مقالة منهجية

أسلوب الثقافة شريحة لوبعد تطور الجراثيم الأسنان في يزدرع الثقافة

DOI:

10.3791/50824

⸱

نوفمبر 13, 2013

 , 
1Department of Craniofacial Development and Stem Cell Biology, and Department of Orthodontics, Dental Institute, Guy's Hospital, UK, King's College London, 2Department of Pediatric Dentistry and Orthodontics, College of Dentistry, King Saud University, Kingdom of Saudi Arabia

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن هنا بالتفصيل طريقة للجراثيم الأسنان الثقافة في شرائح الفك السفلي باستخدام المروحية الأنسجة. هذا الأسلوب يسمح بالوصول فريدة من نوعها في الأسنان خلال التنمية، وتوفير فرصة ممتازة للتلاعب والنسب تتبع، لا تتوفر باستخدام أساليب الثقافة التقليدية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الثقافة ازدراع يسمح بالتالي التلاعب في تطوير الأجهزة في نقاط زمنية محددة وغير وسيلة هامة للعالم الأحياء التنموية. بالنسبة للعديد من الأجهزة فإنه من الصعب الوصول إلى الأنسجة النامية للسماح برصد خلال فيفو السابقين الثقافة. يسمح أسلوب ثقافة شريحة الوصول إلى الأنسجة بحيث الحركات التخلق يمكن اتباعها ويمكن أن تستهدف السكان خلية معينة للتلاعب أو تتبع النسب.

في هذه الورقة نحن تصف طريقة للثقافة شريحة التي كانت ناجحة جدا للثقافة الجراثيم الأسنان في مجموعة من الأنواع. يوفر أسلوب الوصول ممتازة لجراثيم الأسنان، والتي تنمي بمعدل مماثلة لتلك التي لوحظت في الجسم الحي، وتحيط بها الأنسجة الفك الأخرى. وهذا يسمح التفاعلات الأنسجة بين الأسنان والأنسجة المحيطة بها ليتم رصدها. على الرغم من أن هذه الورقة تركز على الجراثيم الأسنان، نفس البروتوكول يمكن تطبيقها لمتابعة تطوير عددمن الأجهزة الأخرى، مثل الغدد اللعابية، والغضروف ميكل والغدد الأنفية، واللسان، والأذن.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لعدد من التجارب من المهم أن تكون قادرة على زراعة الأنسجة فيفو السابقين لمتابعة التنمية. ثقافة تطوير الأنسجة يوفر الوصول في فترات محددة من التنمية ويتيح التلاعب في الجينات من خلال إضافة عوامل في مستنبت، أو على حبات تحميلها، واستخدام ترنسفكأيشن و electroporation 1. بالنسبة للعديد من التجارب من المهم أن تكون قادرا على تصور الأنسجة لأنها تنمو، على سبيل المثال، لمتابعة مصير الخلايا النسب وصفت بأنها الأنسجة يخضع التشكل. هذا يمكن أن يكون مشكلة خاصة بالنسبة للأنسجة التي تنمي في أعماق الجنين، والتي ليست واضحة عندما كتلة من الأنسجة من الجنين هو مثقف. الأسنان هي أمثلة جيدة على ذلك، لأنها تضع ضمن عملية الأنف الفك السفلي، الفك العلوي والأمامي. عندما يتم زرعها في الفك السفلي كله الهياكل السطحية من الأسنان يمكن أن ينظر إليها ولكن التغييرات في مورفولوجية لا يمكن تحليلها بعد باجتزاء الأنسجة الثابتة 2. تكيفنا حية شريحة التقنية الثقافة مما يسمح لنا لمتابعة تطوير جرثومة الأسنان وتوفير سبل الوصول إلى أجزاء مختلفة من الأسنان خلال التنمية. ثقافات تقنية شرائح الجرثومية الأسنان في واجهة الغاز السائل، وذلك باستخدام طريقة تراويل تعديل 3. وكانت هذه الثقافات شريحة مفيدة جدا في التشكل التالية مباشرة من الأسنان، والسماح تتبع نسب مكونات متميزة، مثل عقدة المينا والحليمة السنية وبصيلات 1،4-7. تقنية لا يقتصر على أجنة الفئران وتمت بنجاح استخدمت لثقافة شرائح حية من الخنزير والثعبان الأسنان 8،9 الأنسجة. بالإضافة إلى الاستفادة من القدرة على تصور نمو الأسنان، لديه طريقة شريحة أيضا ميزة أن شرائح رقيقة من الأنسجة وزيادة فرص الحصول على المواد الغذائية من المتوسط ​​والهواء من الحاضنة. هذه النتائج في تحسين نمو جراثيم الأسنان، والتي تتطابق التنمية في الجسم الحي، وتظهر invasأيون الخلايا البطانية في الحليمة 7. في المقابل، جراثيم الأسنان في الفك السفلي كله الثقافات تطوير أبطأ من تلك الموجودة في الجسم الحي ومركز للثقافة في كثير من الأحيان نخرية في الثقافات على المدى الطويل. في ثقافة شريحة والأسنان يتطور داخل شريحة من الفك، وتفاعله مع وضع العظام والأنسجة الأخرى المحيطة يمكن رصدها. في المنهج في آن والمفروم الأنسجة مباشرة بعد تشريح مع عدم وجود الحاجة إلى تضمين في المتوسط ​​10،11 الدعم، وهناك حاجة لأي نظام لإرفاق الأنسجة لتقطيع كتلة. هذه الطريقة بالتالي موسع وسريع، مما يتيح العديد من الفك السفلي إلى أن مقطوع في جلسة واحدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. نصب

