مقالة منهجية

في الجسم الحي إعادة برمجة الخلايا الجسدية البالغة إلى تعدد القدرات عن طريق الإفراط في التعبير عن عوامل ياماناكا

15K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/50837

⸱

ديسمبر 17, 2013

 ,  ,  , 
1Nanomedicine Lab, UCL School of Pharmacy, University College London, 2Nanomedicine Lab, Faculty of Medical & Human Sciences, University of Manchester

في هذه المقالة

ملخص

توضح هذه الدراسة إعادة برمجة الخلايا الجسدية نحو تعدد القدرات في الجسم الحي دون توليد الأورام المسخية. استخدمنا حقن وريد الذيل الهيدروديناميكي للحمض النووي البلازميدي الذي يشفر عوامل Yamanka للحث على إعادة البرمجة في الجسم الحي لخلايا الكبد البالغة في خلايا ذات قدرة معززة.

الملخص

توفر الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPS) الناتجة عن إعادة برمجة الخلايا الجسدية إلى حالة متعددة القدرات عن طريق التعبير القسري عن عوامل محددة فرصا جديدة للطب التجديدي. كانت هذه التطبيقات السريرية لخلايا iPS محدودة حتى الآن ، ويرجع ذلك أساسا إلى ضعف كفاءة منهجيات إعادة البرمجة الحالية وخطر خلايا iPS المتولدة لتكوين الأورام عند الزرع.

افترضنا أن إعادة برمجة الخلايا الجسدية نحو تعدد القدرات يمكن تحقيقها في الجسم الحي عن طريق نقل الجينات لعوامل إعادة البرمجة. من أجل إعادة برمجة الخلايا بكفاءة في الجسم الحي ، يجب التعبير عن مستويات عالية من عوامل النسخ Yamanaka (OKSM) في الأنسجة المستهدفة. يمكن تحقيق ذلك باستخدام نواقل جينية فيروسية أو غير فيروسية مختلفة اعتمادا على الأنسجة المستهدفة. في هذه الدراسة بالذات ، تم استخدام حقن الوريد الذيل الهيدروديناميكي (HTV) للحمض النووي البلازميد لإيصال عوامل OKSM إلى خلايا الكبد في الفئران. قدم هذا دليلا على إعادة البرمجة في الجسم الحي للخلايا الجسدية البالغة نحو حالة متعددة القدرات ذات كفاءة عالية وحركية سريعة. علاوة على ذلك ، لم يلاحظ أي تكوين ورم أو ورم مسخي في الموقع.

يمكن استنتاج أن إعادة برمجة الخلايا الجسدية في الجسم الحي قد تقدم نهجا محتملا للحث على تعدد القدرات المعزز بسرعة وكفاءة وأمان مقارنة بالبروتوكولات التي يتم إجراؤها في المختبر ويمكن تطبيقها على أنواع مختلفة من الأنسجة في المستقبل.

المقدمة

كانت المخاوف الأخلاقية بشأن استخدام الخلايا الجذعية الجنينية أحد القيود في تطوير أبحاث الخلايا الجذعية. ومع ذلك ، فإن اكتشاف ياماناكا وزملاؤه أن التعبير القسري لأربعة عوامل نسخ (وهي: Oct3/4 و Klf4 و Sox2 و c-Myc (OKSM)) يمكن أن يؤدي إلى إعادة برمجة الخلايا الجسدية في المختبر إلى خلايا متعددة القدرات ، تسمى الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPS) ، قد فتح فرصا جديدة. يعد نقل الجينات الفيروسي1-5 وغير الفيروسي6-10 ، ونقل السيتوبلازم البروتيني11،12 ، وتعداء miRNA13-16 من بين الطرق المختلفة المستخدمة اليوم لتوليد خلايا iPS. ومع ذلك ، فإن منهجيات إعادة البرمجة هذه تعاني من مشكلات مختلفة تقيد ترجمتها إلى العيادة ، مثل: أ) قيود شديدة في كفاءة إعادة برمجة الخلايا. ب) الاستخدام السائد للنواقل الفيروسية؛ ج) بروتوكولات طويلة ومتعددة الخطوات لظروف الاستزراع؛ و د) خطر الإصابة بالورم عن طريق زرع خلايا iPS المتولدة في المختبر 17-20.

يعد نقل الجينات لعوامل النسخ المحددة3-5 بواسطة الفيروسات القهقرية الطريقة الأكثر استخداما لإعادة برمجة الخلايا الجسدية. ومع ذلك ، فإنه يحتوي على مخاطر من إمكانية الطفرات الإدخالية ، والتنبيغ المستقر والتعبير الطويل الأمد للجين الورميالأولي 21،22. كما تم استكشاف ناقلات نقل الجينات غير الفيروسية مثل البلازميد DNA6،7،23 أو توصيل الحمض النووي الريبي10 باستخدام الجسيمات الشحمية أو التثقيب الكهربائي. على الرغم من أمانا مقارنة بالفيروسات ، إلا أن هذه النواقل توفر كفاءة نقل وإعادة برمجة محدودةبشكل كبير 24،25.

< p class = "jove_content"> واحدة من العقائد المركزية لهذا المجال الناشئ هي أن زرع خلايا iPS في الجسم الحي سيؤدي إلى تمايزها غير المنضبط وتشكيل كتلة شبيهة بالورم (ورم مسخي) ، تتكون من أنسجة مختلفة من الطبقات الجرثومية الثلاث المختلفة. لذلك ، تم تركيز مفهوم إعادة البرمجة إلى تعدد القدرات بشكل أساسي على التلاعب في المختبر بالخلايا الجسدية الأولية المستخرجة (الخلايا الليفية الأكثر شيوعا). ومع ذلك ، كما هو موضح أعلاه ، يعاني هذا المبدأ من بروتوكولات زراعة الخلايا الطويلة والمعقدة ، بما في ذلك جولات متعددة من العلاج (نقل الجينات ، وعوامل النمو ، والمضادات الحيوية ، ومضادات الأكسدة) التي قد تعزز في حد ذاتها مخاطر تكوين الورم المسخي أو أشكال أخرى من تكوين الأورام عند زرع الخلايا24-28.

