مقالة منهجية

إنتاج وتنقية النواقل المشتقة من الفيروس الغدي من النوع 2 من غير التكاثرية

DOI:

10.3791/50833

⸱

ديسمبر 3, 2013

 ,  ,  , 
1INSERM UMR 1043, CNRS UMR 5282, Université Toulouse 3, 2UMR Viroligie, INRA ENVA ANSES

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خلال السنوات ال 15 الماضية ، أثبتت النواقل المشتقة من الفيروس الغدي من النوع 2 (CAV2) كفاءتها في نقل الخلايا في المختبر وفي الجسم الحي وتستخدم على نطاق واسع للتطعيم والعلاج الجيني. وهنا نصف إجراء لبناء وإنتاج وتنقية نواقل CAV2، مما يؤدي إلى ظهور معلقات فيروسية عالية العيار.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_content" > تم استخدام النواقل المشتقة من الفيروس الغدي (Ad) على نطاق واسع لنقل الجينات على المدى القصير أو الطويل ، سواء للعلاج الجيني أو تطبيقات اللقاحات. بسبب المناعة المتكررة الموجودة مسبقا ضد الفيروس الغدي البشري المستخدم بشكل كلاسيكي من النوع 5 ، تم اقتراح الفيروس الغدي من النوع 2 (CAV2) كناقل بديل لنقل الجينات البشرية. توفر بيولوجيا CAV2 المميزة جيدا ، جنبا إلى جنب مع سهولة التلاعب الجيني ، مزايا كبيرة ، لا سيما لنقل الجينات إلى الجهاز العصبي المركزي ، أو لإحداث مجموعة واسعة من الاستجابات المناعية الوقائية ، من الخلط إلى المناعة الخلوية. في الوقت الحاضر ، يمثل CAV2 أحد أكثر الفيروسات الغدية غير البشرية جاذبية لاستخدامه كناقل لقاح. يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة لبناء وإنتاج ومعايرة متجهات CAV2 المؤتلفة. بعد استنساخ كاسيت التعبير عن الجين محل الاهتمام في بلازميد مكوكي ، يتم الحصول على البلازميد الجيني المؤتلف عن طريق إعادة التركيب المتماثل في بكتريا قولونية السلالة البكتيرية BJ5183. ثم يتم نقل البلازميد الجيني الناتج إلى خلايا الكلى التي تعبر عن جينات CAV2-E1 التكميلية (DK-E1). يتيح التضخيم الفيروسي إنتاج مخزون فيروسي كبير ، يتم تنقيته عن طريق الطرد المركزي الفائق من خلال تدرجات كلوريد السيزيوم وتحلية عن طريق غسيل الكلى. يحتوي المعلق الفيروسي الناتج بشكل روتيني على عيار يزيد عن 1010 جزيئات معدية لكل مل ويمكن إعطاؤه مباشرة في الجسم الحي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على مدى العقود الماضية ، أثبتت النواقل المشتقة من الفيروسات الغدية (Ads) فعاليتها في العلاج الجيني والتطعيم ، وكذلك في العلاج الفيروسي المحلل للأورام 1. الإعلانات هي فيروسات عشرية الوجوه غير مغلفة من عائلة Adenoviridae ، والتي تم عزلها عن الثدييات والطيور والزواحف والبرمائيات والأسماك. منذ اكتشافها في عام 1953 ، تمت دراسة Ads بشكل مكثف كنماذج لدراسة تفاعلات الفيروسات / الخلايا ، ومؤخرا ، كأنظمة توصيل جينية قائمة على النواقل 2. في الواقع ، توفر المتجهات المستندة إلى ADS العديد من المزايا ، مثل نطاق مضيفها الواسع وبيولوجيتها المميزة جيدا ، جنبا إلى جنب مع السهولة التي يمكن بها التلاعب بها وراثيا وتضخيمها للإنتاج على نطاق واسع.