  1. شحذ أدوات تشريح (باستخدام الحجر شحذ مشحم مع الزيوت المعدنية) وتعقيم قبل استخدامها للثقافة الجهاز باستخدام رذاذ الايثانول 70٪ والتعقيم الجاف للحرارة. شحذ الإبر تشريح باستخدام التحليل الكهربائي في 2 M هيدروكسيد الصوديوم باستخدام 12 فولت العرض.
  2. تحضير مستنبت تستخدم لتشريح والثقافة من أجهزة الجنينية، التي تتألف من التعديل النسر متوسطة F12 متقدمة Dulbecco و(F12 DMEM) تستكمل مع 1٪ و 1٪ GlutaMAX البنسلين الستربتوميسين.

2. تشريح الجنين

  1. اعدام على توقيت تزاوج الإناث الحوامل باستخدام طريقة جدول واحد كما وافقت عليها وزارة الداخلية أو هيئة إدارية أخرى. تشريح بعيدا الجلد حول أسفل البطن، وخفض فتح البطن باستخدام مقص. تحديد موقع قرني الرحم، والتي تربط معا فى انخفاض خط الوسط.
  2. تشريح خارج الرحم ومكان في أنبوب مملوء المتوسطة على الجليد. عرجن على الجليد، والأنسجة يمكن أن تترك لعدة ساعات.
  3. إزالة الرحم ووضعه في طبق بتري في المتوسط ​​تحت المجهر. حيث يجب أن يتم تنفيذ تشريح الجنين ممكن في غطاء تدفق الصفحي للحد من التلوث.
  4. تشريح الأجنة من الرحم وتحريرهم من أنسجتها خارج الجنين.
  5. قطع رأس الأجنة باستخدام إبرة التنغستن ونقل رؤساء في طبق جديدة من المتوسط.
  6. عزل الفك السفلي من رؤساء عن طريق وضع إبرة في تجويف الفم وقطع طريق نحو الجزء الخلفي من الرأس (أرقام 1A و 1B). الفك السفلي المعزولة يمكن تخزينها مؤقتا في المتوسطة على الجليد في انتظار تقطيع.
  7. لشرائح الفك السفلي كله مراحل E11.5-E15.5 هي مثالية للثقافة الجرثومية الأسنان. بعد E15.5 العظام النامية في الفك السفلي من الصعب للغاية بالنسبة لتقطيع. لا يزال من الممكن جعل شرائح الأسنان ولكن لا بد أولا من إزالة العظام (مضرس وتشكيل العظم السنخي) من خلالتشريح قبل تقطيع 9. ازالة العظام بعناية باستخدام الإبر التنغستن والملقط.

