نصف طريقة لزرع وصيانة النوافذ الزجاجية فوق الحبل الشوكي المكشوف للفئران البالغة لدراسة التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي. توفر هذه النوافذ وصولا بصريا مزمنا إلى الحبل الشوكي لمراقبة ديناميكيات الخلايا على المستوى تحت الخلوي في الحية باستخدام الفحص المجهري ثنائي الفوتون.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
زرع النخاع الشوكي زجاج نوافذ في الفئران الكبار مع التهاب الدماغ التجريبية المناعة الذاتية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) في القوارض البالغة هو النموذج التجريبي القياسي لدراسة الأمراض اللاإرادية المزيلة للميالين مثل التصلب المتعدد. نقدم هنا بروتوكول زرع النوافذ الزجاجية منخفض التكلفة وقابل للتكرار ومناسب للفحص المجهري داخل الحيوية ودراسة ديناميكيات البنية الخلوية للحبل الشوكي بدقة تحت الخلوية في الفئران البالغة الحية المصابة بالإي العاطفي البصري. باختصار ، نقوم بتعريض الفقرات T12-L2 جراحيا وبناء غرفة حول الفقرات المكشوفة باستخدام مزيج من السيانواكريلات والأسمنت الأسنان. يتم إجراء استئصال الصفيحة الفقرية من T13 إلى L1 ، ويتم تطبيق طبقة رقيقة من مطاط السيليكون الشفاف على السطح الظهري للحبل الشوكي المكشوف. يتم زرع زلة غطاء زجاجي معدلة فوق الحبل الشوكي المكشوف مع الحرص على عدم ملامسة الزجاج للحبل الشوكي مباشرة. لتقليل تسلل الخلايا الالتهابية بين النافذة والحبل الشوكي ، يتم إعطاء العلاج المضاد للالتهابات كل يومين (على النحو الموصى به من قبل لجنة الأخلاقيات) لأول 10 أيام بعد الزرع. يتم تحفيز EAE بعد 2-3 أسابيع فقط من التوقف عن العلاج المضاد للالتهابات.
باستخدام هذا النهج ، نجحنا في إحداث EAE في 87٪ من ذات النوافذ المزروعة ، وباستخدام الفئران Thy1-CFP-23 (المحاور الزرقاء في الحبل الشوكي الظهري) ، قمنا بقياس الخسارة المحورية خلال تطور EAE. قد يكون هذا البروتوكول معا مفيدا لدراسة تجنيد مجموعات الخلايا المختلفة بالإضافة إلى ديناميكيات تفاعلها ، مع دقة تحت الخلايا ولفترات طويلة من الزمن. تمثل طريقة التصوير داخل الحيوية هذه أداة قيمة لتطوير استراتيجيات علاجية لعلاج الأمراض المزيلة للميالين المناعي الذاتي مثل EAE.
المقدمة
التصلب المتعدد هو مرض مناعي ذاتي في الجهاز العصبي المركزي يسبب تلف المايلين التدريجي والمحاور العصبي. نموذج البحث القياسي لأمراض الجهاز المناعي الذاتي المزيل للميالين هو EAE في القوارض البالغة. ومع ذلك ، فإن الأحداث الخلوية الديناميكية الكامنة وراء تقدم EAE لا تزال غير مستكشفة إلى حد كبير. تتمثل إحدى الطرق في استخدام الفحص المجهري ثنائي الفوتون داخل الحيوية لتصور التجمعات الخلوية بعلامات الفلورسنت لفترات طويلة من الزمن في الحبل الشوكي للفئران البالغة المصابة بالإي العاطفي البصري.
يعد الفحص المجهري ثنائي الفوتون داخل الحيوية طريقة قوية لدراسة علم وظائف الأعضاء الخلوي والتفاعلات الخلوية والتقدم الديناميكي للمرض في الحية بدقة تحت الخلوية1. ومع ذلك ، فإن العقبة الرئيسية أمام هذا النهج هي أنه يتطلب الوصول البصري إلى المنطقة محل الاهتمام. على سبيل المثال ، النوافذ الزجاجية الجمجمة هي منهجية راسخة للتصوير المتكرر لنفس الهياكل المجهرية في الدماغ على مدار عدة أسابيع2،3. ومع ذلك ، فإن تكييف هذه المنهجية مع تصوير الحبل الشوكي ليس سهلا ويتطلب العديد من التعديلات الفنية لتثبيت الأنسجة الشوكية الظهرية داخل الفقرات المفصلية.