نقترح أن إعادة برمجة الخلايا الجسدية البالغة في الجسم الحي عن طريق التعبير المفرط العابر لعوامل النسخ OKSM لا تؤدي إلى تكوين لاحق للأورام المسخية29. تعتمد طريقة تحقيق ذلك على تحقيق مستويات عالية من التعبير عن عامل النسخ داخل الأنسجة المستهدفة بأكثر الطرق أمانا. في هذه الدراسة ، اخترنا تقنية نقل الجينات الخالية من الفيروسات والتي ثبت أنها تستهدف الكبد بكفاءة من أجل إعادة برمجة الخلايا إلى تعدد القدرات في الجسم الحي. تتضمن هذه التقنية حقن وريد الذيل الهيدروديناميكي السريع (HTV) بالحجم الكبير للحمض النوويالبلازميد 30،31. يمكن تحقيق مستويات عالية من التعبير عن الجينات المنقولة في خلايا الكبد البالغة باتباع طريقة نقل الجينات غير الفيروسية هذه. علاوة على ذلك ، تقلل هذه التقنية من المخاطر المحتملة من استخدام النواقل الفيروسية (مثل الإدخال الجيني الدائم ، والطفرات الإدخالية).

البروتوكول

فئة

1. في الجسم الحي إعادة برمجة أنسجة الكبد عن طريق HTV إدارة pDNA

  1. اسمح لإناث الفئران Balb / C ، البالغة من العمر 6 أسابيع ، بالتأقلم مع منشأة لمدة أسبوع قبل إجراء أي إجراء.
  2. تحضير محلول ملحي بنسبة 0.9٪ في الماء المقطر وتصفية من خلال فلتر دقيق 0.22 ميكرومتر.
  3. قم بإعداد محلول يحتوي على 75 ميكروغرام pCX-OKS-2A و 75 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد pCX-cMyc في 1.5 مل 0.9٪ محلول ملحي لكل فأر. ملاحظه: يجب أن يكون إجمالي حجم الحقن بين 8-10٪ من إجمالي وزن الجسم.
    ملاحظة: قبل الحقن ، احتفظ بالفئران في غرفة تسخين عند 37 درجة مئوية حتى يمكن رؤية أوردة الذيل بسهولة وتظهر متوسعة
  4. تحفيز التخدير مع الأيزوفلوران قبل (في غرفة التسخين) وأثناء الحقن (باستخدام قناع مخدر).
  5. قم بإدارة محلول pDNA أو التحكم في المحلول الملحي بحقنة 27 جم عن طريق حقن HTV. ملاحظة: لكي ينجح الإرسال ، يجب حقن الحجم الكلي في مدة لا تزيد عن 5-7 ثوان.
  6. راقب أن تتعافى بشكل صحيح من الحقن.
فئة

2. نضح الكبد وعزل خلايا الكبد الأولية لدراسات qRT-PCR

  1. في نقاط زمنية مختلفة بما في ذلك 2 و 4 و 8 و 12 و 24 يوما بعد حقن HTV ، قم بتحفيز التخدير العميق باستخدام الأيزوفلوران.
  2. رش 70٪ من الإيثانول على بطن ، وقم بعمل شق عبر الجلد على خط الوسط البطني بمقص جراحي وقم بتشريح طبقة عضلات البطن لكشف الأحشاء
  3. قطع الحجاب الحاجز لفضح التجويف الصدري بالمقص وتثبيت الوريد الأجوف بملقط قفل
    4. .
  4. قم بإزاحة الأحشاء إلى اليمين وفصوص الكبد بحيث يمكن الوصول بسهولة إلى كل من الأجوف السفلي والوريد البابي.
  5. قم بتقشير الوريد الأجوف السفلي بقسطرة 22 جم وقطع الوريد البابي لتجنب الضغط الزائد.
  6. ابدأ التروية ب 10 مل من محلول HBSS (خالي من Ca2+ و Mg2+ ، مع البيكربونات) ، مسخن مسبقا عند 37 درجة مئوية. قم بتسخين المخزن المؤقت ببطء باستخدام حقنة 10 مل ، حتى يبيض الكبد (3 دقائق).
  7. استمر في التروية باستخدام Liver Digest Medium ، الدافئ مسبقا عند 37 درجة مئوية ، بمعدل تدفق 0.6 مل / دقيقة (لمدة 15 دقيقة) حتى ينتفخ الكبد ويصبح فضفاضا. ملاحظه: يمكن أن يؤدي الهضم المفرط والتروية إلى إتلاف خلايا الكبد أو الخلايا المعاد برمجتها.
  8. استمر في التجربة عند 4 درجات مئوية.
  9. قم بإزالة الكبد بالملقط بعد قطع الأربطة المنجلية والتاجية واغسله بوسط غسيل الخلايا الكبدية ، مع تمريره عبر مصفاة خلية 100 ميكرومتر للحصول على معلق الخلية.
  10. اجمع معلق الخلية في أنابيب سعة 50 مل واضبط الحجم على 15 مل باستخدام وسيط غسيل خلايا الكبد.
  11. جهاز الطرد المركزي لمعلق الخلية عند 50 جم لمدة 4 دقائق. حافظ على درجة الحرارة عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية (التي تحتوي على خلايا Kupffer والخلايا الظهارية) وأعد تعليق حبيبات الخلية (التي تحتوي على خلايا الكبد) في 10 مل من وسط غسل خلايا الكبد. ملاحظه: يجب إعادة تعليق حبيبات الخلية بعناية فائقة ، فخلايا الكبد هي خلايا هشة للغاية.
  12. كرر إجراء الطرد المركزي لمدة ثلاث مرات وأعد تعليق الحبيبات النهائية في 10 مل من وسط غسيل خلايا الكبد.
  13. تقدير عدد الخلية باستخدام مجهر بصري ومقياس كثافة الدم.
  14. قم بإعداد كميات من 2 × 106 خلايا ، جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لاستعادة جميع الخلايا والتخلص من المادة الطافية.
  15. في هذه المرحلة ، يمكن تجميد حبيبات الخلية والاحتفاظ بها عند -20 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة أو استخدامها على الفور لاستخراج الحمض النووي الريبي.
< p class = "jove_title" >3. دراسة التعبير الجيني لخلايا الكبد المعزولة لتنظيم الجينات متعددة القدرات