3. الجنين التقطيع

  1. تحضير شرائح الأنسجة الفك السفلي باستخدام معيار المروحية الأنسجة الجدول (الشكل 1C). استخدام شفرة جديدة بعد ما يقرب من 200 الفك السفلي، والتأكد من أنها تقع مطاردة مع القرص تصاعد عندما يسقط.
  2. تنظيف القرص تصاعد وشفرة مع الايثانول 70٪ قبل الاستخدام. يجب توخي الحذر عند استخدام الجهاز، وشفرة حادة جدا.
  3. تعيين المروحية على مسافة القطع بين 200-400 ميكرون وفقا لعمر من العينة، واعتمادا على ما إذا كان يتعين على جرثومة الأسنان كلها. تعيين قوة شفرة على الحد الأقصى.
  4. نقل الفك السفلي إلى قرص تركيب البلاستيك باستخدام ماصة أو ملقط. ترتيب الفك السفلي على صنع قرص من أن التوجه لا تزال واضحة. اللسان النامية يمكن استخدامها بوصفها معلما مفيدة لتحديد التوجه. لاستخدام الأضراس بالعربيةrontal / التوجه عرضية (انظر الطائرة من تقطيع في الشكل 1B)، في حين أن استخدام القواطع شريحة السهمي من خلال الفك السفلي لتعكس التوجه مختلفة من هذه الأسنان لأنها تنمو (انظر الطائرة من تقطيع في الشكل 2A).
  5. إزالة الزائدة المتوسطة من مختلف أنحاء الأنسجة باستخدام ورق الترشيح من أجل لتجف قليلا من الفك السفلي على القرص في تصاعد مستمر.
  6. مباشرة بعد التجفيف، ضع القرص على التعميم الجدول الفولاذ المقاوم للصدأ من المروحية. تحويل الجهاز على وبداية الصحافة. تقطع الجدول تلقائيا من اليسار إلى اليمين بينما في نفس الوقت يتم رفع الذراع تقطيع تحمل شفرة وانخفض بسرعة تصل إلى 200 السكتات الدماغية / دقيقة.
  7. إيقاف تشغيل الجهاز مرة واحدة الأنسجة وقد شرائح تماما. تأكد من الذراع شفرة هو في موقف أثار وإزالة القرص. لا تضع أصابعك تحت الذراع شفرة أو ترك الجهاز غير المراقب عند تقطيع.
  8. أخذ قرص تركيب وإضافة المتوسطة ر فوراس شرائح على القرص من أجل منع جفاف المفرطة. طرد بعناية الأنسجة شرائح من الجزء السفلي من القرص باستخدام إبرة التنغستن ثم ماصة في طبق بتري صغيرة من المتوسطة (الشكل 2A).
  9. فصل شرائح باستخدام إبرة ثم حدد شرائح الأنسجة التي تحتوي على الأنسجة من الاهتمام في ظل stereomicroscope (أرقام 1D، 1E، و2B). وضع شرائح مختارة في أطباق ثقافة جديدة مع المتوسط.

4. شريحة الثقافة

  1. إعداد أطباق الثقافة الجهاز المركزي مستعد جيدا للثقافة من خلال إضافة حوالي 2 مل من الماء تعقيمها إلى البئر الخارجي لمنع الجفاف، وعن طريق وضع شبكة معدنية عبر مركز الطبق (أرقام 3A 3B و).
  2. إعداد شبكات معدنية بقطع الشرائط حوالي 4 سم × 1.5 سم من ورقة من شبكة الفولاذ المقاوم للصدأ. استخدام لكمة ثقب لجعل حفرة في وسط وثنيالجانبين لخلق نهاية متداخلة. الشبكة يجب أن تناسب شقة في وسط البئر، والكذب موازية لقاع الطبق (أرقام 3A 3B و). الأوتوكلاف شبكات لتعقيم قبل الاستخدام.
  3. قطع قطعة من البولي ايثلين تيريفثاليت شفافة (PET) الغشاء (حجم المسام 0.4 ميكرون) كبيرة بما يكفي لتغطية ثقب في الشبكة. وضع غشاء قطع في طبق مع شريحة مختارة.
  4. وضع شريحة على الجزء العلوي من الغشاء ثم رفع بعناية الغشاء من المتوسط، مع شريحة بالارض في المركز.
  5. وضع مرشح على الشبكة خلال ثقب دائري في الوسط، وإضافة ما يقرب من 1 مل من مستنبت إلى البئر، وتصل إلى مستوى الغشاء.
  6. لإضافة التلاعب البروتينات أو مثبطات جزيء صغير إلى متوسط ​​(على سبيل المثال 8).
  7. تصوير شريحة لسجل من التشكل في اليوم 0 من الثقافة.
  8. ضع الأطباق في جو مرطب من 5٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية في حاضنة.
  9. تصوير الثقافات على فترات منتظمة لفي المتوسط ​​7 أيام. تغيير ثقافة المتوسط ​​كل 48-72 ساعة. للتصوير الفوتوغرافي عرض شرائح مع مصدر الضوء من تحت (أرقام 2C-E).