في السابق ، كان الوصول البصري إلى الحبل الشوكي يتطلب إعادة تعريض الحبل الشوكي جراحيا في بداية كل جلسة تصوير وخياطة الجلد مغلقا في نهاية كل جلسة4-12. هذه العمليات الجراحية المتكررة مؤلمة للحيوان ، وتحد من عدد وطول جلسات التصوير ، وتزيد من احتمالية القطع الأثرية المتعلقة بالجراحة مثل الالتهاب وتلف الحبل الشوكي من خلال الاضطراب الميكانيكي. للتغلب على أوجه القصور هذه ، قمنا مؤخرا بتطوير بروتوكول لزرع نوافذ زجاجية فوق الحبل الشوكي المكشوف للفئران الفلورية البالغة المعدلة وراثيا المصابة بإصابات الحبل الشوكي الرضحية لتجارب مجهرية ثنائية الفوتون طويلة الأمد في الجسم الحي دون إجراء عمليات جراحيةمتكررة 13. نقدم هنا تكيفا مفصلا لبروتوكول الزرع في سياق تطبيقه لدراسة الأحداث الخلوية الديناميكية الكامنة وراء تطور EAE في الفئران البالغة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
< p class = "jove_title" >1. إعداد هيكل النافذة والدعم
- تحضير النافذة - قم بإعداد عدة نوافذ بأحجام مختلفة (العرض = 1.8-2.2 مم ؛ الطول = 4.5-5.2 مم) للزرع.
- صنع لدغ الحفر المعدل لقطع زجاج الغطاء - باستخدام كمية كبيرة من الأسمنت للأسنان ، قم بتوصيل لدغ الحفر بعمود (في حالتنا ، مشابك بولدوج القديمة). تأكد من أن الشفرات ~ 45 درجة بالنسبة للعمود لتسهيل التعامل معها.
ملاحظة: يعمل الكتبة الماسية أيضا بشكل جيد لقطع زجاج الغطاء. - صنع الشريحة A - باستخدام شريحة مجهر قياسية ، قم بلصق قطعة قصيرة من ورق المسطرة (~ 2 سم) في أسفل الشريحة حتى تتمكن من رؤية المسطرة من خلال الزجاج. بعد ذلك ، ضع قطعة من الشريط على طول حافة علامة 0 مم للمسطرة لتكون بمثابة عنصر أساسي لزجاج الغطاء في الخطوة التالية.
- باستخدام لدغ الحفر المعدل ، والشريحة A ، وشريحة المجهر غير المعدلة (الشريحة B) ، ضع قطعة من زجاج الغطاء (رقم 1.5 سمك) على علامة 0 مم على الشريحة A. استخدم الشريحة B لتثبيت زجاج الغطاء في مكانه وكرقصة لخط القطع المقصود. قطع زجاج الغطاء إلى مستطيل طويل بحوالي 5 × 22 مم. قم بتدوير الزجاج المقطوع بزاوية 90 درجة وقطع المستطيل إلى مستطيل أصغر ~ 2 × 5 مم.
- صنع لدغ الحفر المعدل لقطع زجاج الغطاء - باستخدام كمية كبيرة من الأسمنت للأسنان ، قم بتوصيل لدغ الحفر بعمود (في حالتنا ، مشابك بولدوج القديمة). تأكد من أن الشفرات ~ 45 درجة بالنسبة للعمود لتسهيل التعامل معها.
- تعديلات التدبيس - سيتم زرع دبابيسين معدلتين لدعم حجرة النافذة وتثبيتها على الفقرات (انظر القسم 2.7-8).
- باستخدام دبابيس صغيرة قياسية (التاج = 8 مم ؛ الساق = 4 مم) ، ثني منتصف التاج ~ 90 درجة بحيث تلامس أطراف الساقين تقريبا.
