ينتج عن إزالة الخلايا من الأعضاء بالكامل سقالات بيولوجية طبيعية يمكن استخدامها في الطب التجديدي. يتم تقديم وصف لنموذج رئيسيات غير بشري لتجديد الرئة حيث يتم نزع الخلايا من الرئتين بالكامل ثم زرعها بالخلايا الجذعية البالغة والخلايا البطانية في مفاعل حيوي يسهل الدورة الدموية الوعائية وتهوية الوسائط السائلة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
إزالة الخلايا من الرئة غير البشرية للرئيسيات وإعادة الخلايا باستخدام مفاعل حيوي متخصص للأعضاء الكبيرة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
لا يوجد عدد كاف من الرئتين المتاحة لتلبية احتياجات زراعة الأعضاء الحالية والمستقبلية. يعد تجديد الأنسجة الاصطناعية الحيوية بديلا جذابا لزراعة الأعضاء الكلاسيكية. تستخدم هذه التقنية المصفوفة البيولوجية الطبيعية خارج الخلية (ECM) للعضو كسقالة يمكن زرع الخلايا الذاتية أو الجذعية / السلفية عليها وزراعتها بطريقة تسهل تجديد الأنسجة الأصلية. يتم عزل ECM الطبيعي من خلال عملية تسمى إزالة الخلايا. يتم إزالة الخلايا عن طريق معالجة الأنسجة بسلسلة من المنظفات والأملاح والإنزيمات لتحقيق الإزالة الفعالة للمواد الخلوية مع ترك ECM سليمة. أظهرت الدراسات التي أجريت باستخدام إزالة الخلايا وإعادة الخلايا اللاحقة لرئتي القوارض نجاحا هامشيا في توليد أنسجة شبيهة بالرئة قادرة على تبادل الغازات في الجسم الحي. أثناء تقديم دليل أساسي على المفهوم ، لا يمكن ترجمة نماذج القوارض مباشرة إلى الاستخدام البشري. تقدم الرئيسيات غير البشرية (NHP) نموذجا أكثر ملاءمة للتحقيق في استخدام إنتاج الأعضاء الاصطناعية الحيوية للاستخدام السريري النهائي. < p class = "jove_content"> يتم تقديم بروتوكولات تحقيق إزالة الخلايا الكاملة للرئتين المكتسبة من NHP المكاك الريسوس. يمكن زرع الرئتين اللاخلويتين الناتجة بمجموعة متنوعة من الخلايا بما في ذلك الخلايا الجذعية الوسيطة والخلايا البطانية. تصف المخطوطة أيضا تطوير نظام مفاعل حيوي يمكن فيه زراعة رئتي المكاك المصنفة بالخلايا في ظل ظروف التمدد الميكانيكي والإجهاد الذي توفره تهوية الضغط السلبي بالإضافة إلى التروية النابضة من خلال الأوعية الدموية. من المعروف أن هذه القوى تمايز مباشر على طول السلالات الرئوية والبطانية ، على التوالي. يتم توفير النتائج التمثيلية لإزالة الخلايا وبذر الخلايا.
المقدمة
تعد الهندسة الحيوية للأنسجة والأعضاء إضافة جذابة لمجال الطب التجديدي. من المستحسن للغاية إنشاء أعضاء "مزروعة في المختبر" ومناسبة للزرع في المرضى لتحل محل وظائف الأعضاء المريضة من أجل تلبية الطلب الحالي والمستقبلي على احتياجات الزرع. تتمحور مبادئ هندسة الأنسجة حول بذر أنواع الخلايا المرغوبة ، أو أسلافها ، في سقالة تدعم شكل الأنسجة الهندسية مع توفير عوامل النمو المناسبة وظروف الثقافة اللازمة لتقليد العمليات التنموية أو التجديدية. بينما تم استخدام السقالات الاصطناعية لهندسة الأنسجة ، قد تكون المصفوفة الطبيعية خارج الخلية (ECM) أفضل مصدر للسقالات الخاصة بالأعضاء لهذا الغرض. إزالة الخلايا من العضو بالكامل هي عملية تسمح بإزالة الخلايا مع ترك الجوانب الكيميائية والهيكلية ل ECM الأصلي سليمة. يمكن استخدام سقالة المصفوفة اللاخلوية الناتجة كمنصة يمكن من خلالها زرع الخلايا المتجددة وزراعتها في المختبر1،2.