5. النسب للبحث عن المفقودين

إذا كان مطلوبا تتبع النسب، والأصباغ محبة للدهون مثل الجاذبة أو ديو يمكن حقنها في جرثومة الأسنان قبل الخطوة 4، ثقافة شريحة.

  1. سحب الإبر الزجاج الشعرية باستخدام مجتذب الإبرة.
  2. كسر رأس الإبرة باستخدام ملقط ووضع تلميح إلى أسفل داخل محلول الصبغة. يترك لبضع دقائق في حين أن صبغ يملأ غيض من قبل عمل شعري.
  3. وضع إبرة شغل في حامل ونعلق عبر أنابيب إلى حاقن أو الفم الشافطة.
  4. ضع رأس الإبرة في مستنبت لمس منطقة شريحة المقرر أن المسمى. تطبيق ضغط الهواء لتهجير كمية صغيرة من الصبغة من إبرةد على الأنسجة.
  5. إزالة الإبرة وتحقق لوصفها تحت مضان.
  6. يمكن نقل شرائح وصفت بنجاح إلى الفلاتر ومثقف كما هو موضح في الخطوة 4.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من أجل متابعة حركة أول جريب الأسنان المولي، تم اتخاذ 250 ميكرون شرائح الجبهي من خلال الفك السفلي باستخدام الطريقة الموصوفة أعلاه. الجراب السنى هو طبقة من اللحمة المتوسطة الذي يحيط ظهارة المينا الخارجي (OEE) من الأسنان النامية، وسبق أن أظهرت أن يشارك في تشكيل أنسجة دواعم 6. تم تشريح الفك السفلي في E14.5، المرحلة قبعة التنمية الأسنان. في شريحة كانت الخطوط العريضة للظهارة الأسنان واضحة، ويمكن التعرف على اللحمة المتوسطة الأسنان التكثيف باعتباره حلقة قتامة حول (4A ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا الأسلوب من الثقافة الأسنان لديه ميزة أن الوصول إلى الجرثومية الأسنان ممتازة، مما يتيح تتبع النسب دقيقة والتنسيب من الخرز داخل ظهارة أو اللحمة المتوسطة. وبالتالي، يمكن تعريف المناطق من الأسنان النامية الجرثومية أن تستهدف على وجه التحديد. خلال الثقافة التشكل المتغيرة للجرثومة الأسنان يمكن اتباعها، وتأثير التلاعب المقررة بسرعة.

الأسلوب، ومع ذلك، لا يصلح إلا للشباب الجراثيم الأسنان قبل تشكيل كبير من الأنسجة الصلب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويتم تمويل سارة A. Alfaqeeh حسب نوع سعود كلية طب الأسنان، وزارة التعليم العالي، المملكة العربية السعودية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