من أجل التغلب على الصعوبات السريرية المتعلقة بالمناعة الموجودة مسبقا لدى البشر تجاه النواقل المشتقة من الإعلانات البشرية 3 ، بدأنا نحن وآخرون في اشتقاق نواقل من الإعلانات غير البشرية 4. بالإضافة إلى ذلك، يبدو أن نواقل الفيروسات الغدية غير البشرية أكثر تكيفا مع التطعيم الجماعي في الطب البيطري من الفيروس الغدي من النوع 5 (Ad5) المستخدم بشكل كلاسيكي، حيث ينبغي أن تكون أكثر امتثالا لمتطلبات السلامة والأمن أثناء تقييم المخاطر من قبل السلطات التنظيمية الوطنية. في أواخر التسعينيات ، وصفنا أول CAV2 المؤتلف كبديل غير بشري للنواقل المشتقة من Ad5 5. منذ ذلك الحين ، أكدت العديد من الدراسات إمكانات ناقلات CAV2 لنقل الجينات العلاجية أو المستضدية (للمراجعات 6،7). مثل الإعلانات الأخرى ، فإن النواقل المشتقة من CAV2 مستقرة ويمكن إنتاجها بعيار عال ، مما يسهل استخدامها في الجسم الحي. كما أنها آمنة ، لأنها ليست تكاملية ، على الرغم من أنها تسمح بالتعبير الجيني المعدل وراثيا طويل الأمد في الجسم الحي (>1 سنة) 8. بشكل ملحوظ ، وأفضل من الأنماط المصلية للإعلانات البشرية ، فقد ثبت أن نواقل CAV2 شديدة التوجيه العصبي ، مع انتقال رجعي فعال للغاية في المحاور 9،10. جلبت هذه الخاصية الجوهرية فكرة استخدام ناقلات CAV2 المؤتلفة لنقل الخلايا العصبية لمناطق معينة من الدماغ يصعب الوصول إليها من قبل ناقلات الفيروسات العسقرية ، والتي تستخدم حتى الآن بشكل شائع لنقل الجينات إلى الجهاز العصبي المركزي 11.

هنا ، نصف بروتوكولا بسيطا وكلاسيكيا لبناء وإنتاج وتنقية نواقل CAV2 غير المتكررة المشتقة من سلالة مانهاتن. يتم إنشاء جينومات CAV2 المؤتلفة عن طريق استنساخ الجين المطلوب محل الاهتمام (GOI) في كاسيت في اتجاه مجرى الفيروس المضخم للخلايا (CMV) المروج المبكر ، والذي يوفر تعبيرا في كل مكان. تتمتع ناقلات CAV2 بقدرة استنساخ ~ 4.2 كيلو بايت ، مما يسمح بالتعبير عن الحمض النووي (ك) الكبير. في الخطوة الثانية ، يتم إدخال كاسيت التعبير هذا عن طريق إعادة التركيب المتماثل بدلا من منطقة E1 من جينوم CAV2 ، مما يؤدي إلى فيروس غير متماثل (dlE1) ، كما هو موضح في البداية من قبل Chartier et al. 12 أخيرا ، يتم إنتاج الجسيمات الفيروسية عند تعدي البلازميد الجيني إلى خط خلايا الكلى للكلاب التي تعبر عن CAV2-E1 (DK-E1) ويتم تضخيمها بشكل متسلسل قبل تركيز وتنقية المخزونات الفيروسية. تستخدم الطريقة الموضحة هنا طردا مركزيا فائقا من خطوتين في تدرجات كلوريد السيزيوم (CsCl) ، مما يتيح تخصيب الجسيمات المعدية ذات العيار النهائي المرتفع (عادة أكثر من 1010 جزيئات معدية لكل مل). ثم يتم تحلية المعلق الفيروسي بواسطة الكروماتوغرافيا من خلال أعمدة Sephadex G-25 التي يمكن التخلص منها بحيث تكون في النهاية نقية بما يكفي لاستخدامها مباشرة في الجسم الحي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
فئة

1. بناء بلازميد جينوم CAV2 غير التكراري

ملاحظة: تم وصف جميع البلازميدات الموضحة في هذا البروتوكول سابقا7 وهي متوفرة عند الطلب.