- ثني أطراف الساقين للخارج ~ 45 درجة عند نقطة المنتصف ، بحيث يكون النصف البعيد من الساقين متوازيا.
- ثني النصف البعيد من الساقين ~ 30 درجة لأعلى بالنسبة لمستوى الدبابيس. ضع الدبابيس المعدلة في الإيثانول قبل الجراحة للتعقيم.
ملاحظة: يمكن أيضا تعقيم الدبابيس باستخدام أكسيد الإيثيلين أو التعقيم.
- تعديلات مشبك الورق - قم بإعداد مشبك ورق معدل واحد ليتم زرعه كجزء من الغرفة (انظر الأقسام 2.9-10) ويكون بمثابة مشبك تثبيت للجراحة والتصوير.
- باستخدام مشبك ورق قياسي مقاس 25 مم ، قم بإزالة الانحناء الصغير تاركا شكل U ممدود.
- باستخدام كماشة أو مشغلات إبرة ، قلل قطر الانحناء إلى ~ 2 مم مع الحفاظ على الأطراف متوازية.
- ثني الأطراف للخارج ~ 90 درجة عند حوالي 8-10 مم من الانحناء. قم بإجراء أي تعديلات ضرورية بحيث تكون مسطحة.
2. زرع النوافذ
ملاحظة: تم إجراء جميع الإجراءات الجراحية ورعاية وفقا لتوجيه مجلس المجتمعات الأوروبية وتمت الموافقة عليها من قبل اللجنة الوطنية للدراسات الحيوانية في فرنسا (التفويض رقم 13،300).
- تخدير الفأر (كيت / زيل؛ جرعة الحث: 120 مجم / كغ ، 12 مجم / كغ ؛ جرعة تكميلية ، 40 مجم / كجم ، 4 مجم / كغ) ، ضع مرهم العين على العينين.
- احلق ظهره بعرض ~ 2 سم تقريبا وطول ~ 5 سم ، متمركزا على سنام الصدر ، ونظف الجلد المكشوف باستخدام صابون اليود متبوعا بمحلول اليود. نظف القفازات عن طريق الرش بنسبة 90٪ من الإيثانول.
- باستخدام مقص المناديل ، قم بقص الجلد الظهري طوليا فوق الفقرات T11 إلى L1 (~ 2 سم). باستخدام مشرط ، قم بعمل شقوق طولية ثنائية بين العمليات الشائكة والعرضية من T11 إلى L1. ملاحظة: إذا لمست القفازات أو الأدوات فراء أو جلد ، فأعد تنظيف القفازات أو الأداة باستخدام معقم بارد مثل 90٪ إيثانول أو Germ-X.
- تعليق الماوس في الشوكة الشوكية التجسيمية - ابدأ بتثبيت الشوكة الشوكية العلوية اليمنى في موضعها. أمسك T11 باستخدام ملقط Adson وضع العملية المستعرضة T11 فوق الشوكة الشوكية الثابتة. أثناء تثبيت الفقرة في مكانها ، اربط الشوكة الشوكية المقابلة تحت العملية العرضية المقابلة.
- باستخدام نفس الإجراء المتبع في الخطوة 2.4 ، ضع L1 داخل الشوكة الشوكية.
- باستخدام مشرط (رقم 23) ، اكشط العضلات برفق بين العمليات الشائكة والعرضية من T11 إلى L1 بحيث تكون الصفيحة مرئية بوضوح. للحصول على رؤية أفضل لباديكلات T11 ، قم بقطع الوتر البارز بشكل مستقيم من طرف العملية المستعرضة.
- اشطف الدبابيس المعدلة باستخدام PBS ، وأدخل أطراف الدبابيس الجانبية إلى العنقيق الفقرية ل T11 و L1 مع ضبط المسافة بين الأطراف بحيث تلامس العنق برفق.
ملاحظة: استخدم فقط PBS الذي يحتوي على ديكساميثازون (0.1٪) ، والبنسلين (1,000 وحدة / مل) ، والستربتومايسين (1 مجم / مل) ، لتقليل الالتهاب بعد الجراحة وتحسين وضوح النوافذ.