  1. استخرج الحمض النووي الريبي من 2 × 106 خلايا باستخدام مجموعة عمود الدوران باتباع تعليمات المورد.
  2. استخدم 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي المستخرج لإجراء qRT-PCR من خطوتين باتباع تعليمات المورد.
  3. استخدم خلايا الكبد للحيوانات المحقونة بالمحلول الملحي كعنصر تحكم لتصحيح التعبير الجيني النسبي لإعادة البرمجة ، وتعدد القدرات ، وعلامات خلايا الكبد.
فئة

4. تحليل قياس التدفق الخلوي لتعزيز تعدد القدرات على مستوى البروتين

  1. في اليومين 1 و 4 بعد الحقن ، قم بإجراء نضح الكبد وعزل خلايا الكبد الأولية كما هو موضح أعلاه.
  2. اضبط كثافة الخلية على 1 × 107 خلايا / مل وقم بإعداد 100 ميكرولتر من الحصص الصغيرة.
  3. قم بإصلاح الخلايا باستخدام المخزن المؤقت لتثبيت BD Cytofix ونفاذها باستخدام 1x BD Perm / Wash buffer.
  4. احتضان الخلايا إما ب OCT4-PerCP-Cy5.5 المضاد للفأر أو Nanog-PE المضاد للفأر لمدة 30 دقيقة.
  5. قم بتضمين عناصر التحكم السلبية والنمط المتماثل.
  6. تحليل الخلايا الملطخة بواسطة مقياس التدفق الخلوي عالي الأداء للبحث CyAn ADP.
فئة

5. تلطيخ مناعي لأقسام الكبد لعلامات تعدد القدرات

  1. بعد أربعة أيام من الحقن، يتم بث الكبد كما هو موضح أعلاه ولكن فقط باستخدام المخزن المؤقت HBSS من أجل إزالة الدم من أنسجة الكبد.
  2. قم بقص قطعة من أنسجة الكبد واغمرها في 2-ميثيل بيوتان (مبرد مسبقا في النيتروجين السائل) لمواصلة التقطيع بالتبريد.
  3. يمكن الاحتفاظ بالأنسجة المجمدة عند -80 درجة مئوية أو تقطيعها مباشرة إلى أقسام بسمك 14 ميكرومتر باستخدام ناظم البرد.
  4. جفف أقسام الأنسجة بالهواء لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ثم قم بإصلاحها بالميثانول ، المبرد مسبقا عند -20 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. يجف في الهواء لمدة 15 دقيقة ثم يغسل الأقسام مرتين باستخدام PBS (5 دقائق لكل منهما).
  5. احتضان الأقسام في المخزن المؤقت المانع (5٪ مصل الماعز -0.1٪ تريتون في PBS pH 7.3) في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة ، متبوعة بخطوتان للغسيل مع مخزن الغسيل (1٪ BSA-0.1٪ Triton في PBS ، درجة الحموضة 7.3).
  6. احتضان أقسام الأنسجة طوال الليل عند 4 درجات مئوية باستخدام الأجسام المضادة الأولية المضادة ل OCT4 و anti-SOX2 ومضادة ل Nanog.
  7. في اليوم التالي ، اغسل الأقسام 3x (5 دقائق لكل منهما) بمحلول غسيل واحتضانها لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة باستخدام الجسم المضاد الثانوي.
  8. اغسل أقسام الكبد باستخدام PBS (3x ، 5 دقائق لكل منهما) وقم بتثبيتها في وسط يحتوي على DAPI ومضاد للبهتان.
  9. تصور الشرائح تحت مجهر epifluorescence.
فئة

6. تلطيخ الفوسفاتيز القلوي (ALP) لأقسام أنسجة الكبد

  1. الحصول على أقسام أنسجة الكبد كما هو موضح سابقا.
  2. قم بتسخين أقسام المناديل في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة قبل إجراء التلوين.
  3. إصلاح مع 4٪ بارافورمالدهايد لمدة دقيقتين. ملاحظة: يمكن أن يقلل وقت التثبيت المفرط من نشاط ALP.
  4. جفف الأقسام بالهواء لمدة 30 دقيقة ثم احتضانها بركيزة سائلة BCI / NBT عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  5. اغسل الشرائح بالماء المقطر وقم بتركيبها بوسائط تركيب مائية.
  6. التقط صورا عشوائية عن طريق المجهر الضوئي.
فئة