  1. استنساخ GOI في بلازميد pShuttle ، باستخدام إنزيمات التقييد المناسبة ، لتوليد pShuttle-GOI (الشكل 1 أ).
  2. ملخص 2 ميكروغرام من pShuttle-GOI بواسطة AscI / PacI. يطلق الهضم جزء Shuttle-GOI (~ 2.9 كيلو بايت + تسلسل GOI ORF) من العمود الفقري البلازميد (2.8 كيلو بايت في الدقيقة).
  3. قم بتنقية جزء Shuttle-GOI بعد الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز ، باستخدام NucleoSpin Gel ومجموعة تنظيف PCR.
  4. في موازاة ذلك ، قم بهضم 1 ميكروغرام من البلازميد الجيني pCAV2 بواسطة SwaI. يحتوي بلازميد pCAV2 على موقع SwaI فريد يقع داخل منطقة E1 (الشكل 1 ب). قم بتعطيل إنزيم التقييد هذا بالحرارة عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  5. تحويل بكتريا قولونية مختصة بكتيريا BJ5183 مع 500 نانوغرام من جزء المكوك GOI المنقى و 100 نانوغرام من البلازميد pCAV2 الخطي لإعادة التركيب المتماثل (Figure 1B). يوزع على أطباق LB-Amp. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 20 ساعة على الأقل.
  6. قم بإجراء تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل مباشرة على المستعمرات البكتيرية باستخدام مزيج EmeraldAmp الرئيسي مع بادئات أمامية (5'-CACGAGGCCCTTTCGTCTTCAA-3') وخلفية (5'-GCGGTAGTTTATCACAGTTAATTGC-3') ، في ظل ظروف ركوب الدراجات التالية: 10 دقائق عند 95 درجة مئوية (لدورة واحدة) ، 95 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ؛ 58 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ؛ 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة / كيلو بايت (لمدة 39 دورة) ، وأخيرا 5 دقائق عند 72 درجة مئوية. يتم تضخيم ناتج 1 كيلو بايت + تسلسل GOI ORF من المستنسخة الإيجابية pCAV-GOI ، بينما لا يمكن اكتشاف أي منتج PCR باستخدام المستنسخة السلبية.
  7. تلقيح مستعمرتين إيجابيتين على الأقل بين عشية وضحاها كل منهما في 5 مل رطل أمبير متوسط عند 37 درجة مئوية في شاكر (220 دورة في الدقيقة).
  8. استخراج الحمض النووي البلازميد باستخدام مجموعة البلازميد Nucleospin. قم بتحويل بكتيريا الإشريكية القولونية DH5α المختصة مع حصة من كل إعداد للحمض النووي. انشر التعليق البكتيري على ألواح LB-Amp واحتضنه طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
  9. تلقيح مستعمتين من كل استنساخ إيجابي طوال الليل في 3 مل LB-amp وسط عند 37 درجة مئوية في شاكر (220 دورة في الدقيقة). استخراج الحمض النووي البلازميد باستخدام مجموعة البلازميد Nucleospin.
  10. هضم الحمض النووي الناتج وبلازميد pCAV2 الأبوي (كعنصر تحكم) باستخدام NdeI. نمط تقييد pCAV2 الأبوي هو 14.8 كيلو بايت و 9 كيلو بايت في الثانية و 7.9 كيلو بايت و 1.6 كيلو بايت في الدقيقة. يتم إدراج كاسيت تعبير الحكومة العراقية داخل جزء 7.9 كيلو بايت ويحتوي على موقع NdeI واحد على الأقل ، أي موقع واحد في الكاسيت والمواقع المحتملة الموجودة في الحكومة العراقية.
  11. حدد الإنشاءات الإيجابية وانتقل إلى الخطوة 2 مع 2 على الأقل من المستنسخة المستقلة.
< p class = "jove_title" >2. تعداء بلازميد جينوم CAV2 المؤتلف إلى خلايا DK-E1