قم - بلصق الدبابيس في مكانها بقطرة صغيرة من cyanoacrylate في كل نقطة إدخال وإزالة الماوس من الشوكات الشوكية.
- ضع طبقة رقيقة من السيانواكريليت على الحواف المقطوعة للجلد والعضلات المكشوفة حول الفقرات التي تم تطهيرها مع الحرص على عدم لصق الفقرات. ثني أطراف مشبك الورق المعدل بحيث تدخل تحت الأقسام البارزة من الدبابيس المزروعة وتستريح بالتوازي مع المحور الطويل للعمود الفقري المعزول وتترك في هذا الموضع.
- بدءا من واجهة الجلد والعضلات ، ضع عدة طبقات من الأسمنت السني لتغطية الفتحة بأكملها باستثناء الفقرات المكشوفة ، مع التأكد من زرع مشبك الورق بإحكام داخل أسمنت الأسنان.
- بمجرد معالجة الأسمنت السني (5-15 دقيقة) ، قم بتوصيل الماوس ب "حامل المشبك" بواسطة الجزء المكشوف من مشبك الورق المزروع. باستخدام الملقط ، قم بإزالة العضلات والأنسجة الرخوة الأخرى بين العمليات الشوكية والصفيحة في الفقرات المكشوفة.
ملاحظة: يمكن استخدام أي جهاز يمكنه الإمساك بالجزء المكشوف من مشبك الورق بإحكام دون التسبب في إجهاد المشبك / الغرفة ، ويمكن المناورة لإعادة توجيه الماوس طوال الجراحة ك "حامل مشبك". - باستخدام مثقاب إزالة العظام ، قم بتخفيف الصفيحة من T12 و T13 بشكل ثنائي. لإزالة العظم الظهري ، أمسك العملية الشائكة بالملقط الحاد وارفعها مع الحرص على عدم تطبيق أي قوة هبوطية باتجاه الحبل الشوكي. إذا لم يختف العظم بسهولة ، فاستمر في ترقق الصفيحة حتى يمكن إزالة العملية الشائكة بسهولة.
- باستخدام مثقاب إزالة العظام ، استمر في تشكيل الحواف الجانبية للفقرات لتشكيل هيكل دعم للنافذة. قم بإزالة جميع شظايا العظام الصغيرة التي تلامس الأم الجافية برفق باستخدام ملقط حاد. تأكد من الحفاظ على رطوبة الأم الجافية باستخدام PBS.
- اختر إحدى النوافذ المعدة التي تكون أعرض قليلا من فتحة استئصال الصفيحة الفقرية واختبر مدى ثباتها على العظم المكشوف. من الناحية المثالية ، ستستقر النافذة بشكل ثنائي على كلتا الفقرتين بحيث يلامس منتصف النافذة الأم الجافية (الشكل 1 أ). ومع ذلك ، يجب ألا تضغط النافذة على الحبل الشوكي حتى عند دفع النافذة نحو الحبل الشوكي. إذا كانت النافذة غير متوازنة أو تقع فوق الجافية ، فكرر الخطوة 2.13.
- بمجرد الرضا عن استئصال الصفيحة الفقرية ، ضع قطعة صغيرة من المناديل الورقية المعقمة المنقوع في PBS على الحبل الشوكي لمنع جفاف الجافية ووضع الفأر جانبا.
- تنظيف النافذة - ضع النافذة في محلول منظف النوافذ لعدة ثوان. باستخدام قطعة من مناديل عدسة المجهر، امسح النافذة حتى تجف. باستخدام المجهر الجراحي تحقق من نظافة النافذة ، وكرر عملية التنظيف إذا لم يكن كذلك. ضع النافذة في منطقة نظيفة مع سهولة الوصول إليها لاسترجاع النافذة ووضعها بسرعة في الخطوة 2.19.
- استرجع الماوس وأزل المناديل الورقية. قم بإزالة أي حطام برفق من الجافية باستخدام ملقط حاد واترك الجافية تجف حتى تصبح لزجة قليلا.