< p class = "jove_content" >تم تطوير العديد من نماذج القوارض لإزالة الخلايا الرئوية وإعادة الخلايا اللاحقة لدراسة جدوى هذه التقنية3-6. أثناء تقديم دليل أساسي على المفهوم ، لا يمكن ترجمة نماذج القوارض بشكل مباشر للاحتياجات السريرية البشرية. أشارت دراسة حديثة إلى أن الاستجابات الجينومية للإصابة الرضحية (والالتهابات ذات الصلة) لا ترتبط ارتباطا جيدا بين الفئران والبشر. تثير هذه النتائج تساؤلات حول صحة استخدام الفئران كنماذج لمثل هذه العمليات الكيميائية الحيوية المعقدة فيالبشر 7. توفر نماذج الرئيسيات غير البشرية (NHP) ميزة التشابه الوثيق مع بيولوجيا البشر على المستويات الجينومية والتشريحية والفسيولوجية وتسمح بمعالجة أكثر مرونة لمزيد من الاستقراء للاستخدام البشري. تم استخدام المكاك الريسوس في مجموعة متنوعة من التطبيقات قبل السريرية وهو نموذج ممتاز لدراسة هندسة الأنسجة8-11. وصفنا مؤخرا إزالة الخلايا الناجحة لرئتي المكاك الريسوس (Macacca mulatta) باستخدام إجراء له تأثير ضئيل على الرئة ECM12. يتم إزالة الخلايا من الرئة عن طريق معالجة الأنسجة على التوالي بأربعة حلول إزالة الخلايا تتكون من المنظفات والأملاح والإنزيمات مع الغسيل المتقطع بالماء منزوع الأيونات (dH2O) و PBS. لقد قمنا بتحسين هذا الإجراء عن طريق تعديل بروتوكول تم وصفه في الأصل بواسطة Price et al.4 تم استخدام مجموعة متنوعة من التقنيات التحليلية النسيجية والبروتينية لتوصيف مكونات المصفوفات اللاخلوية الناتجة بالنسبة لرئتي المكاك الأصلية.في هذا التقرير ، نوضح بروتوكولا مفصلا لإزالة الخلايا من رئتي الرئيسيات غير البشرية وإعادة خلية سقالات الرئة اللاخلوية الناتجة في مفاعل حيوي كبير العضو أظهره في الأصل Calle et al. 13 في JoVE. من خلال تعديل بروتوكولهم الأصلي لاستيعاب متطلبات الحجم والتهوية والتروية لرئتي الكبيرة ، تم نقل التكنولوجيا بنجاح من نموذج القوارض إلى نموذج المكاك الريسوس. تم إجراء جميع الدراسات المقدمة في هذا التقرير وفقا لسياسات لجنة السلامة البيولوجية المؤسسية (IBC) المعمول بها في مركز تولين الوطني لأبحاث الرئيسيات. يعد عرض هذه التقنية أمرا ضروريا لأن تحديد الهياكل التشريحية والتلاعب المادي بالأعضاء الكبيرة يكون صعبا في بعض الأحيان دون تصور خطوات البروتوكول. توفر الدراسات التي أصبحت ممكنة من خلال هذه الطرق أساسا للدراسات قبل السريرية الأساسية في رئتي المكاك الريسوس منزوعة الخلايا، حيث يمكن تقييم إعادة الخلية باستخدام الخلايا الجذعية للنسب الوسيطة الريسوسية والخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة. تحاكي نسختنا من هذا المفاعل الحيوي البيئة التنموية وتطبق قوى التمدد الميكانيكي والإجهاد في رئتي الكبيرة وتسمح بالتحقيق في إعادة خلية الرئة في ظل ظروف معروفة بتسهيل نمو الرئة والبطانة13-15.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
< p class = "jove_title" >1. إزالة الخلايا من رئة المكاك بالكامل
- إعداد الحلول
- الأوتوكلاف 10-15 لتر من الماء منزوع الأيونات (dH2O) في زجاجات 1-2 لتر.
- تحضير "محلول تريتون" (0.1٪ Triton X-100 في dH2O) عن طريق خلط 1 مل Triton X-100 في 999 مل من dH2O أثناء التقليب على محرك مغناطيسي. قم بتصفية المحلول من خلال جهاز تصفية 0.22 ميكرومتر. يحفظ في درجة حرارة الغرفة.
