مقالة منهجية

استخدام Caenorhabditis elegans كنظام نموذجي لدراسة توازن البروتين في كائن حي متعدد الخلايا

DOI:

10.3791/50840

⸱

ديسمبر 18, 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, National Institute for Biotechnology in the Negev, Ben-Gurion University of the Negev

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لدراسة العلاقة بين توازن البروتين والإجهاد والشيخوخة ، راقبنا التغيرات في طي البروتين باتباع خلل البروتين ، وتوطين البروتين في الخلية واستقرار البروتين على مستويات الكائنات الحية والخلوية والبروتين ، باستخدام metazoan Caenorhabditis elegans القابل للتتبع وراثيا كنظام نموذجي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_content"> يعد طي البروتينات وتجميعها أمرا ضروريا لوظيفة البروتين وصحة الخلية على المدى الطويل وطول عمر الكائن الحي. تاريخيا ، تمت دراسة وظيفة وتنظيم طي البروتين في المختبر ، في خلايا زراعة الأنسجة المعزولة والكائنات أحادية الخلية. كشفت الدراسات الحديثة عن روابط بين توازن البروتين (البروتين) ، والتمثيل الغذائي ، والتطور ، والشيخوخة ، واستشعار درجة الحرارة. أدت هذه النتائج إلى تطوير أدوات جديدة لمراقبة طي البروتين في نموذج الكائن الحي الميتازوان Caenorhabditis elegans. في مختبرنا ، نجمع بين المقايسات السلوكية والتصوير والأساليب الكيميائية الحيوية باستخدام البروتينات الحساسة لدرجة الحرارة أو التي تحدث بشكل طبيعي كأجهزة استشعار للبيئة القابلة للطي لمراقبة طي البروتين. توفر المقايسات السلوكية المرتبطة بسوء طي بروتين معين قراءة بسيطة وقوية لطي البروتين ، مما يسمح بالفحص السريع للجينات والظروف التي تعدل الطي. وبالمثل ، يمكن أن يرتبط هذا الطي الخاطئ بسوء توطين البروتين في الخلية. لذلك ، يمكن لمراقبة توطين البروتين أن تسلط الضوء على التغيرات في قدرة الطي الخلوي التي تحدث في الأنسجة المختلفة ، في مراحل مختلفة من التطور وفي مواجهة الظروف المتغيرة. أخيرا ، باستخدام الأدوات الكيميائية الحيوية من الجسم الحي ، يمكننا مراقبة استقرار البروتين وتشكله مباشرة. وبالتالي ، من خلال الجمع بين المقايسات السلوكية والتصوير والتقنيات الكيميائية الحيوية ، يمكننا مراقبة البروتين الخاطئ عند دقة الكائن الحي والخلية والبروتين ، على التوالي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحدد التفاعل بين الخطوات المختلفة للتخليق الحيوي للبروتين ، مثل نسخ الرنا المرسال ومعالجته وترجمته ، بالإضافة إلى طي البروتين ، والنقل ، والتجميع / التفكيك ، حمل البروتينات غير المستقرة التي تعتمد على آلات مراقبة جودة البروتين الخلوي لوظيفتها1. وبالتالي ، يمكن أن يؤدي غياب أو خلل في آلات مراقبة جودة البروتين إلى التدهور الوظيفي لأنواع متنوعة من الأجهزة الخلوية وظهور أمراض البروتين الخاطئة2-7. عندما تكون قدرة آلات طي وإزالة البروتين متوازنة مع حمل البروتينات غير المستقرة ، يتم تحقيق توازن البروتين (البروتينات) ، وهي حالة تمنع في النهاية تراكم البروتينات غير المطوية والتجميع داخل الخلايا6. يعتقد أن تراكم البروتينات غير المطوية هو الإشارة التي تنشط عوامل النسخ المحفزة للإجهاد ، مثل عامل الصدمة الحرارية (HSF-1) ، ويؤدي إلى تنشيط استجابات الإجهاد الواقي من الخلايا6،8.