ملاحظة: النواقل غير التكاثرية المشتقة من CAV2 هي كائنات معدلة وراثيا مصنفة على أنها مستوى السلامة البيولوجية 2 (BSL-2) ، بينما يصنف استخدامها في النماذج الحيوانية على أنه BSL-1. يرجى استخدام تدابير الاحتواء ومعالجة النفايات المناسبة ، بما في ذلك معدات الحماية الشخصية ، والعمل تحت أغطية التدفق الصفحي BSL-2.

  1. قبل يوم واحد من التعدي ، قم بزرع خلايا DK-E1 على طبق من 6 آبار. تنمو الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2 ، في وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) مع نسبة عالية من الجلوكوز ، ويحتوي على 7٪ مصل ربلة الساق الجنينية المعطلة بالحرارة (FCS) ، و 1 ملي مولار بيروفات الصوديوم ، و 100 وحدة / مل بنسلين / 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين. يجب أن تكون الخلايا 70-80٪ ملتقية للتعداد.
  2. هضم 2 ميكروغرام من بلازميد pCAV-GOI مع AscI ، لتحرير التسلسل غير الفيروسي للبلازميد. تحقق من نمط التقييد الناتج عن طريق الرحلان الكهربائي لجل الاغاروز بنسبة 0.8٪. يجب أن ينتج عن الهضم جزء ~ 31 كيلو بايت يحتوي على الجينوم المؤتلف وجزء 2 كيلو بايت يتوافق مع العمود الفقري للبلازميد.
  3. امزج الحمض النووي المهضوم مع 200 ميكرولتر من Jet Prime Buffer عن طريق الدوامة لمدة 10 ثوان. أضف 4 ميكرولتر من Jet Prime واخلطه عن طريق الدوامة لمدة 10 ثوان. قم بالتدوير لفترة وجيزة لإزالة القطرات واحتضانها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  4. أضف مزيج التعداء بالتنقيط على الخلايا. رج الأطباق برفق لتوزيع المزيج بالتساوي واحتضانه عند 37 درجة مئوية.
< p class = "jove_title" >3. انتشار CAV2 المؤتلف

  1. بعد أسبوع واحد من التعداء ، اجمع الخلايا ووسط الثقافة في أنبوب بولي بروبيلين سعة 15 مل. قم بتعطيل الخلايا بثلاث دورات تجميد وذوبان (-80 درجة مئوية / 37 درجة مئوية) وقم بمسح المحللة عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 1,800 × جم.
  2. اجمع المادة الطافية وخزنها في درجة حرارة -20 درجة مئوية لانتشار الفيروس لاحقا.
  3. إصابة طبقة أحادية التقاء بنسبة 80-90٪ من خلايا DK-E1 المزروعة في بئر واحد من 6 آبار مع 0.5 مل من المادة الطافية المحتوية على الفيروس. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ، تحت تحريض خفيف. قم بإزالة اللقاح واستبدله ب 1.5 مل من DMEM الكامل الذي يحتوي على 5٪ FCS معطل حراريا.
  4. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 3-4 أيام. يجب مراقبة الخلايا يوميا لظهور تأثير الاعتلال الخلوي (CPE ، الأشكال 2 أ-ب). إذا لم يكن CPE واضحا مرئيا ، فقم بحصاد الخلايا بعد 4 أيام من الزراعة وكرر الخطوات 3.1-3.4.
  5. عندما يؤثر CPE الواضح على غالبية الخلايا ، عادة بعد 2-4 جولات تضخيم فيروسية ، اجمع الخلايا ذات وسط المزرعة وقم بالتجميد والذوبان 3x كما هو موضح أعلاه. يصيب 80-90٪ من خلايا DK-E1 المتقاربة المزروعة في ثلاثة أطباق لزراعة الأنسجة بقطر 10 سم ، باستخدام 0.5 مل من المادة الطافية المحتوية على الفيروس في كل مرة.
  6. بعد 3-4 أيام (عند اكتمال CPE) ، قم بحصاد الخلايا من هذه الأطباق مقاس 10 سم ، وقم بتعطيلها مرة أخرى بثلاث دورات تجميد وذوبان ، وقم بمسح المحللة عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 1,800 × جم ، وجمع المواد الطافية وتخزينها عند -20 درجة مئوية لتضخيم CAV2 على نطاق واسع.
فئة