- قم بإعداد "محلول SDC" (2٪ SDC في dH2O) عن طريق إضافة 20 جم من deoxycholate الصوديوم (SDC) ببطء إلى ~ 900 مل dH2O أثناء التحريك. بمجرد إذابة SDC ، انقل المحلول إلى أسطوانة متدرجة وارفع الحجم إلى 1 مل مع dH2O. قم بتصفية المحلول من خلال جهاز مرشح 0.22 ميكرومتر. يحفظ في درجة حرارة الغرفة.
- تحضير "محلول كلوريد الصوديوم" عن طريق إضافة 58 جم من كلوريد الصوديوم إلى ~ 900 مل من درجة حرارة2درجة حرارة وحرك حتى يذوب تماما. أضف dH2O إلى الحجم النهائي البالغ 1 لتر ، ثم قم بالتصفية ، وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
- تحضير الأعضاء
- يجب توخي أقصى درجات الحذر لمنع حوادث التعرض المعدية عند العمل مع أنسجة المكاك. ارتد معدات الحماية الشخصية التالية (PPE) قبل التعامل مع أنسجة الرئيسيات غير البشرية: قناع جراحي ، ودرع للوجه ، والقفازات الجراحية ، وثوب يمكن التخلص منه ، وطبقة ثانية من القفازات الجراحية.
- جمع كتل القلب والرئة السليمة من تشريح في PBS التي تحتوي على 50 وحدة / مل من الهيبارين لمنع تخثر الدم الخارجي.
- مع استلقاء الرئتين بشكل مسطح في صينية تشريح ، قم بتقطيع الشريان الرئوي باستخدام موصل Luer الأنثوي بشوكة بحجم مناسب. قم بتثبيت القنية في مكانها برباط بسحاب معقم بالكحول.
- قم بربط ربطة عنق مضغوطة معقمة حول القصبة الهوائية ، وأدخل موصل Luer أنثوي 0.250 بوصة في فتحة القصبة الهوائية ، وشد ربطة العنق المضغوطة حول شوكة الموصل لتثبيت القصبة الهوائية في مكانها حول الشوكة.
- قم بإزالة الهواء المحبوس من الرئتين عن طريق غرس PBS الذي يحتوي على 30 وحدة / مل من الهيبارين و 5 ميكروغرام / مل من نيتروبروسايد الصوديوم (SNP). اسمح بطرد المحلول عن طريق الارتداد الطبيعي وكرر التقطير مرتين أخريين. بعد التقطير الثالث ، قم بتغطية قنية Luer القصبة الهوائية بسدادة Luer لتثبيت المحلول في الرئتين.
- اقطع قمة القلب وري البطينين الداخليين باستخدام PBS-heparin-SNP لإزالة الدم المتبقي. قم بتقطيع كلا الأذينين لتسهيل تصريف الدوائر الرئوية عند التروية.
- اغمر كتلة القلب والرئة في dH2O. املأ حقنة سعة 60 مل بمحلول PBS-heparin-SNP. باستخدام الملقط ، اغمر القنية الشريانية حتى تتسرب جميع فقاعات الهواء من فتحة الأوعية الدموية. قم بتوصيل المحقنة وإزالة المكبس بعناية واترك السائل يتدفق إلى الأوعية الدموية.
- قم بإزالة السدادة من قنية القصبة الهوائية والسماح للسائل الموجود في مجرى الهواء بطرد الارتداد الطبيعي. استمر في إضافة محلول PBS-heparin-SNP إلى المحقنة المتصلة بالقنية الوعائية من أجل الحفاظ على ضغط ~ 15-20 سم H2O فوق الشريان. استمر في التروية حتى يتم إزالة أكبر قدر ممكن من الدم من الأوعية الدموية الرئوية.
- نزع الخلايا
- اليوم 1: غمر كتلة القلب والرئة في dH2O. تضخيم الرئة وفتحها ب dH2O باستخدام محاقن 60 مل متصلة بالقنيات القصبية والشرايين المغمورة ، على التوالي. كرر غسل مجرى الهواء والأوعية الدموية مع dH2O 4x أكثر ليصبح المجموع خمس مرات شطف.
- قم بإزالة الرئتين من الماء واغمر الكتلة في محلول تريتون. نفخ الرئتين ونفخهما بمحلول تريتون كما كان من قبل. كرر التقطير مرة ثانية ، واحتضان الأعضاء المغمورة في محلول تريتون طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
- اليوم 2: بعد الحضانة الليلية ، قم بإزالة كتلة الرئة من محلول Triton ، واغسلها خارجيا باستخدام dH2O ، ثم اغمر الكتلة في dH2O. كرر dH2O يغسل 5x كما في الخطوة 1.3.1.