تم اشتقاق فهمنا لوظائف شبكات البروتين في metazoans في الغالب من دراسات إعادة التكوين في المختبر ومن الملاحظات التي تم إجراؤها على خلايا زراعة الأنسجة والكائنات وحيدةالخلية 9. على سبيل المثال ، ركزت الأبحاث التي أجريت على المرافقين الجزيئيين الذين يمنعون ويحلون تلف البروتين على الدراسات البيولوجية الكيميائية الحيوية والخلوية لآليات طي البروتين بوساطة المرافق والتفكيك والنقل10-13. بالمقارنة ، لا تتوفر سوى معلومات محدودة حول الوظيفة المتكاملة لمكونات البروتينات المختلفة في الخلايا والأنسجة المختلفة للميتازوان في ظل ظروف النمو "الطبيعية" واستجابة للإجهاد11. إن اكتشاف أنه في C. ايليجانس، يمكن أيضا تنظيم التحكم في جودة البروتين الخلوي بشكل غير مستقل ، كما ينعكس في التجارب التي تظهر أن الطفرات في الخلايا العصبية التي تدرك درجة الحرارة يمكن أن تمنع تنشيط استجابة الصدمة الحرارية وتقلل من التحمل الحراري ، أظهر الحاجة إلى دراسة تنظيم البروتين في الكائن متعدد الخلايا 14-17. ومع ذلك ، فإن ما هو مفقود هو صورة متماسكة لكيفية عمل شبكات البروتينات ، مثل عائلات المرافق الجزيئي المختلفة ، في أنسجة الميتازوان السليم ومدى ديناميكية هذه الشبكات أثناء التطور والشيخوخة. لتحقيق هذا الهدف ، هناك حاجة إلى أجهزة استشعار موثوقة لمراقبة صيانة البروتينات في الحية لتحديد القدرة البروتينية للخلايا المختلفة في كائن متعدد الخلايا أثناء التطور والشيخوخة.

لكي يعمل بروتين معين كمستشعر للبروتين الخلوي ، يجب أن يستجيب للتغيرات في بيئة الطي الخلوي مع التدخل بشكل ضئيل فقط في طي البروتينات غير ذات الصلة في الخلية. لاستكشاف صيانة واستعادة البروتين الخلوي في الكائن الحي ، يمكن اتباع طريقتين تكميليتين يعتمدان على أجهزة الاستشعار القابلة للطي. يعتمد الأول على أجهزة استشعار قابلة للطي مصممة ، بناء على بروتينات غير مستقرة تم تحديدها تجريبيا ومن المعروف أنها تعتمد على آلات البروتين ، مثل اليراع لوسيفيراز18-20 أو GFP الموسومة ب degron21-24. في النهج الثاني ، يتم تتبع البروتينات غير المستقرة الداخلية ، مثل البروتينات الحساسة لدرجة الحرارة (ts) أو البروتينات المتراكمة المعتمدة على العمر والتي تستجيب للتغيرات التدريجية في البيئة الخلوية ،من 25 إلى 27. لا تخدم أجهزة الاستشعار القابلة للطي المصممة أي وظيفة بيولوجية أساسية ولكنها توفر ميزة كونها قابلة للاكتشاف من خلال فحوصات التقارير القوية ، مثل البروتينات التي تحمل علامة GFP ، ويمكن استخدامها مع العديد من النماذج الخلوية والحيوانية المختلفة18. ومع ذلك ، نظرا لأن إدخال بروتين غريب واحد يمكن أن يؤثر على بيئة الطي27 ، فإن عديد الببتيدات هذه يمكن أن تفرط في التحميل على آلية البروتين الخلوي. بدلا من ذلك ، قد لا تتأثر مستشعرات الطي المصممة التي ليست أصلية في الخلية التي تبلغ عنها بالتغيرات في قدرة البروتين للخلية. على سبيل المثال ، تطلبت ركيزة مراسل البروتيازوم التي تحمل علامة GFP ~ 90٪ من البروتيازوم ليتم تثبيطها قبل اكتشاف النمط الظاهري23. في المقابل ، توفر البروتينات غير المستقرة الذاتية التي تعتمد على آلات البروتين في الخلية ميزة كونها ضمن نطاق الحساسية الخلوية. ومع ذلك ، فإن فقدان الوظيفة المرتبط بسوء طي هذه البروتينات يمكن أن يؤثر أيضا على الوظيفة الخلوية وقابلية الكائنات الحية. هنا ، سنركز على استخدام C. ايليجانس المستشعرات القابلة للطي.

C. elegans هو نموذج ميتازوان راسخ لدراسة كل من التطور والشيخوخة الذي يستخدم العديد من المسارات البيولوجية المحفوظة ويمكن استخدامه لمتابعة طي البروتين في الخلية ، باستخدام مزيج من بيولوجيا الخلية والأساليب الكيميائية الحيوية والجينية. استخدمنا بروتينات غير مستقرة كمجسات للقدرة البروتينية من خلال مراقبة التغيرات في نمطها الظاهري وتوطينها واستقرارها. علاوة على ذلك ، يمكن دراسة مجموعة متنوعة من وظائف البروتين من خلال التحليل السلوكي البسيط. وبالمثل ، يحدث خطأ كبير في تحديد موقع البروتينات عندما تفشل شبكات مراقبة جودة البروتين الخلوي في التكيف مع المتطلبات الخلوية. يمكن تصور البروتينات بسهولة في خلايا الحية باستخدام البروتينات ذات العلامات الفلورية أو عن طريق التلوين المناعي. أخيرا ، باستخدام طرق ex vivo ، من الممكن مراقبة تعبير البروتين واستقراره. يسمح ذلك بفحص سريع وبسيط للتغيرات السلوكية والفسيولوجية ، إلى جانب التحليل المتعمق لتوطين البروتين واستقراره ، مما يسمح بمراقبة معدلات البروتينات. من خلال الجمع بين هذه الطرق المختلفة ، يمكن الحصول على رؤية واسعة لبيئة طي البروتين للخلية. في الواقع ، تم استخدام هذه الاستراتيجية بنجاح لمراقبة اضطراب البروتين في C. ايليجانس والخميرة وزراعة الأنسجة والبكتيريا15،25-35.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استخدام المقايسات السلوكية لمراقبة طي البروتين في كائن حي