4. تنقية CAV2 على نطاق واسع

  1. تصيب 80-90٪ من الطبقات الأحادية المتجمعة من خلايا DK-E1 المزروعة في أربعين طبقا لزراعة الأنسجة بقطر 10 سم. لكل طبق ، استخدم 0.1 مل من المادة الطافية المحتوية على الفيروسات المخففة في 1 مل من DMEM الكامل بدون FCS. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 3 إلى 4 ساعات تحت تحريض خفيف. أضف 5 مل من DMEM الكامل المكمل ب 5٪ FCS.
  2. احتضن لمدة 3 أيام. حصاد الخلايا المصابة من أطباق الأربعين 10 سم في أنابيب البولي بروبلين سعة 50 مل. خلايا الحبيبات عند 1,200 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وأعد تعليقها في 15 مل من وسط DMEM.
  3. تعطيل الخلايا بثلاث دورات تجميد وذوبان (-80 درجة مئوية / 37 درجة مئوية). قم بإزالة بقايا الخلية عن طريق الطرد المركزي عند 1,800 × جم لمدة 10 دقائق وتخزين المادة الطافية عند -20 درجة مئوية قبل تنقية الجسيمات الفيروسية.
  4. قم بإعداد تدرج CsCl متقطع في أنبوب فائق الوضوح سعة 14 مل. أولا ، صب 2 مل من محلول CsCl (1.40 جم / مل في محلول ملحي مخزن بالفوسفات) في قاع الأنبوب. ثم أضف ببطء 2 مل من محلول CsCl (1.25 جم / مل في محلول ملحي مخزن بالفوسفات) فوق المحلول الأول.
  5. قم بتحميل المادة الطافية الفيروسية بعناية أعلى تدرج CsCl. املأ الأنبوب بالزيت المعدني حتى 2-3 مم من الأعلى. جهاز طرد مركزي لمدة 1.5 ساعة عند 130,000 × جم و 18 درجة مئوية في دوار SW40 متأرجح.
  6. بعد الطرد المركزي ، يظهر شريطان أبيضان بوضوح عند الواجهة بين طبقتي محلول CsCl 2 (الشكل 2C). باستخدام إبرة 21 جم وحقنة ، اجمع الشريط السفلي الذي يحتوي على جزيئات CAV2 الناضجة عن طريق الثقب الجانبي. حاول قدر الإمكان تجنب جمع النطاق العلوي ، الذي يتوافق مع الجزيئات الفيروسية الفارغة.
  7. قم بإعداد تدرج مستمر من CsCl في أنبوب شفاف سعة 14 مل عن طريق خلط الجزيئات الفيروسية المجمعة بمحلول CsCl (1.34 جم / مل في محلول ملحي مخزن بالفوسفات). املأ الأنبوب بالزيت المعدني حتى 2-3 مم من الأعلى. جهاز طرد مركزي لمدة 18 ساعة عند 130,000 × جم و 18 درجة مئوية في دوار SW40 متأرجح.
  8. بعد الطرد المركزي ، اجمع الشريط الأبيض المحتوي على CAV2 بثقب جنبا إلى جنب باستخدام حقنة كما هو موضح أعلاه. مرة أخرى ، حاول تجنب جمع النطاق العلوي المتبقي. يجب أن يكون هذا أسهل في هذا التدرج المستمر ، الذي يفصل بين الشريطين بشكل أفضل. يجب ألا يتجاوز الحجم الإجمالي للتعليق الذي تم جمعه 2 مل.
  9. قم بموازنة عمود Sephadex G-25 PD-10 مع 30 مل من PBS.
  10. قم بتحميل التعليق الفيروسي وتخلص من التدفق.
  11. Elute مع كسور 500 ميكرولتر من PBS. اجمع الكسور 5-7 ، والتي تحتوي عادة على جزيئات CAV2 المحلاة. يمكن التعرف بسهولة على الكسور المحتوية على الفيروس لأنها لامعة. أضف 150 ميكرولتر من الجلسرين إلى 1.5 مل من معلق CAV2 واحفظه في حصص عند -80 درجة مئوية.