- قم بإزالة الرئتين من dH2O واغمرها في محلول SDC. تضخيم وتفريغ محلول SDC بنفس الطريقة كما في الخطوة 1.3.2. احتضان مغمورة في محلول SDC طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
- اليوم 3: اغسل المنديل مرة أخرى باستخدام dH2O كما في 1.3.1.
- قم بإزالة الأنسجة من dH2O واغمرها في محلول كلوريد الصوديوم. تضخيم وصب بمحلول كلوريد الصوديوم بنفس الطريقة كما في الخطوة 1.3.2. احتضان مغمورة في محلول كلوريد الصوديوم لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- اغسل الرئتين نظيفتين من محلول كلوريد الصوديوم باستخدام dH2O كما في الخطوة 1.3.1.
- تحضير "محلول DNase" طازج (30 ميكروغرام / مل DNase ، 1.3 ملي ملي MgSO4 ، 2.0 ملي CaCl2 في dH2O) استحم الرئتين في هذا المحلول وغرس في مجرى الهواء والأوعية الدموية كما في الخطوة 1.3.2. احتضان الرئتين في محلول DNase لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- تحضير "محلول PBS" طازج (1x PBS + 5x مضاد حيوي / مضاد للفطريات). قم بإزالة الرئتين من محلول DNase وغسلها خارجيا بمحلول PBS. اغمر الرئتين في محلول PBS واغسلها بهذا المحلول خمس مرات كما في الخطوة 1.3.1.
- قم بتخزين الرئتين في محلول PBS في وعاء محكم الغلق طوال الليل عند 4 درجات مئوية. في اليوم التالي (اليوم 4) ، اغسل الرئتين في محلول PBS طازج ومثلج خمس مرات كما في الخطوة 1.3.1 واحفظه في محلول PBS في وعاء معقم ومغلق عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
- التجميع وتركيب الأنسجة
- قم بتجميع حلقات التنفس وهياكل حلقة الأوعية الدموية بالإضافة إلى محولات قنيات القصبة الهوائية والأوعية الدموية في وقت مبكر (الشكل 1). باستثناء فلاتر الهواء المعقمة ومنافذ الحقن ، قم بالأوتوكلاف بجميع مكونات المفاعل الحيوي.
- قم بتجميع مكونات المفاعل الحيوي تحت غطاء تدفق رقائقي وفقا للتخطيطي في الشكل 2. املأ الغرفة الرئيسية بوسط الاستزراع الذي تم موازنته مع الغلاف الجوي 5٪ CO2 لحاضنة زراعة الخلايا مباشرة قبل استخدامه في المفاعل الحيوي.
- ضع محولات القصبة الهوائية والأوعية الدموية على قنيات الرئة وقم بتثبيت الأعضاء في غرفة المفاعل الحيوي الرئيسية عن طريق استحمام الرئتين في وسط الاستزراع وربط محولات القنيات بالمنافذ المناسبة في الغطاء المعدل. بمجرد التوصيل ، قم بتثبيت الغطاء بإحكام وإحكام ؛ لن تفتح الغرفة مرة أخرى طوال مدة إعادة التخزين.
- املأ خزان القصبة الهوائية نصف ممتلئ تقريبا بوسط الاستزراع وقم بلصق الغطاء المعدل.
- قم بتطبيق مرشحات حقنة معقمة 0.22 ميكرومتر ومقابس لور ومنافذ حقن على جميع الغرف كما هو موضح.
- قم بتوصيل خزان القصبة الهوائية بالغرفة الرئيسية عبر جهاز حلقة التنفس. قم بتوصيل أنبوب حلقة التنفس كما هو موضح.
- استنشق الهواء من الأنبوب باستخدام منافذ الحقنة وحقنة 60 مل مزودة بإبرة 18 G ؛ حرك اتجاه محبس 3 اتجاهات لتوجيه تدفق السائل إلى المحقنة.
- انقل غرف المفاعل الحيوي المختومة والمتصلة بشكل متجاور مع الأعضاء المثبتة إلى حاضنة زراعة الأنسجة لموازنة درجة الحرارة والغاز. قم بتهوية الرئتين باستخدام مضخة حقنة متصلة بالغرفة الرئيسية عند ~ 1 "نفس" كامل كل دقيقتين ، وقم بنشر الأوعية الدموية عبر المضخة التمعجية بحوالي 10 مل / دقيقة ليصبح المجموع ~ 30 دقيقة.