1. مزامنة للمقايسات السلوكية

  1. اتبع الطرق القياسية لصيانة C. ايليجانس36 ، بما في ذلك تحضير الوسائط والأطباق وإعداد الطعام وظروف نمو. التحكم بعناية في ظروف الزراعة ، بما في ذلك درجة الحرارة (15-25 درجة مئوية) وحجم السكان وتوافر الغذاء. تخلص من أي طبق يظهر عليه تلوث بكتيري أو فطري.
  2. اختر 15-30 جنينا ، وانقلها إلى أطباق جديدة وتنمو عند درجة الحرارة المطلوبة (15-25 درجة مئوية) طوال مدة التجربة. بدلا من ذلك ، ضع 10-20 بالغا على طبق ، واتركهم يضعون البيض لمدة 30-60 دقيقة ثم أخرجهم من الطبق. سيعطي كل من الانتقاء المباشر للأجنة وتحديد البالغين الحاملين بعض التباين في العمر (±6 ساعات). لتقليل هذا التباين ، إما أن تختار الأجنة في مرحلة معينة ، على سبيل المثال مرحلة الفاصلة ، أو قم بتعيين 10-20 بالغا بدأوا للتو في وضع البيض (اليوم 2 من مرحلة البلوغ). تجنب التزامن عن طريق التبييض كلما أمكن ذلك ، نظرا لأن هذا العلاج مرهق ويمكن أن يؤثر على البروتينات.
  3. اختر المتزامنة ، وانقلها إلى لوحة الفحص للتسجيل ثم تخلص منها.
< p class = "jove_title" >2. فحص الحركة

اختر المتزامنة وانقلها إلى لوحة نظيفة عند درجة الحرارة المطلوبة لتسجيل الحركة (15-25 درجة مئوية). لكل تكرار بيولوجي ، سجل >20 وكرر الفحص 3x على الأقل لكل حالة تجريبية. استخدم اختبار مجموع رتبة Wilcoxon Mann-Whitney لمقارنة شرطين تجريبيين مستقلين.

  1. لفحص ضعف الحركة الخفيف ، ضع 5-7 معا في وسط حديقة بكتيرية نظيفة واسمح للحيوانات بالتحرك على اللوحة لمدة دقيقتين. تم تحديد هذا الفاصل الزمني بناء على الوقت الذي استغرقه 90٪ من البرية لمسح دائرة بطول 1 سم.
  2. احسب عدد التي لم تمسح دائرة بطول 1 سم (على سبيل المثال ، التي بقيت داخل دائرة نصف قطرها 1 سم من النقطة التي تم تعيينها عندها) في غضون دقيقتين على أنها غير منسقة.
  3. لفحص ضعف الحركة الشديد ، ضع على عشب بكتيري نظيف.
  4. صور العديد من في الوقت صفر (t = 0) ومرة أخرى بعد 5 دقائق (t = 5). سجل التي لم تتحرك بطول جسم واحد بعد 5 دقائق على أنها مشلولة.
فئة

3. المقاومة الحرارية

  1. اختر >20 متزامنا وانقله إلى صفيحة 24 بئرا تحتوي على 450 ميكرولتر من المخزن المؤقت للصدمة الحرارية (HS) (الجدول 1). لكل تكرار بيولوجي ، سجل >20 وكرر الفحص 4 مرات على الأقل لكل حالة تجريبية.
  2. انقل طبقا مكونا بسعة 24 جيدا إلى حمام ساخن. تعتمد درجة حرارة النظام المنسق ومدته بشدة على ظروف النمو ، ولا سيما درجة حرارة الزراعة.
  3. استكمل المخزن المؤقت HS ب 9 ميكرولتر من برتقالة SYTOX.
  4. سجل بقاء على قيد الحياة من خلال مراقبة امتصاص الصبغة ، باستخدام مجسم فلوري مع مرشح TXR. التي تناولت الصبغة ماتت. استخدم اختبار مجموع رتبة Wilcoxon Mann-Whitney لمقارنة شرطين تجريبيين مستقلين.

