Method Article

إزالة الخلايا من الرئة غير البشرية للرئيسيات وإعادة الخلايا باستخدام مفاعل حيوي متخصص للأعضاء الكبيرة

DOI:

10.3791/50825

⸱

December 15th, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Stem Cell Research and Regenerative Medicine, Tulane University School of Medicine, 2Division of Regenerative Medicine, Tulane National Primate Research Center, 3Department of Microbiology and Immunology, Tulane University School of Medicine, 4Department of Pharmacology, Tulane University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ينتج عن إزالة الخلايا من الأعضاء بالكامل سقالات بيولوجية طبيعية يمكن استخدامها في الطب التجديدي. يتم تقديم وصف لنموذج رئيسيات غير بشري لتجديد الرئة حيث يتم نزع الخلايا من الرئتين بالكامل ثم زرعها بالخلايا الجذعية البالغة والخلايا البطانية في مفاعل حيوي يسهل الدورة الدموية الوعائية وتهوية الوسائط السائلة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا يوجد عدد كاف من الرئتين المتاحة لتلبية احتياجات زراعة الأعضاء الحالية والمستقبلية. يعد تجديد الأنسجة الاصطناعية الحيوية بديلا جذابا لزراعة الأعضاء الكلاسيكية. تستخدم هذه التقنية المصفوفة البيولوجية الطبيعية خارج الخلية (ECM) للعضو كسقالة يمكن زرع الخلايا الذاتية أو الجذعية / السلفية عليها وزراعتها بطريقة تسهل تجديد الأنسجة الأصلية. يتم عزل ECM الطبيعي من خلال عملية تسمى إزالة الخلايا. يتم إزالة الخلايا عن طريق معالجة الأنسجة بسلسلة من المنظفات والأملاح والإنزيمات لتحقيق الإزالة الفعالة للمواد الخلوية مع ترك ECM سليمة. أظهرت الدراسات التي أجريت باستخدام إزالة الخلايا وإعادة الخلايا اللاحقة لرئتي القوارض نجاحا هامشيا في توليد أنسجة شبيهة بالرئة قادرة على تبادل الغازات في الجسم الحي. أثناء تقديم دليل أساسي على المفهوم ، لا يمكن ترجمة نماذج القوارض مباشرة إلى الاستخدام البشري. تقدم الرئيسيات غير البشرية (NHP) نموذجا أكثر ملاءمة للتحقيق في استخدام إنتاج الأعضاء الاصطناعية الحيوية للاستخدام السريري النهائي. < p class = "jove_content"> يتم تقديم بروتوكولات تحقيق إزالة الخلايا الكاملة للرئتين المكتسبة من NHP المكاك الريسوس. يمكن زرع الرئتين اللاخلويتين الناتجة بمجموعة متنوعة من الخلايا بما في ذلك الخلايا الجذعية الوسيطة والخلايا البطانية. تصف المخطوطة أيضا تطوير نظام مفاعل حيوي يمكن فيه زراعة رئتي المكاك المصنفة بالخلايا في ظل ظروف التمدد الميكانيكي والإجهاد الذي توفره تهوية الضغط السلبي بالإضافة إلى التروية النابضة من خلال الأوعية الدموية. من المعروف أن هذه القوى تمايز مباشر على طول السلالات الرئوية والبطانية ، على التوالي. يتم توفير النتائج التمثيلية لإزالة الخلايا وبذر الخلايا.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد الهندسة الحيوية للأنسجة والأعضاء إضافة جذابة لمجال الطب التجديدي. من المستحسن للغاية إنشاء أعضاء "مزروعة في المختبر" ومناسبة للزرع في المرضى لتحل محل وظائف الأعضاء المريضة من أجل تلبية الطلب الحالي والمستقبلي على احتياجات الزرع. تتمحور مبادئ هندسة الأنسجة حول بذر أنواع الخلايا المرغوبة ، أو أسلافها ، في سقالة تدعم شكل الأنسجة الهندسية مع توفير عوامل النمو المناسبة وظروف الثقافة اللازمة لتقليد العمليات التنموية أو التجديدية. بينما تم استخدام السقالات الاصطناعية لهندسة الأنسجة ، قد تكون المصفوفة الطبيعية خارج الخلية (ECM) أفضل مصدر للسقالات الخاصة بالأعضاء لهذا الغرض. إزالة الخلايا من العضو بالكامل هي عملية تسمح بإزالة الخلايا مع ترك الجوانب الكيميائية والهيكلية ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. إزالة الخلايا من رئة المكاك بالكامل

