام الأول العدلات. هذه العملية لديها القدرة على أن تكون مدمرة للأنسجة إذا كانت مفرطة أو عقدت في حالة لم تحل.  ويمكن استخدام النماذج المستنبطة في المختبر لدراسة الآليات الجزيئية الفريدة المشاركة في الهجرة العدلية الناجمة عن مسببات الأمراض عبر الظهارية. يوفر هذا النوع من النماذج براعة في التصميم التجريبي مع فرصة للتلاعب الخاضع للرقابة من مسببات الأمراض، حاجز الظهارية، أو العدلات. العدوى المسببة للأمراض من السطح apical من monolayers الظهارية المستقطبة نمت على مرشحات عبرويل نفاذية يحرض القاعدية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية لهجرة apical عبر الظهارية من العدلات المطبقة على السطح القاعدي. يوضح النموذج المختبري الموصوف هنا الخطوات المتعددة اللازمة لإثبات هجرة العدلات عبر طبقة أحادية ظهارية رئوية مستقطبة أصيبت بمسببات الأمراض P. aeruginosa (PAO1). يوصف بذر وزراعة الحيوانات المتحولة التي يمكن اختراقها بخلايا ظهارية رئوية مشتقة من الإنسان ، إلى جانب عزل العدلات من الدم البشري الكامل وزراعة PAO1 وK12 E. coli غير المسببة للأمراض (MC1000).  وتظهر عملية الهجرة والتحليل الكمي للنيوتروفيل المهاجر بنجاح والتي تمت تعبئتها استجابة للعدوى المسببة للأمراض ببيانات تمثيلية، بما في ذلك الضوابط الإيجابية والسلبية. يمكن معالجة هذا النظام النموذجي في المختبر وتطبيقه على الأسطح المخاطية الأخرى. يمكن أن تكون الاستجابات الالتهابية التي تنطوي على تسلل العدلات المفرط مدمرة للأنسجة المضيفة ويمكن أن تحدث في غياب العدوى المسببة للأمراض. إن الفهم الأفضل للآليات الجزيئية التي تعزز الهجرة عبر الظهارية العدلية من خلال التلاعب التجريبي بنظام الفحص المشترك في المختبر الموصوف هنا لديه إمكانات كبيرة لتحديد أهداف علاجية جديدة لمجموعة من الأمراض المعدية المخاطية وكذلك الالتهابات.

المقدمة

السطوح المخاطية بمثابة حواجز مادية ومناعية توفر الحماية من التهديدات الخارجية المنتشرة في البيئة^1،2. يمكن اختراق هذا الحاجز الظهاري الواقي عندما تغزو الكائنات المسببة للأمراض^2. في حالة الممرض البكتيري ، غالبا ما يحرض هذا اللقاء على عملية التهابية عن طريق تنشيط الجهاز المناعي الفطري مما يؤدي إلى تعبئة سريعة للخلايا الحبيبية المستجيبة الأولى المعروفة باسم العدلات^2-4. يتم إنتاج عوامل العلاج الكيميائي التي تسهل تجنيد العدلات جزئيا من قبل الخلايا الظهارية المخاطية التي تسعى لتخليص المضيف من الممرض المخالف^2-4. يمكن أن يسبب تسلل العدلات المفرط أو غير المحسوم للسطح الظهاري المخاطي أمراضا كبيرة^1،5. هذا هو نتيجة لتلف الأنسج....

البروتوكول

يجب تنفيذ الخطوات (1-3) في بيئة معقمة تحت غطاء تدفق صفح.

1. كولاجين طلاء Transwells

1. جعل محلول الكولاجين 30 ميكروغرام / مل. تمييع 3 ملغ / مل مخزون الكولاجين 1:100 في الإيثانول 60٪ التي تم تمريرها من خلال وحدة تصفية 0.2 ميكرومتر.
2. دوامة المخفف 30 ميكروغرام / مل الحل. ملاحظة: ليس من الضروري دوامة محلول مخزون الكولاجين 3 ملغم / مل ، لأن هذا الحل لزج للغاية ويمكن إدخال فقاعات الهواء ، مما قد يقلل من الدقة عند الأنابيب.
3. إزالة 0.33 سم² transwells منطقة النمو مع حجم المسام من 3 ميكرومتر من التعبئة والتغليف خارج ووضع لوحة 24 جيدا تحتوي على 12 transwells رأسا على عقب داخل غطاء محرك السيارة.
4. ....

النتائج

وقد أظهرت العديد من الدراسات أن الطبقات الظهارية المصابة بمسببات الأمراض تسهل الهجرة عبر الظهارية العدلية^{3,8,19,24-28,31,32}. يحدث هذا عن طريق تحريض ممرض محدد لتدرج كيموتاتاتيك مشتق من الخلايا الظهارية^3,23. على سبيل المثال، المسببة للأمراض P. aeruginosa التفاعل مع السطح apical من خلايا الظهارية الرئة يسبب عددا كبيرا من العدلات للهجرة عبر الطبقة الظهارية^{18،22،25،26،33،34}. يمكن التلاعب بنظام الفحص هذا ذي الصلة سريريا بطرق عديدة للكشف عن مسببات الأمراض الرئيسية واستضافة المساهمين الج.......