استخدام التلوين المناعي والبروتينات الموسومة لمراقبة طي البروتين في خلايا معينة

< p class = "jove_title" >4. مراقبة توطين البروتينات عن طريق التلوين المناعي

  1. في المرحلة المطلوبة ، انقل ما لا يقل عن 30 إلى أنبوب Eppendorf يحتوي على المخزن المؤقت M936.
  2. اغسل عدة مرات باستخدام المخزن المؤقت M9 عن طريق إجراء خطوة طرد مركزي قصيرة ومنخفضة السرعة (3,000 دورة في الدقيقة / 900 × جم ، 2 دقيقة) وإعادة التعليق.
  3. ضع الأنابيب على الثلج لبضع دقائق حتى تبرد.
  4. قم بإزالة السائل الزائد واحتضانه بمحلول بارافورمالديهايد 500 ميكرولتر من المثلج البارد بنسبة 4٪ (الجدول 2). يجب معايرة وقت الحضانة لكل بروتين يتم فحصه ويجب أن يكون حوالي 5-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. يمكن أيضا إجراء الحضانة المطولة عند 4 درجات مئوية ولكن هذا قد يضعف نفاذية العينة.
  5. اغسل الثابتة 3x باستخدام المخزن المؤقت PBS-Tween (درجة الحموضة 7.2) عن طريق الطرد المركزي (3,000 دورة في الدقيقة ، 1-2 دقيقة). يمكن تخزين في هذه المرحلة عند 4 درجات مئوية لبضعة أسابيع.
  6. اجمع عن طريق الطرد المركزي (3,000 دورة في الدقيقة ، 1-2 دقيقة).
  7. في الغطاء ، قم بإزالة معظم المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في محلول 1 مل β-mercaptoethanol (β-ME) (الجدول 2).
  8. احتضن عند 37 درجة مئوية طوال الليل مع هزاز لطيف على المغذيات.
  9. في غطاء المحرك ، اغسل 3 مرات باستخدام المخزن المؤقت PBS-Tween (درجة الحموضة 7.2).
  10. أعد تعليق في 50-100 ميكرولتر من PBS-Tween (الرقم الهيدروجيني 7.2). يمكن تخزين في هذه المرحلة عند 4 درجات مئوية لبضعة أسابيع.
  11. اجمع عن طريق الطرد المركزي (3,000 دورة في الدقيقة ، 1-2 دقيقة) وقم بإزالة معظم المخزن المؤقت PBS-Tween.
  12. أضف 100-150 ميكرولتر من محلول الكولاجيناز إلى كل أنبوب واحتضانه عند 37 درجة مئوية مع تحريك قوي (باستخدام خلاط حراري أو حاضنة اهتزاز).
  13. افحص بشكل متكرر تحت المجهر المجسم ، بدءا من 5 دقائق من الحضانة. عندما يتم كسر 20٪ من ، أوقف التفاعل عن طريق وضع الأنبوب على الجليد. هذه الخطوة حساسة للغاية! تعتمد مدة العلاج على ظروف التثبيت ويمكن أن تختلف بشكل كبير بين السلالات. يمكن أن تؤدي الحضانة المطولة إلى تدهور كامل للحيوانات. يجب معايرة الظروف لكل دفعة إنزيم مستخدمة ويجب مراقبة التحلل بعناية.
  14. اغسل مرتين في PBS-Tween (درجة الحموضة 7.2) ثم اجمع عن طريق الطرد المركزي (3,000 دورة في الدقيقة ، 1-2 دقيقة) وقم بإزالة معظم المخزن المؤقت PBS-Tween.
  15. أضف 1 مل من محلول AbA (الجدول 2) واحتضنه بهزاز لطيف لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. يمكن تخزين في هذه المرحلة عند 4 درجات مئوية لبضعة أسابيع.
  16. اجمع عن طريق الطرد المركزي (3,000 دورة في الدقيقة ، 1-2 دقيقة) وأعد تعليقها في 200 ميكرولتر AbA.
  17. أضف الجسم المضاد الأساسي المخفف إلى 1: 100-1: 1,000 في محلول AbA واحتضانه بهزاز لطيف. يمكن أن تختلف درجة حرارة ومدة الحضانة بين الأجسام المضادة ويجب معايرتها لكل بروتين يتم فحصه. نبدأ بحضانة ليلية في درجة حرارة الغرفة.
  18. اغسل بالطرد المركزي (3,000 دورة في الدقيقة ، 1-2 دقيقة).
  19. أضف AbA المؤقت (1 مل) واحتضنه بالخلط اللطيف لمدة 15-60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. يمكن تخزين في هذه المرحلة عند 4 درجات مئوية لبضعة أسابيع.
  20. اختياري: يمكن أيضا تلطيخ العينة بأصباغ الفلورسنت. للقيام بذلك ، أضف الصبغة (مثل DAPI (2 مجم / مل) أو فالودين (1: 100)) إلى 200 ميكرولتر AbA واحتضانها بهزاز لطيف لمدة تصل إلى ساعة واحدة. يمكن تنفيذ هذه الخطوة خلال إحدى خطوات غسل الجسم المضاد الثانوي.
  21. اغسل 3 مرات بتكرار الخطوات 4.18-4.19.
  22. أضف 100 ميكرولتر من AbA مع الجسم المضاد الثانوي المناسب الموسوم بالفلورسنت ، المخفف بنسبة 1: 100.
  23. حافظ على العينات مغطاة (أو في أنبوب مظلم) واحتضانها بالهزاز لعدة ساعات في درجة حرارة الغرفة.
  24. اغسل 3 مرات عن طريق التحضين في عازلة AbA (1 مل) مع الخلط اللطيف لمدة 15-60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة متبوعا بالطرد المركزي (3,000 دورة في الدقيقة ، 1-2 دقيقة). يمكن تخزين في هذه المرحلة عند 4 درجات مئوية لبضعة أسابيع.
  25. لتركيب على الشرائح ، قم بإزالة كل السوائل وإعادة تعليقها في 10 ميكرولتر من نفس المخزن المؤقت.
  26. قم بقص نهاية طرف الماصة لتجنب تشنج ونقل 1-2 ميكرولتر من العينة إلى شريحة.
  27. أضف وسيط التركيب بنسبة 1: 1.
  28. قم بتغطية الشريحة برفق باستخدام غطاء وأغلقها بطلاء الأظافر. إذا لم تتم مراقبة الشريحة على الفور ، فيمكن تخزين الشرائح عند -20 درجة مئوية لفترة طويلة من الزمن.
< p class = "jove_title" >5. مراقبة توطين البروتينات الموسومة