- بذر مجرى الهواء
- قم بإعداد معلقات الخلايا المراد زرعها في مجرى الهواء بكثافة الخلية المطلوبة (يعتمد الحجم على حجم العضو).
- قم بتضخيم الرئتين بتعليق الخلية عن طريق الحقن برفق من خلال منفذ المحقنة المتصل بمحبس ثلاثي الاتجاهات في حلقة التنفس.
- امسك الرئتين بشكل ثابت عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 طوال الليل بدون مجرى الهواء أو نضح الأوعية الدموية للسماح للخلايا بالالتصاق بمصفوفة الرئة منزوعة الخلايا.
- بعد الحضانة الليلية ، أعد بدء برنامج تهوية مجرى الهواء القياسي ، وقم بزراعة الأعضاء لمدة 3-7 أيام (أو المدة الأخرى المرغوبة).
- بذر الأوعية الدموية
- قم بإعداد معلقات مزارع الخلايا البطانية على النحو الوارد أعلاه لبذر خلايا مجرى الهواء.
- انقل تعليق الخلية إلى خزان البذر البطاني الذي يحتوي على قضيب تحريك مغناطيسي صغير.
- قم بتغيير اتجاه مسار التدفق من الغرفة الرئيسية إلى خزان البذر البطاني عن طريق تدوير الصمام الموجود على محبس الموجود في الأنبوب الذي يربط بين هاتين المقصورتين ، والخلايا البطانية للبذور تدريجيا أثناء التحريك برفق باستخدام المضخة التمعجية.
- عند اكتمال البذر (أي يتم استنفاد حجم تعليق الخلية البطانية في خزان البذر البطاني) ، أوقف التروية واحتضان بشكل ثابت لمدة ~ 4-6 ساعات. أعد بدء نضح الأوعية الدموية بوسط الغرفة الرئيسية بمعدل ~ 10 مل / دقيقة (أو الضغط المطلوب إذا تم مراقبته).
- استزراع لمدة 3-7 أيام مع نضح الأوعية الدموية المستمر.
3. استكشاف الأخطاء وإصلاحها والأساليب البديلة
- قنية القصبة الهوائية: يمكن استخدام الغرز بدلا من ربطة عنق مضغوطة لتثبيت قنية لور في مكانها إذا كانت القصبة الهوائية صغيرة جدا. يعمل 1/4 في اتصال Luer الأنثوي كقنية كافية لمجموعة واسعة من أقطار القصبة الهوائية.
- إزالة الدم عن طريق نضح الشريان الرئوي: نظرا لأن الأنسجة يتم جمعها من الجثث ، فإن التخثر الدقيق شائع ويمنع بعض مناطق السرير الشعري الرئوي من التطهير الكامل من الدم المتبقي. ومع ذلك ، أثناء إزالة الخلايا ، تصبح هذه الأوعية الصغيرة قابلة للاختراق ، وتقوم كواشف إزالة الخلايا بتحليل هذه الجلطات وتدهورها بكفاءة. يجب إجراء نضح ما قبل الخلية لتصفية أكبر قدر ممكن من الدم ، ولكن ليس من الضروري إزالة جميع آثار الدم من الحمة.
- طرد السوائل من الرئتين: تحتفظ رئتا المكاك بالارتداد الطبيعي القوي خارج الجسم الحي، حتى عند نفخها بالسوائل. ومع ذلك ، أثناء إزالة الخلايا ، يتم تحلل الخلايا وتطلق المواد (بما في ذلك الحمض النووي) التي تزيد من لزوجة السوائل المغرسة مما يجعل طردها أكثر صعوبة. عادة ما تكون الحضانة الليلية عند 4 درجات مئوية أثناء غمرها في السائل المغرس كافية للسماح للرئتين بطرد السائل اللزج تماما. بدلا من ذلك ، السماح بطرد أكبر قدر ممكن من السوائل من الرئتين ثم المضي قدما في تقطير المحاليل اللاحقة ؛ عادة ما تسهل إضافة المنظفات وغسالات المياه منزوعة الأيونات إزالة السوائل اللزجة وتسمح بإزالة الخلايا من المضي قدما بكفاءة.