7. القياس الكمي لمستويات الألبومين وإنزيم الكبد في المصل لتقييم سمية الكبد

  1. في الأيام 4 و 8 و 12 و 120 بعد التعدي ، اجمع 300 ميكرولتر من الدم مباشرة من بطين القلب.
  2. احتفظ بالدم على الجليد أثناء جمع العينات المختلفة لتجنب التخثر.
  3. بمجرد أن تصبح جميع العينات جاهزة ، احتضنها لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية حتى تجلط الدم.
  4. جهاز الطرد المركزي للعينات عند 2,000 × جم لمدة 5 دقائق.
  5. قم بتقطيع المصل بعناية (في المادة الطافية) إلى أنبوب Eppendorf جديد وقم بتجميده عند -80 درجة مئوية حتى تتم معالجة العينات.
  6. تحليل مستويات المصل للزلاليم و ALT و AST و ALP و GLDH.
< p class = "jove_title" >8. الهيماتوكسيلين والإيوزين (H & E) والتلوين الدوري للأحماض والشيف (PAS) لأقسام الكبد لتقييم سمية الكبد

  1. في نقاط زمنية مختلفة ، بما في ذلك 2 و 4 و 8 و 12 و 24 و 50 و 120 يوما بعد حقن HTV ؛ إجراء تروية الكبد مع المخزن المؤقت HBSS فقط كما هو موضح سابقا.
  2. قطع قطعة من أنسجة الكبد وثبتها في 4٪ بارافورمالدهايد.
  3. قم بتضمين أنسجة الكبد في كتل البارافين ، والقسم والبقعة باستخدام تلطيخ H&E أو PAS.
  4. التقط صورا عشوائية عن طريق المجهر الضوئي.

النتائج

الشكل 1 يوضح نظرة عامة على الإجراء الذي يتضمن نقل الجينات الخاصة بالبلازميدات المشفرة لـ OKSM إلى كبد الفئران، والتقنيات المختلفة المستخدمة لملاحظة إعادة برمجة الخلايا in vivo. بعد حقن البلازميدات عن طريق HTV، لوحظت زيادة كبيرة في التعبير الجيني لعوامل إعادة البرمجة المنقولة (Oct3/4 وSox2 وKlf4 وcMyc) على مستوى mRNA في اليوم الثاني بعد الحقن. وينخفض التعبير عن هذه العوامل بمرور الوقت بعد الحقن، كما هو موضح في الشكل 2أ. وفيما يتعلق بالتعبير عن علامات تعدد القدرات الداخلية (Nanog وEcat1 وRex1)، فقد ارتفعت مستوياتها بشكل ملحوظ مقارنة بمستوياتها في الخلايا الكبدية للحيوانات التي حُقنت بمحلول ملحي في اليومين الثاني والرابع بعد الحقن، وعادت إلى مستوياتها المرجعية من اليوم الثامن فصاعداً (الشكل 2ب). وفي الوقت ذاته، تم تأكيد فقدان التمايز في مجموعة الخلايا الكبدية من خلال انخفاض التعبير عن الجينات الخاصة بالخلايا الكبدية (Alb وAat وTrf)، وهو انخفاض كان ذا دلالة إحصائية في اليوم الرابع ووصل إلى المستويات المرجعية من اليوم الثامن فصاعداً (الشكل 2د).

تَمَّ تقصي تعبير كل من Oct3/4 وNanog على مستوى البروتين باستخدام قياس التدفق الخلوي. وكما يظهر في الشكل 2جيتم التعبير عن Oct3/4 فقط في اليوم الأول بعد حقن HTV، بينما تطلب التعبير عن مؤشر تعدد القدرات الداخلي Nanog الانتظار حتى اليوم الرابع.

تم تأكيد حدوث إعادة برمجة الخلايا in vivo بشكل أكبر من خلال التحليل الكيميائي النسيجي المناعي لأنسجة الكبد باستخدام الأجسام المضادة anti-OCT4 وanti-SOX2 وanti-Nanog، ومن خلال صبغ محدد لنشاط ALP. وقد وُجدت الخلايا الإيجابية لجميع المؤشرات والنشاط الإنزيمي بشكل متكرر في أنسجة الكبد من الحيوانات التي حُقنت بـ OKSM، ولكن ليس في ضوابط المجموعة التي حُقنت بالمحلول الملحي (الشكل 3).

تم استقصاء الآثار الجانبية المحتملة للسمية وتكوّن الورم المسخي الناتج عن إعادة برمجة الخلايا in vivo عن طريق حقن pDNA بواسطة HTV، وذلك من خلال قياس مستويات إنزيمات الكبد في المصل، بالإضافة إلى صبغ مقاطع من أنسجة الكبد بصبغتي H&E وPAS على مدار فترة 120 يوماً. لوحظت علامات عابرة وغير شديدة لتلف الأنسجة حتى اليوم الثاني، ولكن ليس بعد ذلك. لم يتم رصد أي تكوّن للأورام المسخية أو أي علامة على خلل التنسج أو تغيرات شكلية طوال فترة الدراسة (الشكل 4). ولم تظهر أي تشوهات هيكلية أو وظيفية كبدية طوال فترة الدراسة في أي من الحيوانات، وهو ما تم تأكيده من خلال مستويات الألبومين وإنزيمات الكبد وصبغ الجليكوجين في مقاطع الأنسجة (الشكلان 4b وc).

حقن عوامل إعادة البرمجة في الجسم الحي، مخطط للفأر، بلازميد، تحليل الأنسجة، PCR، قياس التدفق الخلوي.
الشكل 1. نظرة عامة تخطيطية لإجراء إعادة البرمجة in vivo وتحليلها. يتضمن البروتوكول مرحلتين رئيسيتين: (i) إعطاء عوامل إعادة البرمجة in vivo و (ii) استخراج الأنسجة وتحليل العينات. انقر هنا لعرض الشكل بحجم أكبر.