- املأ أنبوب خلاط السيليكون (Kwik-sil) بسرعة وبثق السيليكون على شريحة نظيفة حتى لا تخرج فقاعات من الحافة. قم بإعطاء حبة صغيرة من السيليكون على الفور على طول خط الوسط للحبل الشوكي المكشوف.
- استرجع النوافذ التي تم تنظيفها باستخدام ملقط حاد وضعها على الفور فوق السيليكون. باستخدام الملقط الحاد ، قم بالضغط على النافذة لنشر السيليكون على حواف النافذة وتثبيته في مكانه لمدة ~ 1 دقيقة < / > ملاحظة: قبل الخلط ، يجب تخزين السيليكون في درجة حرارة أقل من 27 درجة مئوية وإلا يمكن أن يزيد وقت العلاج بشكل كبير ولن يلتصق بالنافذة أو الأم الجافية مما يؤدي إلى انخفاض الوضوح البصري.
- حرر الضغط ببطء من النافذة. إذا لم تتحرك النافذة، فانتقل على الفور إلى الخطوة 2.21. ومع ذلك ، إذا ارتفعت النافذة عند تحرير الضغط (أي تحرك الفقرات) ، فانتقل إلى الخطوة 2.21 مع الحفاظ على الضغط على النافذة لتثبيتها في مكانها.
- تطبيق cyanoacrylate منقاري وذيلية من النافذة. إذا كان السيانواكريلات لا يغطي الحواف المنقارية والذيلية للنافذة ، فاستخدم عود أسنان لتوجيه بعض السيانواكريلات السائل فوق هذه الحواف. بعد ذلك ، قم بتوجيه الغراء على طول الحواف الجانبية للنافذة (الشكل 1 أ) لتغطية جميع العضلات المحيطة. ملاحظة: يجب أن يغطي السيانواكريليت سطح الحواف الخارجية للنافذة. يمكن أن يؤدي الكثير من السيانوا أكريلات إلى الإضرار بالوضوح البصري ، ولن يؤدي ما يكفي من السيانوا أكريلات إلى ظهور فقاعات هواء بين السيليكون والنافذة.
- لحماية السيانواكريلات وزيادة السلامة الهيكلية للغرفة ، ضع أسمنت الأسنان على جميع المناطق المغطاة بالسيانواكريلات (الشكل 1 أ). كما هو الحال مع السيانواكريلات ، ابدأ من الحواف المنقارية والذيلية واستخدم عصا خشبية صغيرة لتوجيه الأسمنت السني على طول حواف النافذة.
3. رعاية ما بعد الجراحة ، وتحريض EAE ، وصيانة النوافذ
- حقن ديكساميثازون (0.2 مجم / كغ) وريماديل (5 مجم / كغ) على مناطق الحوض. انقل الماوس إلى قفص دافئ (~ 26 درجة مئوية) مع مادة التعشيش. يجب أن تكون الفئران متحركة بالكامل ، وتستكشف قفصها ، وتعتني بعد أن تهدأ آثار التخدير تماما (عادة 2-3 ساعات). المنزلية بشكل فردي وتأكد من سهولة الوصول إلى الطعام والماء لأول 1-2 أيام. بمجرد أن يبدأ الفأر في التعافي من التخدير ، قم بحقن البوبرينورفين (0.05 مجم / كجم) s.q. بعد الشفاء التام من التخدير ، يجب ألا تظهر على الفأر أي علامات للألم. ملاحظة: بمجرد التعافي التام من التخدير ، تشير أي علامات للألم أو النشاط الحركي غير الطبيعي إلى أن النافذة لم يتم زرعها بشكل صحيح.