  1. في المرحلة المطلوبة ، اجمع ما لا يقل عن 15 في قطرة 10 مل من المخزن المؤقت M9 على شريحة.
  2. باستخدام "معول دودة" ، انقل إلى قطرة 10 مل من محلول بارافورمالدهيد (4٪) (الجدول 2) وانتظر حتى تتوقف جميع عن الحركة (حوالي 5 دقائق).
  3. باستخدام "معول دودة" ، انقل إلى قطرة 2 مل من المخزن المؤقت M9 ووسط التركيب (1: 1) (الجدول 2).
  4. قم بتغطية برفق بغطاء وختم بطلاء الأظافر.

استخدام فحوصات ex vivo لمراقبة طي البروتين واستقراره

< p class = "jove_title" >6. الهضم الجزئي

  1. اغسل من 15 لوحا (60 مم) باستخدام 1-2 مل من المخزن المؤقت M9 في أنبوب ميكروفوج. يرجى ملاحظة أنه لا ينبغي أن تكون مزدحمة ويجب أن يكون الطعام الكافي متاحا طوال مدة التجربة.
  2. اغسل عدة مرات باستخدام المخزن المؤقت M9 عن طريق الطرد المركزي (3,000 دورة في الدقيقة ، 2 دقيقة) وتعليق.
  3. بعد الدوران النهائي ، أعد تعليق في 100 ميكرولتر M9 عازلة.
  4. تجميد سريع في السائل N2. يمكن تخزين العينات عند -80 درجة مئوية.
  5. باستخدام مدقة مبردة ومثقاب آلي (يمكن أيضا استخدام مثقاب ثقافة الأنسجة اليدوي) ، قم بطحن العينة. احتفظ بالعينة على الثلج وتجنب السخونة الزائدة.
  6. افحص بشكل متكرر تحت مجهر مجسم لتحديد ما إذا كان الطحن قد اكتمل. إذا بقيت سليمة ، كرر الإجراء.
  7. قم بتقدير الحجم عن طريق سحب مستخلص الدودة.
  8. أضف نسبة 1: 1 من محلول تحلل الدودة (2x) (الجدول 3). لا تستخدم مثبطات الإنزيم البروتيني من أي نوع.
  9. احتضن على الثلج لمدة 15 دقيقة.
  10. قم بإزالة الحطام عن طريق الطرد المركزي (1,000 × جم لمدة دقيقتين) في جهاز طرد مركزي مبرد مسبقا (4 درجات مئوية).
  11. انقل المادة الطافية إلى أنبوب ميكرو فيوج نظيف. يمكن استخدام العينات مباشرة أو تخزينها عند -80 درجة مئوية.
  12. تحضير محلول الكيموتريبسين (الجدول 3) والحفاظ على الثلج حتى الاستخدام.
  13. حدد تركيز البروتين الكلي باستخدام مقايسة برادفورد.
    14. قم
  14. بتخفيف العينة إذا لزم الأمر بحيث يكون إجمالي تركيز البروتين 3-3.5 مجم / مل.
  15. أضف محلول الكيموتريبسين إلى محللة البروتين الكلي (1: 1،200).
  16. لتحديد وقت الحضانة ، احتضان العينة بكيموتريبسين لمدة 60 دقيقة. قم بإزالة 20 ميكرولتر من الحصص من العينة في نقاط زمنية مختلفة (على سبيل المثال 0 و 5 و 20 و 40 و 60 دقيقة) ، واخلطها على الفور مع المخزن المؤقت لعينة SDS واتركها تغلي لمدة 5 دقائق عند 96 درجة مئوية. * بدلا من ذلك ، احتضان العينة بتركيزات مختلفة من الكيموتريبسين وأوقف التفاعل بعد وقت محدد عن طريق إضافة مخزن مؤقت لعينة SDS وغليها لمدة 5 دقائق عند 96 درجة مئوية.
  17. قم بتشغيل العينات على هلام SDS-PAGE.
  18. قم بإجراء تحليل اللطخة الغربية باستخدام الأجسام المضادة المناسبة لتحديد الاستقرار النسبي للبروتين.
  19. تحديد الظروف المثلى (تركيز الكيموتريبسين ووقت الهضم) التي تظهر تغيرا كبيرا بين العينات واستخدام هذه الشروط للتجارب المستقبلية.