تحليل التعبير الجيني؛ مخططات شريطية تظهر بيانات التعبير النسبي على مدار عدة أيام؛ الأشكال من a إلى d؛ نتائج علمية.
الشكل 2. فرط التعبير الجيني In vivo لعوامل نسخ ياماناكا في كبد الفئران البالغة. تم حقن فئران من سلالة Balb/C عبر الأوردة الكبدية (HTV) بمحلول ملحي 0.9% وحده، أو بـ 75 μg من pCX-OKS-2A و 75 μg من pCX-cMyc في محلول ملحي 0.9%، وفي الأيام 2 و 4 و 8 و 12 و 24، أُجري تحليل RT-qPCR للخلايا الكبدية لتحديد التعبير الجيني النسبي لـ: (a) عوامل النسخ المنقولة (OKSM) و (b) علامات تعدد القدرات الداخلية؛ (c) تحليل قياس التدفق الخلوي للخلايا الموجبة لـ OCT3/4 والخلايا الموجبة لـ Nanog؛ (d) التعبير الجيني النسبي لعلامات الخلايا الكبدية كما تم تحديده بواسطة RT-qPCR. تم تطبيع جميع مستويات التعبير الجيني بالنسبة لمجموعة الحقن بـ HTV بالمحلول الملحي. (* p<0.05 تشير إلى وجود فرق دال إحصائياً مقارنة بمجموعات الحقن بـ HTV بالمحلول الملحي، وتم الحصول عليها من خلال تحليل التباين واختبار Tukey للمقارنات الزوجية). تم تكييف الشكل من دراسة Yilmazer et al.29 انقر هنا لعرض الشكل بحجم أكبر.

مقارنة مجهرية بالفلورة المناعية لبروتينات OCT4 و SOX2 و NANOG في الخلايا المعالجة بالمحلول الملحي مقابل الخلايا المعالجة بـ OKSM.
الشكل 3. إعادة برمجة الخلايا In vivo في أنسجة كبد الفئران البالغة عن طريق الكيمياء النسيجية المناعية. فئران Balb/C تم حقنها عن طريق الوريد الكبدي (HTV) بمحلول ملحي 0.9% وحده، أو 75 μg من pCX-OKS-2A و 75 μg من pCX-cMyc في محلول ملحي 0.9%. في اليوم 4، تم جمع الأكباد وصبغ مقاطع نسيجية مجمدة باستخدام أجسام مضادة لـ anti-OCT4 أو anti-SOX2 أو anti-Nanog لتقييم التفاعلية المناعية، أو استخدام BCIP/NBT لتحديد نشاط ALP في النسيج (40X). تمثل أشرطة المقياس 100 μm. تم اقتباس الشكل من Yilmazer et al.29 انقر هنا لعرض الشكل بحجم أكبر.

نسيج الكبد، ومستويات الإنزيمات، والألبومين في المعالجة بالمحلول الملحي مقابل OKSM، نتائج التجربة.
الشكل 4. تأثير إعادة برمجة الخلايا in vivo على وظائف الكبد وعلم الأمراض النسيجي. فئران من سلالة Balb/C حُقنت عبر الوريد (HTV) إما بـ 75 μg من pCX-OKS-2A و 75 μg من pCX-cMyc في محلول ملحي 0.9% أو محلول ملحي 0.9% فقط. في الأيام 2، و4، و8، و12، و50، و120، تم عزل أنسجة الكبد والمصل ومعالجتها لـ: (أ) صبغ H&E؛ (ب) مستويات إنزيمات الكبد؛ (ج) مستويات الألبومين؛ (د) صبغ PAS. تم التقاط الصور التمثيلية باستخدام المجهر الضوئي (10X). تمثل أشرطة المقياس 100 μm. الشكل مقتبس من Yilmazer et al.29 انقر هنا لعرض شكل أكبر.

المناقشة

تقدم هذه الدراسة دليلا على المبدأ على إعادة برمجة الخلايا في الجسم الحي نحو تعدد القدرات بعد النقل الفعال والإفراط في التعبير عن عوامل OKSM إلى كبد الفأر البالغ. بمساعدة تقنيات مختلفة مثل qRT-PCR أو قياس التدفق الخلوي أو IHC أو تحليل المصل ، تم فحص الأنسجة المستهدفة لمراقبة إعادة برمجة الخلايا في الجسم الحي . بسرعة كبيرة من تحريض الإفراط في التعبير عن عامل OKSM في الأنسجة ، تم تنظيم علامات تعدد القدرات عند مستويات mRNA والبروتين (في غضون 48 ساعة). خلال هذه التجارب ، تبين أن ما بين 5-15٪ من الخلايا المستخرجة من الأنسجة إيجابية Nanog و Oct3 / 4. علاوة على ذلك ، لم يلاحظ أي تشوهات هيكلية أو وظيفية في الكبد طوال 120 يوما. تم الإبلاغ سابقا عن التعبير عن الجينات المحورة عن طريق حقن HTV للحمض النووي البلازميد في أنسجة أخرى غير الكبد (الرئة والطحال والكلى والقلب) ، ومع ذلك كانت مستويات التعبير الجيني أقل بمقدار 3 أوامر على الأقل من تلك الموجودة في خلايا الكبد30. تشير البيانات الواردة في هذه الدراسة إلى أن إعادة برمجة الخلايا الجسدية نحو حالة متعددة القدرات في الجسم الحي آمنة وسريعة وفعالة. في ضوء غالبية منهجيات إعادة برمجة الخلايا في المختبر الحالية التي تحقق بشكل عام توليد الخلايا متعددة القدرات (iPS) في غضون 3 أسابيع بأقل من 1٪ من الكفاءة32 ، قد توفر إعادة البرمجة في الجسم الحي لتعدد القدرات بدائل مثيرة للاهتمام للغاية. نفترض أن مفهوم إعادة البرمجة في الجسم الحي لتعدد القدرات يمكن تطبيقه على أنواع مختلفة من الخلايا الجسدية ذات الكفاءة العالية (اعتمادا على المتجه المستخدم) ، ولكن يجب تحديد مستوى تعدد القدرات الوظيفية الذي تم تحقيقه في الخلايا المعاد برمجتها في الجسم الحي . علاوة على ذلك ، مع تطوير البروتوكولات والتقنيات المحسنة ، يمكن استخراج الخلايا المعاد برمجتها في الجسم الحي واستخدامها لأغراض الطب التجديدي.