- حقن ديكساميثازون (0.2 مجم / كجم) وريماديل (5 مجم / كجم) كل 2 يوم لأول 10 أيام بعد الجراحة (الشكل 1 أ). لحقن الفئران بالنوافذ ، قم بتخدير برفق مع الأيزوفلوران في غرفة الحث (~ 1.75٪ إيزوفلوران في الهواء لمدة 1-2 دقيقة). أخرج الماوس من الغرفة وحقن الأدوية على الفور. يجب أن يكون الماوس مستيقظا تماما في <1 دقيقة < / > ملحوظة: لا تقم بتقطيع الفئران ذات النوافذ المزروعة لأن ذلك قد يتسبب في انفصال الجلد عن الغرسة. من الممكن حقن الفئران بدون تخدير عن طريق السماح لها بالامسك بغطاء القفص بأقدامها الأمامية ورفع أطرافها الخلفية برفق. ومع ذلك ، في هذا الوضع ، يبتعد الماوس أحيانا مما يتسبب في الضغط على النافذة المزروعة. يمكن أن يؤدي ذلك إلى نزيف بين النافذة والحبل الشوكي ، مما يضر بالوضوح البصري.
- يمكن إحداث EAE بعد 2-3 أسابيع من التوقف عن العلاج المضاد للالتهابات (~ 3-4 أسابيع بعد الجراحة). قم بتخدير الماوس برفق كما هو موضح في الخطوة 3.2. أخرج الماوس من حجرة الحث وحافظ على التخدير باستخدام قناع الأيزوفلوران الموضوع على الأنف.
- حقن الببتيد MOG35-55 (75 ميكروغرام في مساعد فرويند الذي يحتوي على 800 ميكروغرام من المتفطرة السلية) في 3 مواقع مختلفة (ثنائيا فوق عظم الفخذ ، وعند قاعدة الذيل) ، وسم السعال الديكي (400 نانوغرام) i.p.14،15
ملاحظة: تتطلب الفئران المصابة ب EAE رعاية تكميلية مقارنة بالفئران ذات النوافذ فقط. قم بوزن الفئران EAE كل يوم وتأكد من سهولة الوصول إلى الطعام والماء في جميع الأوقات. مكمل غذائي يحتوي على هلام الاغاروز بنسبة 3٪ للحفاظ على ترطيب ووزنها. يمكن أيضا إضافة الجلوكوز (1-3٪) إلى الهلام للحصول على سعرات حرارية إضافية. - بعد يومين من تحريض EAE ، كرر بروتوكول التخدير الموضح في الخطوة 3.2 وحقن جرعة ثانية من سم السعال الديكي (400 نانوغرام) في الداخل الصوري.
- لتصوير الحبل الشوكي ، قم أولا بتخدير كما هو موضح في الخطوة 3.2 ، وقم بتخديره برفق باستخدام الكيتامين / الزيلازين (100 مجم / كجم ؛ 10 مجم / كغ) IP. سيوفر هذا ~ 1 ساعة من التصوير.
- بالنسبة لجلسات التصوير التي تستغرق <2 ساعة ، يمكن الحفاظ على التخدير الخفيف بالحقن التكميلية للكيتامين / الزيلازين (50 مجم / كجم ؛ 5 مجم / كجم) كل 45-60 دقيقة. بدلا من ذلك ، بالنسبة لجلسات التصوير الأطول ، يمكن تخدير الفئران باستمرار بالأيزوفلوران (0.75-1.25٪ إيزوفلوران في الهواء الرطب).
ملاحظة: يمكن تنظيف النوافذ تحت المجهر الجراحي عن طريق مسح الحطام برفق بزاوية منديل أو مسحة قطنية. لا تستخدم الكحول لتنظيف النافذة لأنه يمكن أن يؤدي إلى تدهور بعض أنواع أسمنت الأسنان ويمكن أن يبرد الحبل الشوكي. - بمجرد التخدير الخفيف ، يتم توصيل الماوس بإحكام بحامل المشبك بواسطة الجزء المكشوف من مشبك الورق المزروع (الشكل 1 ب).