- إضافة المضادات الحيوية إلى محاليل المنظفات: يمكن إضافة المضادات الحيوية ومضادات الفطريات إلى محاليل الغسيل بالماء منزوعة الأيونات وكذلك محاليل المنظفات ؛ ومع ذلك ، فإن البنسلين / الستربتومايسين يترسب في وجود ديوكسيكولات الصوديوم ، وقد تتداخل هذه الرواسب مع عمليات إزالة الخلايا والغسيل. علاوة على ذلك ، فإن وجود المضادات الحيوية / مضادات الفطريات ليس ضروريا أثناء إزالة الخلايا لأن المنظفات المستخدمة بهذه التركيزات قادرة على تحلل الميكروبات وقتلها. بعد إزالة الخلايا ، يكون الشطف والتخزين بمحلول PBS (الذي يحتوي على 5x البنسلين / الستربتومايسين / الأمفوتريسين B) كافيا لمنع معظم التلوث.
- إزالة الهواء من أنابيب المفاعل الحيوي: يتم شفط الهواء بكفاءة من أنابيب المفاعل الحيوي باستخدام حقنة مع إبرة يتم إدخالها في منافذ الإبرة في محبس ثلاثي الاتجاهات. بدلا من ذلك ، يمكن مسح 1x PBS أو وسائط الثقافة من خلال الأنبوب قبل تثبيت الأعضاء باستخدام حقنة متصلة بنفس الطريقة.
- تهوية وتروية الرئتين أثناء وبعد إعادة الخلية: في حين أن معدلات التدفق والأوقات المذكورة في هذا التقرير كانت كافية لربط الخلية بالإضافة إلى تهوية سائل مجرى الهواء وتروية الأوعية الدموية ، يجب تحديد هذه القيم تجريبيا من قبل المستخدم. يمكن أيضا تعديل أوقات الثقافة بناء على معدلات نمو الخلايا المغرسة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تمثل النتائج الموضحة أدناه تجارب منفصلة تم فيها استزراع إما الحجيرات التنفسية أو الحجيرات الوعائية بخلايا جذعية ميزنكيمية مشتقة من نخاع العظم لـ rhesus macaque أو خلايا بطانية مجهرية وعائية مشتقة من رئة rhesus، على التوالي، والتي تم عزلها وتوصيفها كما تم وصفه سابقاً16-18.
خلال عملية إزالة الخلايا، أظهرت رئات المكاك تبييضاً تدريجياً وصل إلى مظهر شفاف في نهاية العملية؛ ومع ذلك، حافظت الرئتان على سماتهما التشريحية الكلية وظلتا مرنتين إلى حد كبير وقادرتين على إحداث ارتداد طبيعي بعد النف...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يمكن إزالة الخلايا من الأنسجة بكفاءة وفعالية من خلال عدد من الطرق التي تستخدم العوامل الفيزيائية والكيميائية والأنزيمية12،20. تشمل تحديات إنتاج مصفوفات بيولوجية ثلاثية الأبعاد من الأعضاء الكبيرة الحاجة إلى كميات كبيرة من حلول إزالة الخلايا ، والمعدات التجارية باهظة الثمن (أي المفاعلات الحيوية) ، وكمية مذهلة من الاضطرابات المنهجية المطلوبة لتحقيق المنتج النهائي المشتق من الأنسجة. توفر طريقتنا نهجا مباشرا يقلل من التلاعب المادي وحجم الكاشف والتكلفة. يستغرق نزع الخلايا والتعقيم الكامل لرئتي المكاك الريسو...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدينا ما نكشف عنه.