هناك بعض الخطوات الحاسمة التي يجب اتباعها من أجل إعادة برمجة الخلايا الجسدية البالغة في الجسم الحي بكفاءة عالية. يعد تحقيق مستويات عالية من التعبير الجيني في الأنسجة المستهدفة شرطا أساسيا. في هذه الدراسة ، تم توضيح ذلك من خلال استخدام النقل الفعال والتعبير عن الحمض النووي البلازميد إلى خلايا الكبد باستخدام حقن HTV. أهم عوامل حقن HTV هي الحجم ، والذي يجب أن يتراوح بين 8-10٪ من إجمالي وزن جسم ، وسرعة الحقن ، والتي يجب إجراؤها في غضون 5-7 ثوان. لا ينبغي استخدام الفئران التي يقل عمرها عن 6 أسابيع ، لأن حقن HTV يمكن أن يسبب المزيد من تلف الأنسجة في الكبد ، مما قد يؤثر على كفاءة إعادة البرمجة الخلوية. لم يكن للخلفية الجينية للحيوانات أي تأثير في تحديد كفاءة إعادة البرمجة في الجسم الحي ، حيث أبلغنا سابقا عن مستويات مماثلة من إعادة البرمجة في كل من فئران Balb / C و TNG-A ، والأخير عبارة عن سلالة معدلة وراثيا تحمل مراسل eGFP الذي تم إدخاله في موضع Nanog ويتم تربيته على خلفية Sv12929.

نتوقع أنه يمكن تطبيق إعادة برمجة الخلايا في الجسم الحي إلى حالة متعددة القدرات (التي يجب تحديدها) على أنواع الأنسجة الأخرى بشرط أن يتم تسليم عوامل OKSM بكفاءة إلى الخلايا المستهدفة ، مما يسمح بمستويات عالية من التعبير الجيني. تمت دراسة مجموعة متنوعة من نواقل توصيل الجينات غير الفيروسية والفيروسية في التجارب قبل السريرية والسريرية من أجل استهداف أنواع مختلفة من الخلاياوالأنسجة 33. على سبيل المثال ، بالنسبة للأنسجة العصبية أو العينية ، كانت الفيروسات المرتبطة بالغدة هي الخيار المفضل للناقلات لنقل الجينات الفعال في الجسم الحي 34-37 ، بينما في الأنسجة العضلية ، ثبت أن حقن الحمض النووي البلازميد العاري تؤدي إلى مستويات عالية نسبيا من التعبير الجيني38،39. لذلك ، يجب اختيار طريقة ناقل نقل الجينات بعناية اعتمادا على نوع الأنسجة من أجل تحقيق إعادة برمجة فعالة وسريعة للخلايا في الجسم الحي نحو حالة متعددة القدرات.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