- يتم محاذاة الحبل الشوكي بشكل عمودي على العدسة الشيئية عن طريق ضبط موضع المشبك داخل الحامل ، وضبط موضع الحامل ، وضبط موضع المرحلة. يتم تصوير السطح الظهري للحبل الشوكي بسرعة ، ويتم استخدام الأوعية الدموية الظهرية لتحديد اتجاه الحبل الشوكي.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
قد يكون استخدام النوافذ الزجاجية المزروعة بشكل مزمن بالاقتران مع المجهر ثنائي الفوتون الحي والمجسمات المرضية للتهاب الدماغ والنخاع التجريبي (EAE) أداة مفيدة لفهم الآليات الخلوية التي تكمن وراء باثولوجيا أمراض إزالة الميالين المناعية الذاتية. وباستخدام طريقة الزرع الخاصة بنا، وجدنا أن معظم النوافذ كانت صافية في وقت تحريض التهاب الدماغ والنخاع التجريبي، وظلت صافية طوال فترة تطور المرض (الشكل 1ج). ومن خلال هذا النهج، وجدنا أن النوافذ ظلت صافية طوال فترة ما بعد الزرع (المتوسط ~68 d±7 s.e.m.؛ العدد = 21 فأراً...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وصفنا طريقة لزرع النوافذ الزجاجية وصيانتها فوق الحبل الشوكي المكشوف للفئران البالغة لدراسة التقدم الديناميكي ل EAE بمرور الوقت. تم استخدام نهج مماثل لزرع النوافذ الزجاجية لدراسة نماذج إصابات الحبل الشوكي13 وقد يكون مفيدا أيضا لدراسة أمراض الحبل الشوكي الأخرى مثل الأورام الأرومية الدبقية أو التهاب السحايا أو فسيولوجيا الخلية للحبل الشوكي الطبيعي. بالنسبة لطريقتنا ، تم تحقيق التثبيت الفقري من خلال بناء هيكل خارجي حول أربع فقرات ثابتة بإحكام بينما كانت النافذة الزجاجية مثبتة على هذا الهيكل الخارجي. في هذه التجارب...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
< p class = "jove_content" >نشكر C. Ricard ، M-C. أمورو ، أ. جاوين ، و S. Meijia-Gervacio للمناقشات المفيدة. M. Hocine و C. Meunier ، وموظفو مرافق التصوير الحيواني و PicSIL التابعة ل IBDML للحصول على الدعم الفني. وحظي هذا العمل بدعم من منحة مؤسسية من المركز الوطني للبحوث العلمية، وبمنح من جمعية البحوث حول اللوحة (ARSEP) (إلى G.R. و K.K.F) والوكالة الوطنية للبحوث (ANR JCJC) و Fédération de Recherche sur le Cerveau (FRC) Institut de Recherche sur la Moelle Epinière (to FD). ك.ك.ف. تم دعمه من قبل زمالة ARSEP. تم إجراء التصوير على منشأة التصوير PIcSIL التابعة ل IBDML.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مثقاب إزالة العظام | العالمية أدوات الدقة | المثالية الحفر الصغير | يباع أيضا بواسطة Harvard Apparatus. أي مثقاب عظام جراحي عالي الجودة يكفي. |
| لدغ الحفر (# 1/4 أو 1/2 لدغ دائري كربيد) أدوات | الدقة العالمية | 501860 (# 1/4) 501860 (# 1/2) | تباع أيضا بواسطة Harvard Apparatus |
| Staples | Lyreco | 5.002.567 | Crown = 8 مم الساق = 4 مم |
| مشبك | أي مشبك ورق قياسي 25 مم | ||
| سائقي إبرة | أدوات العلوم الدقيقة | 12003-15 | |
| مقص | المناديلأدوات العلوم الدقيقة | 14028-10 | |
| ملقط Adson | أدوات العلوم | الدقيقة 11027-12 | 1 × 2 أسنان |
| ملقط حاد | أدوات العلوم | الدقيقة 11293-00 | |
| شوكات العمود الفقري | جهاز هارفارد | 724813 | |
| أسمنت الأسنان | GACD | 12-565 & 12-568 | |
| سيليكون المطاط | أدوات الدقة العالمية | KWIK-SIL | متاح أيضا من خلال Coherent Scientific و Fisher Scientific |
| Cyanoacrylate | Eleco-EFD | Cyanolit 201 | |
| Microscope | Zeiss | 7MP | المجهر الخاص بنا في تكوين عمودي ومجهز ب 5 كاشفات NDD. |
| العدسة الموضوعية | Zeiss | W Plan-Apochromat 20x / 1.0 DIC M27 75 مم | مسافة العمل = 1.8 مم |
المراجع
- Kim, J. V., Dustin, M. L. Innate response to focal necrotic injury inside the blood-brain barrier. J. Immunol. 177 (8), 5269-5277 (2006).