  20. تحديد كثافة منتجات الهضم المختلفة (شظايا الوزن الجزيئي المنخفضة) باستخدام برنامج قياس الكثافة ، مثل وحدة هلام الصور NIH.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن أن تؤدي بيئة الطي المعرضة للخطر إلى خلل في طي البروتين وتجميعه. يرتبط الطي الخاطئ للبروتين بتغير التشكل ويؤدي إلى فقدان وظيفة البروتين. نحن نستخدم طرقا تكميلية لمراقبة طي البروتين ووظيفته في السليمة وخلايا معينة ومستخلصات البروتين. يمكن بعد ذلك استخدام اختيار ذكي لمستشعر الطي ، بناء على الأنماط الظاهرية السلوكية والخلوية القوية المرتبطة بطفرة معروفة مزعزعة للاستقرار ، لمراقبة التغييرات في بيئة طي البروتين. مثال على البروتين المتحور الداخلي الحساس لدرجة الحرارة هو طفرة L799F في بروتين خيوط العضلات السميكة ، البارامي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يجب أن تكون مجسات قدرة البروتين الخلوي حساسة للغاية للتغيرات في بيئة الطي وأن تتم مراقبتها بسهولة لتوفير تقييم في الوقت الفعلي لقدرات مراقبة جودة طي البروتين. باستخدام البروتينات غير المستقرة كمجسات لقدرة البروتين ، راقبنا التغيرات في النمط الظاهري ، وتوطين البروتين تحت الخلوي ، وتشكل البروتين. تركز البروتوكولات المعروضة هنا على الأنماط الظاهرية المرتبطة بالبروتين العضلي ، بما في ذلك الحركة وتنظيم خيوط العضلات واستقرار الميوسين. ومع ذلك ، يمكن تعديل هذه البروتوكولات لمراقبة أجهزة الاستشعار القابلة للطي الأخرى. بالنسبة لل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم توفير جميع سلالات الديدان الخيطية المستخدمة في هذا العمل من قبل مركز Caenorhabditis لعلم الوراثة ، والذي يموله المركز الوطني للمعاهد الوطنية للصحة لموارد البحوث (NCRR). تم الحصول على الأجسام المضادة أحادية النسيلة التي طورها إتش إف إبستين من بنك الورم الهجين للدراسات التنموية الذي تم تطويره تحت رعاية NICHD ويحتفظ به قسم الأحياء بجامعة أيوا. تم دعم N. Shemesh من قبل جائزة Fay and Bert Harbour. أ. ب. بدعم من زمالة ألون من المجلس الإسرائيلي للتعليم العالي، ومنحة ماري كوري الدولية لإعادة الإدماج، ومنح من مؤسسة العلوم ثنائية القومية ومؤسسة العلوم الإسرائيلية (المنحة رقم 91/11).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الأجسام المضادة staning و fiaxtionparaformaldehydeMerc8187151000
Tween-20 & nbsp ؛بيوراد 1706531
كولاجينازسيجماC5138-100MG
دابكوميرك8034560100
تريتون X-100ألفا إيسارA16046
& بيتا ؛ -MESigma8057400250
BSADi Cam000-40-100
  ؛ الملخص الجزئي ChymotrypsinSigmaC4129-250MG
مقاومة للحرارةSYTOX البرتقاليInvitrogenS11368
الكوليسترولAmaresco0433-250G
EQUIPMENT
M165 FC مجسم الفلورسنتLeicaTXR مرشح
EXi الأزرق الفلور كاميرا المجهرQImagingEXI-BLU-R-F-M-14-C
ConfoCor 3/510 META مجهر متحد البؤرZeiss
Pellet pestlesSigmaZ359947-100EA
بيليه مدقة محرك لاسلكيKontesK749540-0000
MicroCL 17 MicroCL 17 Micro Centrifuge SeriesThermo75002455المبردة ، 230 فولت 50/60 هرتز ، يتضمن دوار 24 × 1.5 / 2.0 مل مع غطاء الاحتواء الحيوي ClickSeal