< p class = "jove_content">تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل مجلس أبحاث العلوم الهندسية والفيزيائية (EPSRC ، سويندون ، المملكة المتحدة) وبرامج المفوضية الأوروبية FP-7 NANONEUROHOP (PIEF-GA-2010-276051) و ANTICARB (HEALTH-2008-20157). تم دعم AY من خلال منحة دكتوراه بدوام كامل من وزارة التربية والتعليم (تركيا) وتعترف IL بالدعم الجزئي من المجلس الثقافي البريطاني ومؤسسة CAIXA (إسبانيا). لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتحليلها أو قرار النشر أو إعداد المخطوطة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
pCX-OKS-2A pDNAAddgene19771تم الحصول عليها من Addgene كطعنة بكتيرية ، إنتاج البلازميد الذي تم إجراؤه في مصنع البلازميد (ألمانيا)
pCX-cMycAddgene19772تم الحصول عليه من Addgene كطعنة بكتيرية ، إنتاج البلازميد الذي تم إجراؤه في مصنع البلازميد (ألمانيا)
0.22 & mu ؛ مرشح mMillioporeSLGP033RS
IsofluraneAbbottB505
HBSS bufferSigma-AldrichH6648Ca2 + < / sup> و Mg2 + < / sup> مجانا ، مع بيكربونات
Liver Digest MediumGibco17703-034
خلايا الكبد متوسطGibco17704-024
100 & مو; مصفاة الخلايا mBD Biosciences352360
مجموعة Nucleospin RNA IIMacherey-Nagel740955.25Kit لعزل الحمض النووي الريبي عن الخلايا والأنسجة طقم
تخليق iScript cDNABio-Rad170-8890
iO SYBR Green SupermixBio-Rad170-8880
Oct3 / 4 التمهيدي الأماميسيجماالوارد في التعليقاتTGAGAACCTTCAGGAGATATGCAA
Oct3 / 4 التمهيدي العكسيتسلسل سيجماالوارد في التعليقاتCTCAATGCTAGTTCGCTCTCTTC
Sox2 التمهيدي الأماميتسلسل سيجماالوارد في التعليقاتGGTTACCTCTTCCCCCCACTCCAG
Sox2 التمهيدي العكسيتسلسل سيجماالوارد في التعليقاتTCACATGTGGCGACAGGGGCAG
C-myc التمهيدي الأماميتسلسل سيجماالوارد في التعليقاتCAGAGGAGGAACGAGCTGAAGCGC
C-myc التمهيدي العكسيتسلسل سيجماالوارد في التعليقاتTTATGCACCAGAGTTTCGAAGCTGTTCG
تسلسل سيجما التمهيدي الأمامي Nanogالمذكور في التعليقاتCAGAAAACCAACCAGTGGTTGAAGACTAG
Nanog التمهيدي العكسيتسلسل سيجماالمذكور في التعليقاتGCAATGGATGCTGGGATACTC
Ecat1 التمهيدي الأماميتسلسل سيجما مذكور في التعليقاتTGTGGGGCCCTGAAAGGCGAGCTGAGAT
Ecat1 التمهيدي العكسيتسلسل سيجماالمذكور في التعليقاتATGGGCCGCCATACGACGCTCAACT
Rex1 التمهيدي الأماميتسلسل سيجماالمعطى في التعليقاتACGAGTGGCAGTTTCTTCTTGGGA
Rex1 التمهيدي العكسيتسلسل سيجماالمعطى في التعليقاتTATGACTCACTTCCAGGGGGCACT
Alb التمهيدي الأماميSigmaالتسلسل الوارد في التعليقاتGTTCGCTACACCCAGAAAGC
Alb التمهيدي العكسيتسلسل سيجماالوارد في التعليقاتCCACACAAGGCAGTCTCTGA
Aat التمهيدي الأماميتسلسل سيجماالمعطى في التعليقاتCAGAGGAGGCCAAGAAAGTG
Aat التمهيدي العكسيتسلسل سيجماالوارد في التعليقاتATGGACAGTCTGGGGAAGTG
Trf التمهيدي الأماميSigmaالتسلسل الوارد في التعليقاتACCATGTTGTGGTCACGA
Trf التمهيدي العكسيتسلسل سيجماالوارد في التعليقاتACAGAAGGTCCTTGGTG
B الأكتين التمهيدي الأماميتسلسل سيجماالمعطى في التعليقاتGACCTCTATGCCAACACGT
B الأكتين التمهيدي العكسيتسلسل سيجماالمعطى في التعليقاتAGTACTTGCGCTCAGGAGGA
BD Cytofix التثبيت المخزن المؤقتBD Biosciences560585
1x BD Perm / Wash bufferBD Biosciences560585
مضاد للفأر OCT4-PerCP-Cy5.5BD Biosciences560585
مضاد للفأر Nanog-PEBD Biosciences560585
2-ميثيل بوتانسيجما-ألدريتشM32631
X100-Tritonسيجما-ألدريتشX100-500ML
مصل الماعزSigma-AldrichG9023
BSASigmaA2153
أرنب pAb مضاد ل OCT4Abcamab19857استخدم بتركيز 3 & mu ؛ جم / مل
أرنب pAb مضاد ل SOX2Abcamab97959استخدم بتركيز 1 & mu ؛ جم / مل
أرنب pAb مضاد للنانوجAbcamab80892استخدم بتركيز 1 & mu ؛ جم / مل
من الفأر mAb anti-SSEA1Abcamab16285استخدم بتركيز 20 مو ؛ جم / مل
الماعز pAb مضاد للأرانب IgG المسمى ب Cy3Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.111-165-003-JIRاستخدم بتركيز 1/250
الماعز pAb IgG المضاد للفأر المسمى ب Cy3Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.115-165-003-JIRاستخدم بتركيز 1/250
وسيط تركيب VECTASHIELD معمختبراتLaboratories H-1200
BCI / NBT نظام الركيزة السائلةSigmaB1911
متوسط تركيب مائيSigma
16٪ ParaformaldehydeFisherAA433689Mمحلول المخزون هو 16٪ ، استخدمه بنسبة 4٪
هيماتوكسيلين و eosinSigmaGH53 / HT110216
PAS تلطيخSigma395B
غسل تسلسل من من DAPI Vector