المناقشة

هجرة العدلات عبر الأسطح الظهارية المخاطية هي سمة شائعة في أمراض الأمراض بعد العدوى بمسببات الأمراض البكتيرية^3. تقدم المنهجية الموصوفة هنا نهجا سريعا ومباشرا لعزل هذا الحدث المنفصل تجريبيا باستخدام خلية بشرية مشتقة من نظام الفحص المشترك في المختبر الذي يقدم نماذج لميزة العملية الالتهابية الناجمة عن العدوى البكتيرية. وقد وضعت هذا النظام أصلا باستخدام الخلايا الظهارية المعوية المستقطبة المصابة بمسببات الأمراض المعوية بما في ذلك السالمونيلا تيفيموريوم, شيغيلا flexneri, ومختلف المسببة للأ.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
خلايا NCl-H292	ATCC	CRL-1848
RPMI-1640 متوسط	ATCC	30-2001
Pseudomonas aeruginosa< em> PAO1	ATCC	# 47085
الإشريكية القولونية< / em> MC1000	ATCC	# 39531
D-PBS (1x) سائل	Invitrogen	14190-144	بدون الكالسيوم والمغنيسيوم
مصل الأبقار الجنيني المعطل بالحرارة	Invitrogen	10082-147	يضاف 10٪ إلى وسط المزرعة
البنسلين الستربتومايسين	Invitrogen	15140-122	100x: 10,000 وحدة من البنسلين و 10,000 & micro ؛ ز من الستربتومايسين لكل مل.
يتم تخزين Trypsin-EDTA (0.05٪)	Invitrogen	25300-062	50 مل من كميات مجمدة في -20 درجة مئوية ؛ يمكن تخزين Aliquot قيد الاستخدام في 4 & ordm; ج على المدى القصير.
محلول الملح المتوازن من هانك - HBSS (-)	Invitrogen	14175-079	معقم ، بدون كالسيوم ومغنيسيوم
محلول تريبان الأزرق	Invitrogen	15250-061.	المخزون = 0.4٪
الكولاجين ، ذيل الفئران	Invitrogen	A10483-01	يمكن أيضا عزله في المختبر مباشرة من ذيول الفئران باستخدام البروتوكولات القياسية حمض
الستريك	Sigma-Aldrich	C1909-500G	مكون من 1 متر من المخزن المؤقت للسترات ومحلول سكر العنب الحمضي (ACD)
سترات الصوديوم	سيجما-ألدريتش	S4641-500G	مكون من 1 متر من السترات عازلة
سكر العنب اللامائي	Sigma-Aldrich	D8066-250G	مكون محلول سكر العنب الحمضي (ACD)
كلوريد الأمونيوم	سيجما-ألدريتش	213330-500G	مكون محلول تحلل خلايا الدم الحمراء (RBC)
بيكربونات الصوديوم	Sigma-Aldrich	S6014-500G	مكون محلول تحلل خلايا الدم الحمراء (RBC)
EDTA	Sigma-Aldrich	ED-100G	مكون المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء (RBC
HBSS (+)	Sigma-Aldrich	H1387-10L	المكون الرئيسي ل HBSS +
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-500G	مكون HBSS +
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2-25ML	اتبع تعليمات البائع لطلاء أطراف الماصة الزجاجية
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T-9284
2،2'-Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) ملح ثنائي الأمونيوم (ABTS)	Sigma-Aldrich	A9941-50TAB	المكون الرئيسي لمحلول الركيزة ABTS
30٪ محلول بيروكسيد الهيدروجين	Sigma-Aldrich	H1009-100ML	مكون محلول الركيزة ABTS
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP أو fMLF)	Sigma-Aldrich	F-3506	يجب تحضير محلول مخزون بحجم 10 ملي مولار في DMSO وتخزين الحصص عند -20 درجة مئوية.
الجيلاتين من النوع B	فيشر Scientific	M-12026
Pseudomonas عزل agar   ؛	فيشر العلمي	DF0927-17-1	اتبع الشركة المصنعة s تعليمات لصنع لوحات PIA
Ficoll-Paque PLUS	فيشر Scientific	45-001-749	اختياري ، يمكن أن يحسن نقاء العدلات
24 بئر لوحة الهجرة	Corning Incorporated	# 3524
24 بئر لوحة غسيل	Falcon	35-1147	يمكن إعادة استخدامها إذا تم نقعها في 70٪ من الإيثانول وغسلها جيدا قبل إعادة استخدام
لوحة 96 بئر	Fisher Scientific	# 12565501
Transwell Permeable Supports   ؛	كورنينج إنكوربوريتد	# 3415	بولي كربونات. قطر الدائرة: 6.5 مم ؛ منطقة النمو: 0.33 سم < سوب > 2 < / سوب > ؛ نمط الطبق: طبق 24 بئر ؛ حجم المسام: 3.0 & micro; م
طبق بتري	فالكون	35-1013	كل طبق بتري يحمل 24 مقلوب 0.33 سم < سوب > 2 < / سوب> Transwells.
500 مل 0.2 مو ؛ م مرشح / قارورة	فيشر Scientific	09-740-25A	لتعقيم محلول سكر العنب الحمضي سيترات (ACD)
5-3 / 4 في زجاج ماصة باستور	فيشر Scientific	13-678-20A	أطراف معطف مع Sigmacote قبل الاستخدام
Hemostat	Fisher Scientific	13-812-14	مقلوب منحني ومسنن
Invertoskop	Zeiss	# 342222
Versa-Max الأجهزة الجزيئية لقارئ الصفيحة		الدقيقة # 432789

)مسحوق مجهر