شكر وتقدير
يرغب المؤلفون في شكر محرري هندسة الأنسجة على السماح باستخدام صور من منشور سابق في هذا التقرير.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| نيتروبروسايد الصوديوم | سيجما ألدريتش | 71778-25 جم | |
| ملح الصوديوم الهيبارين | فيشر | BP2425 | |
| تريتون X-100 | فيشر | BP151-100 | |
| ديوكسي كولات الصوديوم | فيشر | BP349-100 | |
| كلوريد الصوديوم | فيشر | 7647-14-5 | |
| البنكرياس البقري DNase | سيجما ألدريتش | DN25 | تحضير المخزون ، ونقل ، والتجميد |
| كبريتات المغنيسيوم | فيشر | 10034-99-8 | |
| كلوريد الكالسيوم | فيشر | C614-500 | |
| PBS (بدون Ca / Mg) | Gibco ، Life Technologies | 10010-031 | |
| المضادات الحيوية والمضادة للفطريات | Gibco Life Technologies | 15240062 | |
| وسائط زراعة الخلايا | |||
| Alpha MEM | Gibco Life Technologies | 12561-072 | |
| متوسط 199 | Gibco Life Technologies | 11150067 | |
| مصل الأبقار الجنيني الممتاز | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| L-Glutamine 100x | Gibco Life Technologies | 25030-081 | |
| مكمل نمو الخلايا البطانية (ECGS) | ScienCell | 1052 | |
| المضادات الحيوية المضادة للفطريات | Gibco Life Technologies | 15240062 | |
| بذر الخلايا وصمامات فحص ثقافة المفاعل الحيوي | |||
| Cole-Parmer | EW-98553-20 | ||
| Y-connectors | Cole-Parmer | ED-30614-08 | |
| 3-Way Stopcocks | Harvard Apparatus | 721664 | |
| MasterFlex L / S 14 أنابيب | Cole-Parmer | 96420-14 | |
| MasterFlex L / S 16 أنبوب | Cole-Parmer | 96420-16 | |
| ذكر قفل لور 1/8 في | Cole-Parmer | EW-45505-04 | |
| أنثى لور 1/8 في | Cole-Parmer | SI-45502-04 | |
| ذكر Luer قفل قابس | Cole-Parmer | EW-45505-56 | |
| منافذ الحقن | Medi-Dose EPS | IV2004 | |
| أنابيب اللاتكس | سانت لويس ميديكال سوبي | HN10910 | |
| خرطوم المشبك | كول بارمر | EW-06832-02 | |
| 2 لتر جرة واسعة الفم | فيشر | 05-719-276 | |
| 60 مل محاقن | فيشر | NC9035364 |
المراجع
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. 14, 213-221 (2008).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).
- Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 16, 927-933 (2010).
- Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded. Tissue Eng. Part A. 16, 2581-2591 (2010).
- Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329, 538-541 (2010).
- Song, J. J., et al. Enhanced in vivo function of bioartificial lungs in rats. Ann. Thorac. Surg. 92, 998-1005 (2011).
- Seok, J., et al. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).
- Joag, S. V. Primate models of AIDS. Microbes Infect. 2, 223-229 (2000).
- Hu, S. L. Non-human primate models for AIDS vaccine research. Curr. Drug. Targets Infect. Disord. 5, 193-201 (2005).
- Borda, J. T., et al. Clinical and immunopathologic alterations in rhesus macaques affected with globoid cell leukodystrophy. Am. J. Pathol. 172, 98-111 (2008).
- Fabbrini, E., et al. Metabolic response to high-carbohydrate and low-carbohydrate meals in a non-human primate model. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. , (2012).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).
- Calle, E. A., Petersen, T. H., Niklason, L. E. Procedure for Lung Engineering. J. Vis. Exp. (49), e2651(2011).
- Arold, S. P., Wong, J. Y., Suki, B. Design of a new stretching apparatus and the effects of cyclic strain and substratum on mouse lung epithelial-12 cells. Ann. Biomed. Eng. 35, 1156-1164 (2007).
- Huang, H., et al. Differentiation from embryonic stem cells to vascular wall cells under in vitro pulsatile flow loading. J. Artif. Organs. 8, 110-118 (2005).
- Izadpanah, R., et al. Characterization of multipotent mesenchymal stem cells from the bone marrow of rhesus macaques. Stem Cells Dev. 14, 440-451 (2005).
- Craig, L. E., Nealen, M. L., Strandberg, J. D., Zink, M. C. Differential replication of ovine lentivirus in endothelial cells cultured from different tissues. Virology. 238, 316-326 (1006).
- Craig, L. E., Spelman, J. P., Strandberg, J. D., Zink, M. C. Endothelial cells from diverse tissues exhibit differences in growth and morphology. Microvasc. Res. 55, 65-76 (1998).
- Bonvillain, R. W., et al. A Nonhuman Primate Model of Lung Regeneration: Detergent-Mediated Decellularization and Initial In Vitro Recellularization with Mesenchymal Stem Cells. Tissue Eng. Part A. 18, 2437-2452 (2012).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-Organ Tissue Engineering: Decellularization and Recellularization of Three-Dimensional Matrix Scaffolds. Annu. Rev. Biomed. Eng. , (2010).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