تم تخفيف وضع العلامات على الخلايا Goodfellow

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الإيثانولVWR101077Y100٪ الإيثانول في H2< / sub>O المقطر إلى 70٪.
DMEM F12Gibco12634-010النسر المعدل المتقدم Dulbecco متوسط F12
GlutaMAXGibco35050-061
البنسلين ستربتومايسينSigmaP0781
DiI (المجسات الجزيئية)VybrantV-22885محلول
InvitrogenCell Tracker CM-DiI، C-7000
DiO ( المجسات الجزيئية)VybrantV22886
Geminator 500ThomasThomas No. 3885A20التعقيم بالحرارة الجافة
ماكلوين مروحية الأنسجةTed Pella، Inc.10180
طبق ثقافة الأعضاء القياسي للطاولة (طبق ثقافة الأعضاء في البئر المركزي)أغشية353037الصقر
(إدراج ثقافة الخلية ، 0.4 & mu ؛ حجم المسام)BD Falcon353090PET غشاء محفور بالمسار ، شبكات معدنية بتنسيق 6 آبار
(الفولاذ المقاوم للصدأ - AISI 304 - شبكة)GoodfellowFE228710(Fe / Cr18 / Ni10) AutoFlow
Direct Heat CO2< / sub> حاضنةNuaireNU-5500
Picospritzer IIIIntracel Ltd051-0500-900 0-100 رطل لكل بوصة مربعةبيكوسبريتزر أحادية القناة III
الشعيرات الدموية الزجاجية مع خيوط 1 ممWPITW100F-4
سلك التنغستن 0.1 ممسلك التنغستنW005138
0.38 ممGoodfellowW005155
أنابيب الشفاطSigmaA5177تستخدم لمتتبعات النسب شفط الفم

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rothova, M., Peterkova, R., Tucker, A. S. Fate map of the dental mesenchyme: dynamic development of the dental papilla and follicle. Developmental biology. 366, 244-254 (2012).
  2. Ferguson, C. A., et al. Activin is an essential early mesenchymal signal in tooth development that is required for patterning of the murine dentition. Genes & development. 12, 2636-2649 (1998).
  3. Trowell, O. A. The culture of mature organs in a synthetic medium. Experimental cell research. 16, 118-147 (1959).
  4. Matalova, E., Antonarakis, G. S., Sharpe, P. T., Tucker, A. S. Cell lineage of primary and secondary enamel knots. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 233, 754-759 (2005).
  5. Mitsiadis, T. A., Tucker, A. S., De Bari, C., Cobourne, M. T., Rice, D. P. A regulatory relationship between Tbx1 and FGF signaling during tooth morphogenesis and ameloblast lineage determination. Developmental biology. 320, 39-48 (2008).
  6. Diep, L., Matalova, E., Mitsiadis, T. A., Tucker, A. S. Contribution of the tooth bud mesenchyme to alveolar bone. Journal of experimental zoology. Part B, Molecular. 312B, 510-517 (2009).
  7. Rothova, M., Feng, J., Sharpe, P. T., Peterkova, R., Tucker, A. S. Contribution of mesoderm to the developing dental papilla. The International journal of developmental biology. 55, 59-64 (2011).
  8. Buchtova, M., et al. Initiation and patterning of the snake dentition are dependent on Sonic hedgehog signaling. Developmental biology. 319, 132-145 (2008).
  9. Buchtova, M., Stembirek, J., Glocova, K., Matalova, E., Tucker, A. S. Early regression of the dental lamina underlies the development of diphyodont dentitions. Journal of dental research. 91, 491-498 (2012).
  10. Cho, S. W., et al. The primary enamel knot determines the position of the first buccal cusp in developing mice molars. Differentiation; research in biological diversity. 75, 441-451 (2007).
  11. Sakano, M., et al. Cell dynamics in cervical loop epithelium during transition from crown to root: implications for Hertwig's epithelial root sheath formation. Journal of periodontal research. , (2012).
  12. Fisher, A. R. Morphological development in vitro of the whole and halved lower molar tooth germ of the mouse. Archives of oral biology. 16, 1481-1496 (1971).
  13. Coin, R., Schmitt, R., Lesot, H., Vonesch, J. L., Ruch, J. V. Regeneration of halved embryonic lower first mouse molars: correlation with the distribution pattern of non dividing IDE cells, the putative organizers of morphogenetic units, the cusps. The International journal of developmental biology. 44, 289-295 (2000).
  14. Kavanagh, K. D., Evans, A. R., Jernvall, J. Predicting evolutionary patterns of mammalian teeth from development. Nature. 449, 427-432 (2007).
  15. Munne, P. M., Tummers, M., Jarvinen, E., Thesleff, I., Jernvall, J. Tinkering with the inductive mesenchyme: Sostdc1 uncovers the role of dental mesenchyme in limiting tooth induction. Development. 136, 393-402 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة