يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

اختبار قابلية المضادات الحيوية الناجم عن الإجهاد على رقاقة

6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/50828

⸱

يناير 8, 2014

 ,  ,  ,  , 
1Fraunhofer USA Center for Manufacturing Innovation, 2Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 3Department of Mechanical Engineering, Boston University, 4Department of Biomedical Engineering, Boston University

في هذه المقالة

ملخص

لقد طورنا منصة microfluidic لاختبار قابلية المضادات الحيوية السريعة. يتم تمرير السوائل بسرعات عالية على البكتيريا التي شلت حركتها في الجزء السفلي من قناة microfluidic. في وجود الإجهاد والمضادات الحيوية ، تموت سلالات البكتيريا المعرضة بسرعة. ومع ذلك، يمكن للبكتيريا المقاومة البقاء على قيد الحياة هذه الظروف العصيبة.

الملخص

لقد طورنا طريقة ميكروفلويديك سريعة لاختبار قابلية المضادات الحيوية في بيئة قائمة على الإجهاد. يتم تمرير السوائل بسرعات عالية على البكتيريا التي شلت حركتها في الجزء السفلي من قناة microfluidic. في وجود الإجهاد والمضادات الحيوية ، تموت سلالات البكتيريا المعرضة بسرعة. ومع ذلك، البكتيريا المقاومة البقاء على قيد الحياة هذه الظروف العصيبة. الفرضية وراء هذه الطريقة جديدة: تنشيط الإجهاد للمسارات الكيميائية الحيوية، والتي هي أهداف للمضادات الحيوية، يمكن تسريع اختبار قابلية المضادات الحيوية. بالمقارنة مع طرق اختبار قابلية المضادات الحيوية القياسية ، يتم حذف الخطوة المقيدة للمعدل - النمو البكتيري - أثناء تطبيق المضادات الحيوية. ويندمج التنفيذ التقني للطريقة في مزيج من التقنيات المعيارية والنهج المبتكرة. وتشمل الأجزاء القياسية من هذه الطريقة بروتوكولات الثقافة البكتيرية، وتحديد قنوات microfluidic في البوليديميثيلسيلوكسيان (PDMS)، ورصد صلاحية الخلية مع الفلورسينس، ومعالجة الصور دفعة لعد البكتيريا. أجزاء مبتكرة من هذه الطريقة هي في استخدام تدفق وسائل الإعلام الثقافة لتطبيق الإجهاد الميكانيكية، واستخدام الإنزيمات لتلف ولكن ليس قتل البكتيريا، واستخدام الركائز microarray للتعلق البكتيري. يمكن استخدام المنصة المطورة في تطوير واختبار الأدوية ذات الصلة بالمضادات الحيوية وغير الحيوية. بالمقارنة مع تجارب التعليق البكتيري القياسية ، يمكن تشغيل تأثير الدواء وإيقافه مرارا وتكرارا خلال فترات زمنية خاضعة للرقابة. الملاحظة المتكررة لنفس السكان البكتيرية ممكنة على مدار التجربة نفسها.

المقدمة

يؤدي ظهور المقاومة البكتيرية إلى تكثيف الحاجة إلى اختبارات سريعة للحساسية للمضادات الحيوية القائمة على النمط الظاهري من أجل حماية أدويتنا الملاذ الأخير. وتستند اختبارات قابلية القياسية على تثبيط النمو البكتيري في وجود المضادات الحيوية التي تستغرق عدة (8-24) ساعات لإكمال. لقد طورنا اختبار قابلية جديدة للمضادات الحيوية على منصة microfluidic التي تعتمد على تنشيط الإجهاد من المسارات التركيب الحيوي لتسريع عمل المضادات الحيوية.

تحمل اختبارات قابلية المضادات الحيوية على مقياس microfluidic ميزة الاستخدام الفعال للعينة ، لأنها تتطلب أعدادا صغيرة من البكتيريا. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تكون أجهزة microfluidic متعددة من أجل اختبار عينات متعددة في ظل ظ....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. جعل طبقة PDMS (الشكل 1)

  1. مزيج PDMS بقوة وعامل علاج في نسبة 10:1. لإزالة الفقاعات، ديغا الخليط اللزج في غرفة فراغ لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  2. على مقياس، صب PDMS ببطء على قالب الألومنيوم. صب من المركز والحفاظ على القالب تسويتها. تأكد من ترك دبابيس كشف. توقف عن صب مرة واحدة يتم تحقيق الوزن المستهدف.
    يتطلب العفن لدينا 4 غرام من PDMS و 0.4 غرام من كاشف المعالجة.
  3. مستوى القالب داخل الفرن، وعلاج في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    أوقات المعالجة البديلة هي ساعتين عند 60 درجة مئوية أو ساعة واحدة عند 90 درجة مئوية.
  4. تشريح طبقة PDMS الشفاء على طول حافة القالب وتقشير بعناية الخروج من سطح العفن مع زوج من ملقط. ....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تظهر البيانات المعروضة في الشكل 4 استجابة سلالة المكورات العنقودية المردية المعرضة للخطر بمرور الوقت في قناة ميكروفلويديك تحتوي على المضادات الحيوية. تظهر صور تباين المرحلة المكتسبة في دقيقة واحدة وفي نهاية تجربة الساعة 1 في الشكلين 4A و B. تظهر بيانات الساعة 1 التي تم تحليلها في الشكل 4C مع البكتيريا المميزة باللون الأحمر (إجمالي 5,828). وتظهر الصور الفلورية المقابلة في الشكلين 4D و E. تظهر بيانات ال.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تم التحقق من صحة البروتوكول المقدم وتحسينه في مجموعة من التجارب مع سلالات المكورات العنقودية المقاومة للميثيسيلين والميثيسيلين10. لذلك ، يجب أن ينطبق هذا البروتوكول دون تعديل بشكل مباشر على سلالات أخرى من S. aureus والمضادات الحيوية الأخرى مع آليات العمل التي تؤثر على التمثيل الحيوي لجدار الخلية البكتيرية. أنواع البكتيريا الأخرى غير S. أوريوس قد تتطلب الاختلاف في المعلمات الإجهاد: قابل للذوبان (الأنزيمية) والضغوط الميكانيكية. إذا كانت عوامل الإجهاد القابلة للذوبان مرغوبة في اختبار ال.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الأسلوب microfluidic هو براءة اختراع معلقة: ساور بودج A, شارون A, كلاشنيكوف M, فيرز H, المخترعين; طريقة وجهاز للكشف السريع عن مقاومة المضادات الحيوية البكتيرية / براءة اختراع القابلية PCT/US10/33523.