  1. إعداد الحلول
    1. الأوتوكلاف 10-15 لتر من الماء منزوع الأيونات (dH2O) في زجاجات 1-2 لتر.
    2. تحضير "محلول تريتون" (0.1٪ Triton X-100 في dH2O) عن طريق خلط 1 مل Triton X-100 في 999 مل من dH2O أثناء التقليب على محرك مغناطيسي. قم بتصفية المحلول من خلال جهاز تصفية 0.22 ميكرومتر. يحفظ في درجة حرارة الغرفة.
    3. قم بإعداد "محلول SDC" (2٪ SDC في dH2O) عن طريق إضافة 20 جم من deoxycholate الصوديوم (SDC) ببطء إلى ~ 900 مل dH2O أثناء التحريك. بمجرد إذابة SDC ، انقل المحلول إلى أسطوانة متدرجة وارفع الحجم إلى 1 مل مع dH2O. قم بتصفية ا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمثل النتائج الموضحة أدناه تجارب منفصلة تم فيها زرع مجرى الهواء أو حجرات الأوعية الدموية بالخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من نخاع عظام المكاك الريسوس أو الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة المشتقة من رئة الريسوس ، على التوالي ، والتي تم عزلها ووصفها كما هو موضح سابقا16-18.

طوال عملية إزالة الخلايا ، أظهرت رئتا المكاك تبييضا تدريجيا بلغ ذروته في مظهر شفاف في نهاية العملية ؛ ومع ذلك ، حافظت الرئتان على خصائصها التشريحية الإجمالية وظلت مرنة إلى حد كبير وقادرة على إنتاج ارتداد طبيعي بعد .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن إزالة الخلايا من الأنسجة بكفاءة وفعالية من خلال عدد من الطرق التي تستخدم العوامل الفيزيائية والكيميائية والأنزيمية12،20. تشمل تحديات إنتاج مصفوفات بيولوجية ثلاثية الأبعاد من الأعضاء الكبيرة الحاجة إلى كميات كبيرة من حلول إزالة الخلايا ، والمعدات التجارية باهظة الثمن (أي المفاعلات الحيوية) ، وكمية مذهلة من الاضطرابات المنهجية المطلوبة لتحقيق المنتج النهائي المشتق من الأنسجة. توفر طريقتنا نهجا مباشرا يقلل من التلاعب المادي وحجم الكاشف والتكلفة. يستغرق نزع الخلايا والتعقيم الكامل لرئتي المكاك الريسو.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدينا ما نكشف عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يرغب المؤلفون في شكر محرري هندسة الأنسجة على السماح باستخدام صور من منشور سابق في هذا التقرير.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
نيتروبروسايد الصوديومسيجما ألدريتش71778-25 جم
ملح الصوديوم الهيبارينفيشرBP2425
تريتون X-100فيشرBP151-100
ديوكسي كولات الصوديومفيشرBP349-100
كلوريد الصوديومفيشر7647-14-5
البنكرياس البقري DNaseسيجما ألدريتشDN25تحضير المخزون ، ونقل ، والتجميد
كبريتات المغنيسيومفيشر10034-99-8
كلوريد الكالسيومفيشرC614-500
PBS (بدون Ca / Mg)Gibco ، Life Technologies10010-031
المضادات الحيوية والمضادة للفطرياتGibco Life Technologies15240062
وسائط زراعة الخلايا
Alpha MEMGibco Life Technologies12561-072
متوسط 199Gibco Life Technologies11150067
مصل الأبقار الجنيني الممتازAtlanta BiologicalsS11150
L-Glutamine 100xGibco Life Technologies25030-081
مكمل نمو الخلايا البطانية (ECGS)ScienCell1052
المضادات الحيوية المضادة للفطرياتGibco Life Technologies15240062
بذر الخلايا وصمامات فحص ثقافة المفاعل الحيوي
Cole-ParmerEW-98553-20
Y-connectorsCole-ParmerED-30614-08
3-Way StopcocksHarvard Apparatus721664
MasterFlex L / S 14 أنابيبCole-Parmer96420-14
MasterFlex L / S 16 أنبوبCole-Parmer96420-16
ذكر قفل لور 1/8 فيCole-ParmerEW-45505-04
أنثى لور 1/8 فيCole-ParmerSI-45502-04
ذكر Luer قفل قابسCole-ParmerEW-45505-56
منافذ الحقنMedi-Dose EPSIV2004
أنابيب اللاتكسسانت لويس ميديكال سوبيHN10910
خرطوم المشبككول بارمرEW-06832-02
2 لتر جرة واسعة الفمفيشر05-719-276
60 مل محاقنفيشرNC9035364

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. 14, 213-221 (2008).
  2. Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Nonhuman Primate LungLung DecellularizationBioreactor SystemExtracellular MatrixStem Cell SeedingEndothelial Cell CultureMechanical StretchPulsatile PerfusionTissue EngineeringOrgan Regeneration

Related Articles