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319, 916-919 (2008).
  2. Arias, E., Cuervo, A. M. Chaperone-mediated autophagy in protein quality control. Curr. Opin. Cell. Biol. 23, 184-189 (2011).
  3. Tyedmers, J., Mogk, A., Bukau, B. Cellular strategies for controlling protein aggregation. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 11, 777-788 (2010).
  4. Walter, P., Ron, D. The unfolded protein response: from stress pathway to homeostatic regulation. Science. 334, 1081-1086 (2011).
  5. Finley, D. Recognition and processing of ubiquitin-protein conjugates by the proteasome. Annu. Rev. Biochem. 78, 477-513 (2009).
  6. Gidalevitz, T., Prahlad, V., Morimoto, R. I. The stress of protein misfolding: from single cells to multicellular organisms. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (2011).
  7. Haynes, C. M., Ron, D. The mitochondrial UPR - protecting organelle protein homeostasis. J. Cell. Sci. 123, 3849-3855 (2010).
  8. Akerfelt, M., Morimoto, R. I., Sistonen, L. Heat shock factors: integrators of cell stress, development and lifespan. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol.. 11, 545-555 (2010).
  9. Prahlad, V., Morimoto, R. I. Integrating the stress response: lessons for neurodegenerative diseases from C. elegans. Trends Cell. Biol. 19, 52-61 (2009).
  10. Li, J., Soroka, J., Buchner, J. The Hsp90 chaperone machinery: conformational dynamics and regulation by co-chaperones. Biochim. Biophys. Acta. 1823, 624-635 (2012).
  11. Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475, 324-332 (2011).
  12. Winkler, J., Tyedmers, J., Bukau, B., Mogk, A. Chaperone networks in protein disaggregation and prion propagation. J. Struct. Biol. 179, 152-160 (2012).
  13. Mayer, M. P. Gymnastics of molecular chaperones. Mol. Cell. 39, 321-331 (2010).
  14. Durieux, J., Wolff, S., Dillin, A. The cell-non-autonomous nature of electron transport chain-mediated longevity. Cell. 144, 79-91 (2011).
  15. Garcia, S. M., Casanueva, M. O., Silva, M. C., Amaral, M. D., Morimoto, R. I. Neuronal signaling modulates protein homeostasis in Caenorhabditis elegans post-synaptic muscle cells. Genes Dev. 21, 3006-3016 (2007).
  16. Prahlad, V., Cornelius, T., Morimoto, R. I. Regulation of the cellular heat shock response in Caenorhabditis elegans by thermosensory neurons. Science. 320, 811-814 (2008).
  17. Bar-Lavan, Y., Kosolapov, L., Frumkin, A., Ben-Zvi, A. Regulation of cellular protein quality control networks in a multicellular organism. FEBS J. 279, 526-531 (2012).
  18. Gupta, R., et al. Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress. Nat. Methods. 8, 879-884 (2011).
  19. Rampelt, H., et al. Metazoan Hsp70 machines use Hsp110 to power protein disaggregation. EMBO J. 31, 4221-4235 (2012).
  20. Winkler, J., Tyedmers, J., Bukau, B., Mogk, A. Hsp70 targets Hsp100 chaperones to substrates for protein disaggregation and prion fragmentation. J. Cell. Biol. 198, 387-404 (2012).
  21. Kim, Y. I., Burton, R. E., Burton, B. M., Sauer, R. T., Baker, T. A. Dynamics of substrate denaturation and translocation by the ClpXP degradation machine. Mol. Cell. 5, 639-648 (2000).
  22. Hamer, G., Matilainen, O., Holmberg, C. I. A photoconvertible reporter of the ubiquitin-proteasome system in vivo. Nat. Methods. 7, 473-478 (2010).
  23. Bence, N. F., Sampat, R. M., Kopito, R. R. Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation. Science. 292, 1552-1555 (2001).
  24. Dantuma, N. P., Lindsten, K., Glas, R., Jellne, M., Masucci, M. G. Short-lived green fluorescent proteins for quantifying ubiquitin/proteasome-dependent proteolysis in living cells. Nat. Biotechnol. 18, 538-543 (2000).
  25. Brown, C. R., Hong-Brown, L. Q., Welch, W. J. Correcting temperature-sensitive protein folding defects. J. Clin. Invest. 99, 1432-1444 (1997).
  26. Van Dyk, T. K., Gatenby, A. A., LaRossa, R. A. Demonstration by genetic suppression of interaction of GroE products with many proteins. Nature. 342, 451-453 (1989).
  27. Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311, 1471-1474 (2006).
  28. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 14914-14919 (2009).