شكر وتقدير

نشكر المهندسين والطلاب في مركز فراونهوفر للابتكار الصناعي. للمساعدة في تصميم، والآلات، والتشغيل الآلي للنظام التجريبي، ونحن نشكر أندرياس برينزن، هولغر فيرز، دوغ فوس، ديفيد شارجين، والدكتور سودونغ شو. نشكر جوليا كوكارتز وميلاني زيمرمان ونيكو كريتزمار وتيم غومبل وجوش فيلانويفا ومونوري شيميزو وكاتارزينا كوليغا للمساعدة في اختبار البروتوكولات التجريبية وجمع البيانات. نعترف بالدكتورتين آن كاربنتر ومارك أنتوني براي من منصة التصوير في المعهد العريض بجامعة هارفارد ومعهد ماساتشوستس للتكنولوجيا للمساعدة في تطوير روتين تحليل الصور في CellProfiler. تم دعم المشروع الموصوف جزئيا من خلال جوائز R21AI079474 و 1R01AI101446 من المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يمثل....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
SYTOX GreenInvitrogen CorporationS7020صبغة مضان الخلايا الميتة
ألبومين مصل الأبقار (BSA)Sigma Aldrich، IncA9418-5Gتستخدم لتخزين الليزوستافين
أسيتات الصوديومSigma Aldrich، IncS8750-500Gتستخدم لتخزين الليزوستافين
& nbsp ؛الخليةCRL309Aيصل ك1 ملغ صلب. للتخزين: يذوب في 20 ملي من أسيتات الصوديوم. تخلط مع محلول BSA للتركيز النهائي ل 1٪ BSA و 100 & micro ؛ جم / مل   ؛ الليزوستافين للتخزين 
ملح أوكساسيلينSigma Aldrich، Inc28221-1Gمضاد حيوي
Mueller Hinton BrothFisher ScientificDF0757-17-6
كلوريد الصوديومSigma AldrixhS3014-500G2٪ يضاف إلى مرق مولر هيلتون قبل التعقيم
1 مل ، حقنة Luer-lock   ؛BD (بيكتون وديكنسون وشربكة.)14-823-2F
2 أونصة ، حقنة قفل لورBD (بيكتون وديكنسون وشركات.)309653 - 60 ململء زائد إلى ~ 65 مل
مجهر
الفلور المقلوب أوليمبوس IX-70كامبريدج Scientific9349
60X ، مضان / هدف تباينالمرحلة Olympus Corp.LCPlan F1 60x / 0.70 Ph2
Retiga 12 بت كاميرا CCD أحاديةQImagingRET-4000R-F-M-12-C
أتمتة
مصاريع تباين الطور / مضانPREVIOUS ScientificH204 / H202
X / Y المرحلة  العلميالسابق H107AENN
التركيز PREVIOUS ScientificH122
عصا التحكم للتحكم في XYZPREVIOUS ScientificCS152EF
ProscanController PREVIOUS ScientificH3-XY2
Image Acquisition SoftwareFraunhofer CMI
Flow Cell Assembly و PDMS
Flow CellBU Scientific Instruments Facility / Fraunhofer CMI3333-1044تم إنتاج الرسومات الهندسية بواسطة Fraunhofer CMI
النافذة الزجاجيةFraunhofer CMI3333-1054تم قطع النافذة الزجاجية إلى الحجم المناسب في Fraunhofer CMI
BOROFLOAT Window 50 مم × 50 ممEdmund Optics Inc.NT48-543
لوحة الختمBU مرفق الأدوات العلمية3333-1045
شريحة زجاجية من الإيبوكسيدArrayit CorporationSuperEpoxy 2
PDMS masterFraunhofer CMI3333-1053Master تشكيله من الألومنيوم أو النحاس الأصفر مع UPM-0005 (آلة قطع الذبابة الفائقة)
تصميم شرائحPDMS Fraunhofer CMI3333-1053
الأنابيب
, سوبر شفة Tinytight, مقطوعة الرأس, 1/16 بوصة, نظرة خاطفة, أخضر استغلال مدخلات / مخرجات خلايا التدفقIDEX Health ScienceM-644-03
، Tinytight ، 1/16 بوصة ، 6-40 ، .030 بوصة TH ، نظرة خاطفة مع حلقة قفل SS ، صامولة أسودIDEX Health ScienceM-657
، سوبر بدون حواف صغير ، مقطوعة الرأس ، 1 / 16-1 / 32 بوصة ، 1 / 4-28 ، نظرة خاطفة ، IDEX HealthScienceالطبيعية P-255
الطويق ، Super Falngeless ، 1/16 بوصة ، Tefzel (ETFE) ، أصفرIDEX Health ScienceP-259يناسب أنبوب محول قفل
لور ، تفلون FEP ، .030 بوصة × 1/16 بوصة × 20 قدما ، أخضر & nbsp ؛IDEX Health Science1520G
، توصيل سريع للإناث Luer بالإناث 1 / 4-28 ، نظرة خاطفة ، أحمر & nbsp ؛آيدكس للعلوم الصحيةP-658
علوم اللون المجهرمحرك التركيز الجوز يتم لهذا الطويقمحول

المراجع

  1. Mairhofer, J., Roppert, K., Ertl, P. Microfluidic systems for pathogen sensing: a review. Sensors. 9, 4804-4823 (2009).
  2. Yager, P., et al. Microfluidic diagnostic technologies for global public health. Nature. 442, 412-418 (2006).
  3. Boedicker, J. Q., Li, L., Kline, T. ....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

اختبار الحساسية للمضادات الحيوية باستخدام الموائع الدقيقةتثبيت البكتيرياإجهاد معدل التدفق العاليمراقبة الحيوية بالفلورةالتصوير بتباين الطورتجميع خلية تدفق PDMSركائز التصاق البكتيرياحساب موت الخلايا المعياريالاختبار السريع للمضادات الحيويةالمسارات الكيميائية الحيوية المنشطة بالإجهاد
اختبار قابلية المضادات الحيوية الناجم عن الإجهاد على رقاقة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.