المراجع

  1. Blelloch, R., Venere, M., Yen, J., Ramalho-Santos, M. Generation Of Induced Pluripotent Stem Cells In The Absence Of Drug Selection. Cell Stem Cell. 1, 245-247 (2007).
  2. Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. Induced Pluripotent Stem Cells Generated Without Viral Integration. Science. 322, 945-949 (2008).
  3. Takahashi, K., et al. Induction Of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblasts By Defined Factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  4. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction Of Pluripotent Stem Cells From Mouse Embryonic And Adult Fibroblast Cultures By Defined Factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  5. Yu, J., et al. Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived From Human Somatic Cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
  6. Gonzalez, F., et al. Generation Of Mouse-Induced Pluripotent Stem Cells By Transient Expression Of A Single Nonviral Polycistronic Vector. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 8918-8922 (2009).
  7. Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation Of Mouse Induced Pluripotent Stem Cells Without Viral Vectors. Science. 322, 949-953 (2008).
  8. Woltjen, K., et al. Piggybac Transposition Reprograms Fibroblasts To Induced Pluripotent Stem Cells. Nature. 458, 766-770 (2009).
  9. Yusa, K., Rad, R., Takeda, J., Bradley, A. Generation Of Transgene-Free Induced Pluripotent Mouse Stem Cells By The Piggybac Transposon. Nat. Meth. 6, 363-369 (2009).
  10. Warren, L., et al. Highly Efficient Reprogramming To Pluripotency And Directed Differentiation Of Human Cells With Synthetic Modified Mrna. Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).
  11. Kim, D., et al. Generation Of Human Induced Pluripotent Stem Cells By Direct Delivery Of Reprogramming Proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
  12. Zhou, H., et al. Generation Of Induced Pluripotent Stem Cells Using Recombinant Proteins. Cell Stem Cell. 4, 381-384 (2009).
  13. Anokye-Danso, F., et al. Highly Efficient Mirna-Mediated Reprogramming Of Mouse And Human Somatic Cells To Pluripotency. Cell Stem Cell. 8, 376-388 (2011).
  14. Lin, S. -L., et al. Regulation Of Somatic Cell Reprogramming Through Inducible Mir-302 Expression. Nucleic Acids Res. , (2011).
  15. Miyoshi, N., et al. Reprogramming Of Mouse And Human Cells To Pluripotency Using Mature Micrornas. Cell Stem Cell. 8, 633-638 (2011).
  16. Subramanyam, D., et al. Multiple Targets Of Mir-302 And Mir-372 Promote Reprogramming Of Human Fibroblasts To Induced Pluripotent Stem Cells. Nat. Biotechnol. 29, 443-448 (2011).
  17. Dolgin, E. Flaw In Induced-Stem-Cell Model. Nature. 470, 13 (2011).
  18. Miura, K., et al. Variation In The Safety Of Induced Pluripotent Stem Cell Lines. Nat. Biotech. 27, 743-745 (2009).
  19. Pera, M. The Dark Side Of Pluripotency. Nature. 471, 46-47 (2011).
  20. Saha, K., Jaenisch, R. Technical Challenges In Using Human Induced Pluripotent Stem Cells To Model Disease. Cell Stem Cell. 5, 584-595 (2009).
  21. Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation Of Germline-Competent Induced Pluripotent Stem Cells. Nature. 448, 313-317 (2007).
  22. Varas, F., et al. Fibroblast-Derived Induced Pluripotent Stem Cells Show No Common Retroviral Vector Insertions. Stem Cells. 27, 300-306 (2009).
  23. Jia, F., et al. A Nonviral Minicircle Vector For Deriving Human Ips Cells. Nat. Meth. 7, 197-199 (2010).
  24. Gonzalez, F., Boue, S., Belmonte, J. C. I. Methods For Making Induced Pluripotent Stem Cells: Reprogramming A La. Nat. Rev. Genet. 12, 231-242 (2011).
  25. Stadtfeld, M., Hochedlinger, K. Induced Pluripotency: History, Mechanisms, And Applications. Genes Dev. 24, 2239-2263 (2011).
  26. Gore, A., et al. Somatic Coding Mutations In Human Induced Pluripotent Stem Cells. Nature. 471, 63-67 (2011).
  27. Hussein, S. M., et al. Copy Number Variation And Selection During Reprogramming To Pluripotency. Nature. 471, 58-62 (2011).
  28. Lister, R., et al. Hotspots Of Aberrant Epigenomic Reprogramming In Human Induced Pluripotent Stem Cells. Nature. 471, 68-73 (2011).
  29. Yilmazer, A., De Lázaro, I., Bussy, C., Kostarelos, K. In Vivo Cell Reprogramming Towards Pluripotency By Virus-Free Overexpression Of Defined Factors. Plos One. 8, (2013).
  30. Liu, F., Song, Y. K., Liu, D. Hydrodynamics-Based Transfection In Animals By Systemic Administration Of Plasmid Dna. Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999).
  31. Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High Levels Of Foreign Gene Expression In Hepatocytes After Tail Vein Injections Of Naked Plasmid Dna. Hum. Gene. Ther. 10, 1735-1737 (1999).
  32. Yamanaka, S. Induced Pluripotent Stem Cells: Past, Present, And Future. Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).
  33. Therapy Giacca, M. G. ene , Springer. (2010).
  34. Colella, P., Auricchio, A. Aav-Mediated Gene Supply For Treatment Of Degenerative And Neovascular Retinal Diseases. Curr. Gene Ther. 10, 371-380 (2010).
  35. Dayton, R. D., Wang, D. B., Klein, R. L. The Advent Of Aav9 Expands Applications For Brain And Spinal Cord Gene Delivery. Expert Opin. Biol. Ther. 12, 757-766 (2012).
  36. Mccown, T. J. Adeno-Associated Virus (Aav) Vectors In The Cns. Curr. Gene Ther. 11, 181-188 (2011).
  37. Vandenberghe, L. H., Auricchio, A. Novel Adeno-Associated Viral Vectors For Retinal Gene Therapy. Gene Ther. 19, 162-168 (2012).
  38. Herweijer, H., Wolff, J. A. Progress And Prospects: Naked Dna Gene Transfer And Therapy. Gene Ther. 10, 453-458 (2003).
  39. Wolff, J. A., Budker, V. The Mechanism Of Naked Dna Uptake And Expression. Adv. Genet. 54, 3-20 (2005).

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

تحفيز تعدد القدراتالحقن الهيدروديناميكي في الوريد الذيليعزل الخلايا الكبدية الأوليةتحليل قياس التدفق الخلويتعبير الجينات بواسطة تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقيالصبغ الكيميائي النسيجي المناعيتقطيع أنسجة الكبدتقييم تكوين الورم المسخي
في الجسم الحي إعادة برمجة الخلايا الجسدية البالغة إلى تعدد القدرات عن طريق الإفراط في التعبير عن عوامل ياماناكا
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.