- Xu, H. -T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. -B. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nat. Neurosci. 10 (5), 549-551 (2007).
- Holtmaat, A., Bonhoeffer, T., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Dray, C., Rougon, G., Debarbieux, F. Quantitative analysis by in vivo imaging of the dynamics of vascular and axonal networks in injured mouse spinal cord. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (23), 9459-9464 (2009).
- Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal. 11 (5), 572-577 (2005).
- Ylera, B., Ertürk, A., et al. Chronically CNS-injured adult sensory neurons gain regenerative competence upon a lesion of their peripheral axon. Curr. Biol. 19 (11), 930-936 (2009).
- Dibaj, P., Nadrigny, F., et al. NO mediates microglial response to acute spinal cord injury under ATP control in vivo. Glia. 58 (9), 1133-1144 (2010).
- Dibaj, P., Steffens, H., et al. In Vivo imaging reveals distinct inflammatory activity of CNS microglia versus PNS macrophages in a mouse model for ALS. PloS One. 6 (3), (2011).
- Johannssen, H. C., Helmchen, F. In vivo Ca2+ imaging of dorsal horn neuronal populations in mouse spinal cord. J. Physiol. 588 (18), 3397-3402 (2010).
- Nikić, I., Merkler, D., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis). Nat. Med. 17 (4), 495-499 (2011).
- Di Maio, A., Skuba, A., et al. In vivo imaging of dorsal root regeneration: rapid immobilization and presynaptic differentiation at the CNS/PNS border. J. Neurosci. 31 (12), 4569-4582 (2011).
- Laffray, S., Pagès, S., Dufour, H., De Koninck, P., De Koninck, Y., Côté, D. Adaptive movement compensation for in vivo imaging of fast cellular dynamics within a moving tissue. PloS One. 6 (5), (2011).
- Fenrich, K. K., Weber, P., Hocine, M., Zalc, M., Rougon, G., Debarbieux, F. Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows. J. Physiol. 590 (16), 3665-3675 (2012).
- Kuerten, S., Angelov, D. N. Comparing the CNS morphology and immunobiology of different EAE models in C57BL/6 mice - a step towards understanding the complexity of multiple sclerosis). Ann. Anat. 190 (1), 1-15 (2008).
- Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. Eur. J. Immunol. 25 (7), 1951-1959 (1995).
- Farrar, M. J., Bernstein, I. M., Schlafer, D. H., Cleland, T. A., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted. Nat. Methods. , (2012).
- Moreno, B., Jukes, J. -P., et al. Systemic inflammation induces axon injury during brain inflammation. Ann. Neurol. 70 (6), 932-942 (2011).
- Lassmann, H., van Horssen, J. The molecular basis of neurodegeneration in multiple sclerosis. FEBS Lett. 585 (23), 3715-3723 (2011).
- Yenari, M. A., Han, H. S. Neuroprotective mechanisms of hypothermia in brain ischaemia. Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 267-278 (2012).
- Kalmbach, A. S., Waters, J. Brain surface temperature under a craniotomy. J. Neurophysiol. 108 (11), 3138-3146 (2012).
- Pérez-Nievas, B. G., García-Bueno, B., Madrigal, J. L. M., Leza, J. C. Chronic immobilisation stress ameliorates clinical score and neuroinflammation in a MOG-induced EAE in Dark Agouti rats: mechanisms implicated. J. Neuroinflammation. 7, 60 (2010).
- Bjartmar, C., Kidd, G., Mörk, S., Rudick, R., Trapp, B. D. Neurological disability correlates with spinal cord axonal loss and reduced N-acetyl aspartate in chronic multiple sclerosis patients. Ann. Neurol. 48 (6), 893-901 (2000).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