5. معايرة CAV2 عن طريق تخفيف نقطة

النهاية
  1. قم بإذابة كمية من الفيروس المنقى على الجليد وقم بإجراء تخفيفات متسلسلة بمقدار 10 أضعاف (تتراوح من 10-2-10-12) في DMEM الخالي من المصل.
  2. أضف 50 ميكرولتر من كل تخفيف فيروسي في 5 آبار من صفيحة 96 بئرا. أضف 1.5 × 104 خلايا DK-E1 في كل بئر. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 5 أيام.
  3. في اليوم 5 بعد الإصابة ، راقب مظهر CPE عن طريق الملاحظة المجهرية (الأشكال 2A-B). يتم تحديد العيارات المعدية على أنها جرعات متوسطة معدية لزراعة الأنسجة (TCID50) ، باستخدام الطريقة الإحصائية Reed and Muench13.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعتمد إنتاج ناقلات CAV2 المؤتلفة على تقنيات البيولوجيا الجزيئية الأساسية والهامة. فقبل إنتاج الناقلات الفيروسية، من الضروري بالفعل بناء جينوم CAV2 مؤتلف يحمل كاسيت تعبير للجين المنقول. تتضمن عملية البناء هذه خطوتين: أولاً، يتم استنساخ الجين المستهدف (GOI) في بلازميد مكوك ككاسيت تعبير (أي مع محفز وإشارة تعدد الأدينيلات). ويكون هذا العنصر الوظيفي محاطاً بتسلسلين جينوميين مشتقين من CAV2، يمثلان منطقتي إعادة التركيب في الاتجاه العلوي والسفلي (الشكل 1A). وفي خطوة ثانية، يتم إدراج كاسيت التعبير من الب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تسمح الطريقة البسيطة الموضحة هنا ، المقتبسة من تقنية Ad5 الموثقة جيدا ، بالإنتاج الفعال لناقلات CAV2 غير المتماثلة بسعة استنساخ نموذجية تبلغ ~ 4.2 كيلو بايت. فيما يتعلق باعتبارات الوقت ، عادة ما يتم إنشاء جينوم CAV2 المؤتلف في غضون أسبوعين ، في حين أن الأمر سيستغرق 5 أسابيع إضافية لتضخيم المعلقات الفيروسية وتنقيتها ومعايرةها.