  29. Burkewitz, K., Choe, K., Strange, K. Hypertonic stress induces rapid and widespread protein damage in. C. elegans. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 301, 566-576 (2011).
  30. Alavez, S., Vantipalli, M. C., Zucker, D. J., Klang, I. M., Lithgow, G. J. Amyloid-binding compounds maintain protein homeostasis during ageing and extend lifespan. Nature. 472, 226-229 (2011).
  31. David, D. C., et al. Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in C. elegans. PLoS Biol. 8, (2010).
  32. Eremenko, E., Ben-Zvi, A., Morozova-Roche, L. A., Raveh, D. Aggregation of human S100A8 and S100A9 amyloidogenic proteins perturbs proteostasis in a yeast model. PLoS One. In press, (2013).
  33. Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S. M., Morimoto, R. I. Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity. PLoS Genet. 5, (2009).
  34. Silva, M. C., et al. A genetic screening strategy identifies novel regulators of the proteostasis network. PLoS Genet.. 7, (2011).
  35. Prahlad, V., Morimoto, R. I. Neuronal circuitry regulates the response of Caenorhabditis elegans to misfolded proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 14204-14209 (2011).
  36. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  37. Gengyo-Ando, K., Kagawa, H. Single charge change on the helical surface of the paramyosin rod dramatically disrupts thick filament assembly in Caenorhabditis elegans. J. Mol. Biol. 219, 429-441 (1991).
  38. Clark, S. G., Shurland, D. L., Meyerowitz, E. M., Bargmann, C. I., vander Bliek, A. M. A dynamin GTPase mutation causes a rapid and reversible temperature-inducible locomotion defect in C. elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 94, 10438-10443 (1997).
  39. Hsu, A. L., Murphy, C. T., Kenyon, C. Regulation of aging and age-related disease by DAF-16 and heat-shock factor. Science. 300, 1142-1145 (2003).
  40. Morley, J. F., Morimoto, R. I. Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones. Mol. Biol. Cell. 15, 657-664 (2004).
  41. Morimoto, R. I. Proteotoxic stress and inducible chaperone networks in neurodegenerative disease and aging. Genes Dev. 22, 1427-1438 (2008).
  42. Taylor, R. C., Dillin, A. Aging as an event of proteostasis collapse. Cold Spring Harb. Perspect. Biol.. 3, (2011).
  43. Tissenbaum, H. A. Genetics, Life Span, Health Span, and the Aging Process in Caenorhabditis elegans. J. Gerontol. A. Biological Sci. Med. Sci. 67, 503-510 (2012).
  44. Hosono, R., Mitsui, Y., Sato, Y., Aizawa, S., Miwa, J. Life span of the wild and mutant nematode Caenorhabditis elegans. Effects of sex, sterilization, and temperature. Exp. Gerontol. 17, 163-172 (1982).
  45. Madi, A., et al. Mass spectrometric proteome analysis for profiling temperature-dependent changes of protein expression in wild-type Caenorhabditis elegans. Proteomics. 3, 1526-1534 (2003).
  46. Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419, 808-814 (2002).
  47. Barral, J. M., Hutagalung, A. H., Brinker, A., Hartl, F. U., Epstein, H. F. Role of the myosin assembly protein UNC-45 as a molecular chaperone for myosin. Science. 295, 669-671 (2002).
  48. Melkani, G. C., Bodmer, R., Ocorr, K., Bernstein, S. I. The UNC-45 chaperone is critical for establishing myosin-based myofibrillar organization and cardiac contractility in the Drosophila heart model. PLoS One. 6, (2011).
  49. Gosai, S. J., et al. Automated high-content live animal drug screening using C. elegans expressing the aggregation prone serpin alpha1-antitrypsin Z. PLoS One. 5, (2010).
  50. Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity. Science. (313), 1604-1610 (2006).
  51. Cohen, E., et al. Reduced IGF-1 signaling delays age-associated proteotoxicity in mice. Cell. 139, 1157-1169 (2009).
  52. Shemesh, N., Shai, N. Ben-Zvi A (2013) Germline stem cell arrest inhibits the collapse of somatic proteostasis early in Caenorhabditis elegans adulthood. Aging Cell. 12 (2013), 814-822 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Behavioral AssaysImmunofluorescence MicroscopyWestern Blot AnalysisTemperature Sensitivity AssayProtein MisfoldingProteostasis MonitoringAnimal SynchronizationCollagenase Digestion

مقالات ذات صلة