على الرغم من أن إنتاج الدفعة الأولى من النواقل المشتقة من CAV2 قد يبدو مضيعة للوقت ، إلا أنه يجب التذكير بأن إنتاج CAV2 يتطلب فقط التعداء الأولي لبئر واحد من صفيحة مكونة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل ماليا من خلال منح من INSERM و CNRS و Fondation pour la Recherche Médicale و Agence Nationale pour la Recherche (ANR- 10-Blanc-1322) إلى D.G-D. البرنامج الإطاري السابع للمفوضية الأوروبية إلى B.K. تلقى MS مدعوما بزمالة ما بعد الدكتوراه من FRM (برنامج "Equipe FRM 2009"). تم دعم CB من خلال زمالة ما بعد الدكتوراه من UE ، بموجب اتفاقية المنحة رقم 245266 (Orbivac).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
إنزيمات التقييدNew England Biolabs
Polyplus114-01
DMEMGibco (Life Technologies)10567014
E. القولوني< / em> بكتيريا BJ5183Agilent200154
PD-10 عمود تحليةGE Healthcare17-0851-01
EmeraldAmp polymeraseTakaraRR320A
مجموعة البلازميد النيوكليوسبينMacherey-Nagel740558.250
NucleoSpin Gel و PCR Clean-upMacherey-Nagel740609.50
أنابيب 14 مل ، Ultra ClearBeckman344060
مجموعة تعداء Jet Prime المختلفة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kaufmann, J. K., Nettelbeck, D. M. Virus chimeras for gene therapy, vaccination, and oncolysis: adenoviruses and beyond. Trends Mol. Med. 18, 365-376 (2012).
  2. Curr, Topics Microbiol. Immunol. 343, 195-224 (2010).
  3. Zak, D. E., et al. Merck Ad5/HIV induces broad innate immune activation that predicts CD8(+) T-cell responses but is attenuated by preexisting Ad5 immunity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3503-3512 (2012).
  4. Paillard, F. Advantages of non-human adenoviruses versus human adenoviruses. Hum. Gene Ther. 8, 2007-2009 (1997).
  5. Ackermann, A., Guelzow, T., Staeheli, P., Schneider, U., Heimrich, B. Visualizing viral dissemination in the mouse nervous system, using a green fluorescent protein-expressing Borna disease virus vector. J. Virol. 84, 5438-5442 (2010).
  6. Bru, T., Salinas, S., Kremer, E. J. An update on canine adenovirus type 2 and its vectors. Viruses. 2, 2134-2153 (2010).
  7. Bouet-Cararo, C., et al. Canine adenoviruses elicit both humoral and cell-mediated immune responses against rabies following immunisation of sheep. Vaccine. 29, 1304-1310 (2011).
  8. Soudais, C., Skander, N., Kremer, E. J. Long-term in vivo transduction of neurons throughout the rat CNS using novel helper-dependent CAV-2 vectors. FASEB J. 18, 391-393 (2004).
  9. Deinhardt, K., et al. Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway. Neuron. 52, 293-305 (2006).
  10. Soudais, C., Laplace-Builhe, C., Kissa, K., Kremer, E. J. Preferential transduction of neurons by canine adenovirus vectors and their efficient retrograde transport in vivo. FASEB J. 15, 2283-2285 (2001).
  11. Peltekian, E., Garcia, L., Danos, O. Neurotropism and retrograde axonal transport of a canine adenoviral vector: a tool for targeting key structures undergoing neurodegenerative processes. Mol. Ther. 5, 25-32 (2002).
  12. Chartier, C., et al. Efficient generation of recombinant adenovirus vectors by homologous recombination in Escherichia coli. J. Virol. 70, 4805-4810 (1996).
  13. Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. 27, 493-497 (1938).
  14. Segura, M. M., Puig, M., Monfar, M., Chillon, M. Chromatography purification of canine adenoviral vectors. Human Gene Ther. Methods. 23, 182-197 (2012).
  15. Segura, M. M., et al. A real-time PCR assay for quantification of canine adenoviral vectors. Journal of virological. 163, 129-136 (2010).
  16. Fernandes, P., et al. Bioprocess development for canine adenovirus type 2 vectors. Gene Ther. , (2012).
  17. Rinne, A., Littwitz, C., Bender, K., Kienitz, M. C., Pott, L. Adenovirus-mediated delivery of short hairpin RNA (shRNA) mediates efficient gene silencing in terminally differentiated cardiac myocytes. Methods Mol. Biol. 515, 107-123 (2009).
  18. Huang, B., Kochanek, S. Adenovirus-mediated silencing of huntingtin expression by shRNA. Hum. Gene Ther. 16, 618-626 (2005).
  19. Tordo, N., et al. Canine adenovirus based rabies vaccines. Dev. Biol. 131, 467-476 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة