مقالة منهجية

FtsZ البلمرة فحوصات: بروتوكولات بسيطة واعتبارات

15.5K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/50844

⸱

نوفمبر 16, 2013

 , 
1Department of Molecular Microbiology, Groningen Biomolecular Sciences and Biotechnology Institute, University of Groningen

في هذه المقالة

ملخص

بلمرة FtsZ ضرورية لانقسام الخلايا البكتيرية. في هذا التقرير ، نقوم بتفصيل بروتوكولات بسيطة لمراقبة نشاط بلمرة FtsZ ومناقشة تأثير تكوين المخزن المؤقت. يمكن استخدام البروتوكولات لدراسة تفاعل FtsZ مع البروتينات التنظيمية أو الأدوية المضادة للبكتيريا التي تؤثر على بلمرة FtsZ.

الملخص

خلال انقسام الخلية البكتيرية، والبروتين ضروري FtsZ تجمع في وسط الخلية لتشكيل ما يسمى Z-الحلبة. FtsZ يبلمر في خيوط طويلة في وجود GTP في المختبر، ويتم تنظيم البلمرة من قبل العديد من البروتينات التبعي. وقد درس على نطاق واسع FtsZ البلمرة في المختبر باستخدام الأساليب الأساسية بما في ذلك تشتت الضوء، الترسيب، GTP المقايسات التحلل والمجهر الإلكتروني. شروط العازلة تأثير كل من خصائص بلمرة FtsZ، وقدرة FtsZ للتفاعل مع البروتينات التنظيمية. هنا، نحن تصف بروتوكولات للدراسات البلمرة FtsZ والتحقق من صحة شروط وضوابط استخدام كولاي العصوية الرقيقة وFtsZ كما البروتينات الطراز. هو عرض والترسيب فحص سرعة منخفضة تسمح دراسة تفاعل مع البروتينات التي FtsZ حزمة أو tubulate البوليمرات FtsZ. يوصف لتحسين بروتوكول مقايسة GTPase أن يسمح الاختبارمن GTP التحلل بمرور الوقت باستخدام مختلف الظروف في الإعداد لوحة 96 جيدا، مع أوقات الحضانة موحدة بأن تلغي التباين في التنمية اللون في رد فعل الكشف عن الفوسفات. يوصف إعداد العينات للدراسات تشتت الضوء والمجهر الإلكتروني. وتستخدم العديد من المخازن المؤقتة إلى إقامة مناسبة ودرجة الحموضة عازلة وتركيز الملح للدراسات البلمرة FtsZ. تركيزات عالية من بوكل هو أفضل بالنسبة لمعظم التجارب. توفير وسائل لدينا نقطة انطلاق لفي المختبر توصيف FtsZ، ليس فقط من E. القولونية وباء. الرقيقة ولكن من أي بكتيريا أخرى. على هذا النحو، وأساليب يمكن استخدامها لدراسات تفاعل FtsZ مع البروتينات التنظيمية أو اختبار الأدوية المضادة للبكتيريا التي قد تؤثر على بلمرة FtsZ.

المقدمة

البكتيرية البروتين FtsZ الأساسية هو أفضل بروتين تتميز آلية انقسام الخلايا البكتيرية. FtsZ هو homolog بدائية النواة من تويولين ويبلمر في المختبر بطريقة تعتمد GTP. FtsZ هو هدف جذاب للغاية لمضادات حيوية جديدة، نظرا لطبيعة الحفظ وتفرد للبكتيريا 1،2. في بداية انقسام الخلية، FtsZ يشكل حلقة cytokinetic في midcell، والتي هي بمثابة سقالة لتجميع البروتينات انقسام الخلايا الأخرى. تشكيل Z الدائري هو أمر حاسم لتوطين الصحيح للطائرة الانقسام. وينظم ديناميكية تجميع FtsZ من قبل العديد من البروتينات الإكسسوارات، مثل (اعتمادا على الأنواع البكتيرية) مينك، SepF، ZAPA، UgtP، وعزرا 2. وقد FtsZ البلمرة درس مكثف في المختبر، والعديد من الهياكل المختلفة بما في ذلك protofilaments على التوالي، protofilaments منحنية، ورقة من خيوط، خيوط وحزم من أنابيب من خيوط كان قصرcribed اعتمادا على المخزن المؤقت التجمع، النوكليوتيدات، والبروتينات إضافية تدرج في مقايسة 3. لا يزال الغموض بنية protofilaments FtsZ في الجسم الحي بالكامل، على الرغم من أن التجارب cryotomography الإلكترون في العنيقاء crescentus تشير إلى أن Z-حلقة يتم تجميعها من، protofilaments احد noncontinuous قصيرة نسبيا دون واسعة تجميع 4.

في المختبر، والخصائص بلمرة FtsZ وتفاعل FtsZ مع البروتينات التنظيمية حساسة لتكوين رد فعل العازلة. على سبيل المثال، وصفنا مؤخرا موقع التفاعل لSepF على FtsZ C-محطة وأظهرت أن FtsZ الإفطار اقتطاع Δ16 C-محطة لم يعد يربط SepF 5. في دراسة سابقة على التفاعل SepF-FtsZ الإفطار، وهو مماثل FtsZ الإفطار Δ16 اقتطاع يزال cosedimented مع SepF، الذي اقترح أن SepF بربط موقع ثانوي على FtsZ 6. كان الفرق بين هذه الدراسات لتكوين رد فعل مخازن-في درجة الحموضة 7.5 لم يكن هناك cosedimentation من SepF مع اقتطاع FtsZ، بينما في درجة الحموضة 6.5 كان هناك cosedimentation. Gündoğdu وآخرون. أشار إلى أن SepF غير فعال ويترسب في درجة الحموضة 6.5 7، وتبين أن cosedimentation وحظ في درجة الحموضة 6.5 ومن المرجح أن يكون ناجما عن هطول الأمطار من SepF بدلا من التفاعل مع FtsZ الإفطار اقتطاع Δ16 C-محطة. تأثير درجة الحموضة وتركيز بوكل على بلمرة FtsZ وقد درست سابقا. البوليمرات من E. القولونية FtsZ (FtsZ EC) في درجة الحموضة 6.5 هي أطول وأكثر وفرة من تلك التي شكلت في درجة الحموضة 8،9 محايدة. تادرس وآخرون. درسوا بلمرة FtsZ المفوضية الأوروبية في وجود الكاتيونات الأحادي التكافؤ مشيرا إلى أن K + ملزمة مرتبط FtsZ المفوضية الأوروبية البلمرة وأمر بالغ الأهمية للنشاط FtsZ 10. الرقم الهيدروجيني هو أكثر criticaل عندما يتم درس تفاعل FtsZ مع بروتينات أخرى، كما يتضح من المثال السابق من SepF، والاعتماد على الرقم الهيدروجيني للتأثير كابح من مينك على FtsZ 11. لأن كلا من درجة الحموضة وتركيز الملح قد يؤثر على تفاعل FtsZ مع بروتينات أخرى، فمن المهم أن تختار الشروط والضوابط الحق للدراسات البلمرة FtsZ.

نحن هنا تصف بروتوكولات لدراسة البلمرة FtsZ والنشاط GTPase كتبها تشتت الضوء، المجهر الإلكتروني، والترسيب، والمقايسات GTPase. الحق ضوء زاوية التشتت هو الأسلوب القياسي لدراسة FtsZ البلمرة في الوقت الحقيقي 12. قدمنا ​​بعض التحسينات إلى الترسيب وGTPase الفحص. نقدم بالتفصيل كيفية تحضير العينات لتشتت الضوء والمجهر الإلكتروني. تم اختبار العديد من مخازن تستخدم في الأدب لدراسة FtsZ البلمرة وصفنا أفضل الظروف لكل تجربة. وتبين لنا أيضا التي تسيطر ينبغي أن يكونقدم للحصول على أفضل البيانات.

هذه الأساليب تسمح دراسة سريعة من FtsZ البلمرة، والنشاط والتفاعل مع بروتينات أخرى باستخدام أساليب ومعدات والذي يتوفر في معظم المختبرات بسيطة. أساليب أكثر تطورا لدراسة FtsZ البلمرة موجودة ولكن غالبا ما تتطلب الحصول على معدات أكثر تخصصا، و / أو تعديل FtsZ مع تسميات الفلورسنت 8،13،14. ويوضح أساليب بسيطة وصفها في هذه الورقة باستخدام FtsZ من B. الرقيقة وE. القولونية، وأكثرها شيوعا غرام + والكائنات الحية الغرام الطراز. البروتوكولات يمكن أن تتكيف مع أي بروتين FtsZ الأخرى. استنادا إلى فحوصات أولية مع هذه FtsZs الرواية، تغييرات طفيفة بشأن الوقت، العازلة أو درجة حرارة الحضانة قد تكون ضرورية لتحقيق نتيجة أفضل. يجب التجارب وصفها هنا تساعد في إيجاد هذه الظروف المثلى.

البروتوكول

< p class = "jove_content" > تم تنقية بروتينات FtsZ غير الموسومة كما هو موضح سابقا11،15 ، وتم تحللها مقابل 20 ملي مولار تريس / حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.9) ، و 50 ملي مولار KCl ، و 1 ملي مولار EGTA ، و 2.5 ملي مولار MgAc و 10٪ جلسرين وتخزينها عند -80 درجة مئوية. في ظل هذه الظروف ، يمكن تخزين البروتين لأكثر من عامين دون فقدان كبير للنشاط. يجب تخزين البروتين في 100 ميكرولتر لتجنب ذوبان العينة وتجميدها. بعد الذوبان ، يمكن الاحتفاظ بالعينة عند 4 درجات مئوية لمدة أسبوع واحد كحد أقصى. FtsZ قابل للذوبان بتركيزات عالية ويمكن تخزينه عند 7-10 مجم / مل. من المهم الحفاظ على تركيز البروتين مرتفعا لتجنب الآثار غير المرغوب فيها لمكونات التخزين المؤقت في التجارب اللاحقة. وبالتالي ، يجب أن يسمح تركيز التخزين بتخفيف FtsZ بمقدار 10x على الأقل لتقليل تركيز الجلسرين إلى أقل من 1٪ وتقليل تركيز المكونات الأخرى للمخزن المؤقت لغسيل الكلى في مزيج التفاعل. قد تتأثر بلمرة FtsZ أيضا بوجود تركيزات عالية من الصوديوم9 أو إيميدازول ، وبالتالي يجب إزالة هذه المكونات من مخزن البلمرة المؤقت. تم تنقية SepF كما هو موضح7 وتخزينه في مخزن مؤقت للشطف عند -80 درجة مئوية. يتم تلخيص الإجراءات البديلة المنشورة لتنقية FtsZ من الإشريكية القولونية و B. subtilis بالإضافة إلى الإشارات إلى إجراءات تنقية FtsZ من مصادر مختلفة في الجدول 1 (انظر قسم النتائج التمثيلية).

< p class = "jove_title" >1. تحضير العينة

  1. تحضير مخازن البلمرة: 1 50 ملي مولار هيبس / هيدروكسيد الصوديوم ، درجة الحموضة 7.5 2 25 ملي مولار ماصي/ هيدروكسيد الصوديوم ، درجة الحموضة 6.8 3 50 ملي ميغاليترا MES / هيدروكسيد الصوديوم ، درجة الحموضة 6.5 4 50 ملي هيبس / هيدروكسيد الصوديوم ، درجة الحموضة 7.5 ؛ 50 ملي كلوريد كلوريد 5 25 ملي مولار أنابيب / هيدروكسيد الصوديوم ، درجة الحموضة 6.8 ؛ 50 ملي كلوريد كلوريد 6 50 ملي ميساميل MES / هيدروكسيد الصوديوم ، درجة الحموضة 6.5 ؛ 50 ملي كلوريد كلوريد 7 50 ملي هيبس / هيدروكسيد الصوديوم ، درجة الحموضة 7.5 ؛ 300 ملي كلوريد الهيدروكسيوم 8 25 ملي مولار أنابيب / هيدروكسيد الصوديوم ، درجة الحموضة 6.8 ؛ 300 ملي كلوريد كلوريد 9 50 ملي ميساميل / هيدروكسيد الصوديوم ، درجة الحموضة 6.5 ؛ 300 ملي كلوريد كلوريد
  2. قم بتعقيم جميع المخازن المؤقتة باستخدام مرشح غشائي 22 ميكرومتر.
  3. تحضير محاليل مخزون 100 ملي مولار GTP و GDP و MgCl2 في كل مخزن مؤقت للبلمرة من (1).
  4. قم بمسح البروتينات مسبقا عن طريق الدوران عند 100,000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية لجميع التجارب.
< p class = "jove_title" >2. فحص الترسيب FtsZ

  1. قم بإعداد مزيج التفاعل عن طريق إضافة MgCl2 و FtsZ إلى أحد مخازن البلمرة (انظر نقطة تحضير العينة 1) في أنابيب متوافقة مع الطرد المركزي عالي السرعة. يجب أن يكون الحجم الإجمالي 49 ميكرولتر ، مع MgCl2 عند 10 ملي وFtsZ عند 12 ميكرومتر عند الحجم النهائي 50 ميكرولتر.
  2. ضع الأنبوب في حاضنة مع وظيفة الاهتزاز ، واحتضنه لمدة دقيقتين عند 30 درجة مئوية عند 300 دورة في الدقيقة (بدلا من ذلك ، يمكن تحريك العينة برفق وتقطيعها لفترة وجيزة متبوعة بالتسخين المسبق عند 30 درجة مئوية).
  3. ابدأ البلمرة بإضافة 1 ميكرولتر من محلول مخزون GTP أو الناتج المحلي الإجمالي في نفس المخزن المؤقت المستخدم في التجربة (التركيز النهائي 2 ملليمتر). احتضان لمدة 10 أو دقيقتين (للمخازن المؤقتة التي تحتوي على 50 ملي مولار KCl و 300 ملي كلوريد كلوريد ، على التوالي) عند 30 درجة مئوية عند 300 دورة في الدقيقة (أو في حاضنة مع وظيفة الاهتزاز).
  4. انقل الأنابيب إلى دوار جهاز طرد مركزي فائق الدوران لأسفل لمدة 10 دقائق عند 350,000 × جم (89,700 دورة في الدقيقة لدوار TLA 120.1) عند 25 درجة مئوية.
  5. بعد الدوران ، قم بإزالة الأنابيب بعناية من الدوار وانقل المادة الطافية على الفور إلى أنبوب نظيف. قم بإعداد عينات ل SDS-PAGE عن طريق إضافة 20 ميكرولتر من المادة الطفية إلى 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعينة 2x. يغلي لمدة 10 دقائق عند 98 درجة مئوية.
  6. أضف 50 ميكرولتر من 2x عينة عازلة إلى جزء الحبيبات الذي يحتوي على بوليمرات FtsZ. ضع أنبوب الطرد المركزي الفائق في أنبوب سعة 2 مل. أعد تعليق الحبيبات عن طريق الغليان لمدة 10 دقائق عند 98 درجة مئوية ، ثم أضف 50 ميكرولتر من H2O منزوع المعادن لجعل العينة بنفس التخفيف 2x مثل العينة الطافية.
  7. اقلب أنبوب الطرد المركزي الفائق رأسا على عقب في أنبوب سعة 2 مل وقم بالدوران لأسفل لمدة 5 دقائق في جهاز طرد مركزي Eppendorf عند 18,000 × جم.
  8. قم بتحميل 10 ميكرولتر من كل عينة طافية وحبيبات جنبا إلى جنب على هلام SDS-PAGE بنسبة 10٪. قم بتشغيل الجل عند 150 فولت.
    9. قم
  9. بتلطيخ الجل باستخدام Coomassie Brilliant Blue G-250 واحتفظ به للقياس الكمي.
< p class = "jove_title" >3. اختبار الترسيب FtsZ عند الدوران البطيء

  1. قم بإعداد محلول البلمرة كما في الخطوة 2 ، أضف SepF و / أو FtsZ (التركيز النهائي 12 ميكرومتر). يمكن إجراء هذه التجارب في أنابيب بيكمان سعة 1.5 مل التي يمكن التخلص منها مع دوار TLA-55.
  2. ضع الأنبوب في حاضنة مع وظيفة الاهتزاز واحتضنه لمدة دقيقتين عند 30 درجة مئوية عند 300 دورة في الدقيقة.
  3. ابدأ البلمرة بإضافة 1 ميكرولتر من GTP أو الناتج المحلي الإجمالي من محلول مخزون (التركيز النهائي 2 ملليمتر) ، واحتضانه لمدة 20 دقيقة عند 30 درجة مئوية عند 300 دورة في الدقيقة.
  4. قم بالدوران لمدة 15 دقيقة عند 24,600 × جم (20,000 دورة في الدقيقة لدوار TLA 55) عند 25 درجة مئوية.
  5. قم بإزالة المادة الطافية وانقله إلى أنبوب نظيف ، خذ 20 ميكرولتر وانقله إلى 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعينة 2x. يغلي لمدة 10 دقائق عند 98 درجة مئوية.
  6. أضف 50 ميكرولتر من 2x عينة عازلة إلى جزء الحبيبات المحتوي على بوليمرات وأعد تعليقها عن طريق الغليان لمدة 10 دقائق عند 98 درجة مئوية ، أضف 50 ميكرولتر من H2O منزوع المعادن.
  7. قم بتحميل 10 ميكرولتر من كل عينة طافية وحبيبات جنبا إلى جنب على هلام SDS-PAGE بنسبة 10٪. قم بتشغيل الجل عند 150 فولت.
    8. قم
  8. بتلطيخ الجل باستخدام Coomassie Brilliant Blue G-250 واحتفظ به للقياس الكمي.
< p class = "jove_title" >4. القياس الكمي لمقايسات الترسيب FtsZ

  1. التقط صورة للجل الملون ب Coomassie باستخدام نظام توثيق الجل (مثل LAS-4000 ، Fujifilm).
  2. افتح صورة الجل في برنامج مناسب لتحليل قياس الكثافة للمواد الهلامية (مثل برنامج محلل الصور AIDA (Raytest)) ووصف التحليل في هذا البرنامج أدناه.
  3. انقر فوق الزر "تقييم" في شريط الأدوات.
  4. حدد "قياس الكثافة ثنائي الأبعاد" من القائمة وانقر فوق موافق.
  5. في القائمة الرئيسية ، انقر فوق "تقييم" واختر إدخال "تحديد المنطقة".
  6. لإنشاء منطقة على الهلام، انقر فوق رمز أداة التحديد التلقائي في مربع أدوات تحديد المنطقة.
  7. انقر في الزاوية اليسرى العليا من شريط البروتين على الجل ، واضغط باستمرار على زر الماوس واسحبه إلى الطرف الأيمن السفلي المطلوب من الشريط وحرر زر الماوس.
  8. ضع علامة على كل نطاق FtsZ / SepF بنفس الطريقة.
  9. يمكن العثور على جميع المعلومات حول تقييم المناطق المعينة في تقرير المنطقة. للحصول على تقرير المنطقة، انقر فوق الزر "إظهار تقرير المنطقة" في مربع أدوات تحديد المنطقة.
  10. لتصدير التقرير ، في القائمة الرئيسية ، انقر فوق ملف واختر إدخال "تصدير à 2D تقرير المنطقة".
  11. في تقرير المنطقة ، يجب العثور على كثافة كل منطقة تم إنشاؤها. احسب النسبة المئوية للبروتين (FtsZ ، البروتين التنظيمي) في الحبيبات باستخدام قيم الكثافة من التقرير.
فئة

5. تشتت الضوء 90 درجة

  1. قم بتشغيل مطياف التألق (على سبيل المثال AMINCO-Bowman Series 2) ، واسمح للمصباح بالتسخين لعدة دقائق لتجنب التقلبات الحرارية وتشغيل حمام مائي دائري للحفاظ على درجة حرارة غرفة الكوفيت عند 30 درجة مئوية.
  2. تحديد معلمات تشغيل مطياف: كاشف الجهد العالي 300 فولت ، الطول الموجي للانبعاث والإثارة: 350 نانومتر ، عرض الشق: 4 نانومتر. لاحظ أن العديد من مقاييس الطيف تقوم تلقائيا بضبط الإشارة في بداية التجربة إلى نسبة مئوية معينة (على سبيل المثال 60٪) من الحد الأقصى. يؤدي هذا إلى خروج إشارة التشتت من النطاق بمجرد إضافة GTP لبلمرة FtsZ. من الحكمة أولا إنشاء تضخيم الإشارة الصحيح - الجهد العالي للكاشف - لتحقيق أقصى قدر من البلمرة قبل البدء في سلسلة من التجارب.
  3. برمجة بروتوكول الحصول على البيانات. اختر الاستحواذ المستند إلى الوقت ، لمدة 3,600 ثانية.
  4. قم بتنظيف كوفيت مضان بعناية بالماء والإيثانول ، إذا لزم الأمر - صوتنة في حمام مائي في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. في هذا البروتوكول ، تم استخدام الكوفيتات بطول مسار 1 سم وحجم 200 ميكرولتر وتخزينها في محلول تخزين (0.5-1٪ Hellmanex). كبديل ، يمكن استخدام الكوفيتات البلاستيكية ذات الاستخدام الواحد المتوافقة مع الأشعة فوق البنفسجية (UVette ، Eppendorf).
  5. قم بإعداد 294 ميكرولتر من مزيج رئيسي من المخزن المؤقت للبلمرة (انظر نقطة تحضير العينة 1) مع 10 ملي مولار MgCl2 و 12 ميكرومتر FtsZ كتركيز نهائي محسوب ل 300 ميكرولتر ، والدوامة.
  6. انقل 196 ميكرولتر من مخزن البلمرة إلى الكوفيت وضعه في مقياس الطيف. احتضن لمدة دقيقتين عند 30 درجة مئوية.
  7. ابدأ الحصول على البيانات وانتظر لمدة 90 ثانية للتحقق من استقرار الإشارة.
  8. أضف 4 ميكرولتر من 100 ملي مولار GTP أو الناتج المحلي الإجمالي (التركيز النهائي: 2 ملليمتر) لتحقيق حجم تفاعل نهائي يبلغ 200 ميكرولتر، مع الماصة لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة أكبر حجما للخلط واستئناف الاستحواذ.
فئة

6. الفحص المجهري الإلكتروني للإرسال

  1. قم بإعداد عينات كما هو الحال بالنسبة لمقايسة الترسيب FtsZ (يمكن تقليل الحجم إلى 10 ميكرولتر الحجم النهائي لتوفير المواد).
  2. بعد وقت الحضانة ، ضع 2 ميكرولتر من العينة على شبكة نحاسية مطلية بالكربون 400 شبكة ، واحتضانها لمدة 15 ثانية.
  3. جفف الشبكة عن طريق لمس الشبكة برفق أو سحبها بشكل متوازي أو عمودي على قطعة من ورق الترشيح.
  4. قم بتلطيخ الشبكة باستخدام 4 ميكرولتر من محلول أسيتات اليورانيل بنسبة 2٪. جفف الشبكة كما هو موضح في الخطوة 6.3.
  5. اعرض الشبكة في المجهر الإلكتروني CM120 من Philips الذي يعمل بسرعة 120 كيلو فولت بتكبير 39,200 ضعف.
< p class = "jove_title" >7. فحص التحلل المائي GTP

تم تصميم إعداد التجربة بطريقة يتم فيها إيقاف التحلل المائي GTP ل FtsZ بعد أوقات تفاعل مختلفة عن طريق خلط التفاعل مع أخضر الملكيت. بهذه الطريقة ، يكون وقت تطور لون أخضر الملكيت هو نفسه لكل عينة.

  1. قم بإعداد 1.5 مل 2 ملي مولار GTP في أحد مخازن البلمرة (انظر تحضير العينة ، النقطة 1).
    قم بإعداد تخفيف قياسي للفوسفات 0-40 ميكرومتر في مخزن مؤقت للبلمرة ، وقم بإعداد كاشف عمل أخضر الملكيت كما هو موضح في مجموعة POMG-25H (المقايسات الحيوية). بدلا من ذلك ، يمكن تحضير الكواشف العاملة داخليا وفقا للبروتوكولات التي وصفها Lanzetta et al.16
  2. تحضير الخلطات الرئيسية بحجم إجمالي 360 ميكرولتر: أنا 24 ميكرومتر FtsZBs ، 20 ملي مولار MgCl2 ، مخزن مؤقت للبلمرة الثاني 12 ميكرومتر FtsZEc ، 20 ملي مولار MgCl2 ، مخزن مؤقت للبلمرة III (عنصر التحكم 1) 24 ميكرومتر FtsZBs ، 2 ملي مولار EDTA ، مخزن مؤقت للبلمرة IV (التحكم 2) 12 ميكرومتر FtsZEc ، 2 ملي مولار EDTA ، مخزن مؤقت للبلمرة
  3. ماصة 20 ميكرولتر من الخلطات الرئيسية ، 100 ميكرولتر من معايير الفوسفات و 180 ميكرولتر من 2 ملي مولار GTP في صفيحة qPCR ذات 96 بئر بالترتيب التالي: أ ب ج د ه ويف ز ح 1 الثالث الثالث أنا أنا رابعا رابعا الثاني الثاني 2 الثالث الثالث أنا أنا رابعا رابعا الثاني الثاني 3 الثالث الثالث أنا أنا رابعا رابعا الثاني الثاني 4 الثالث الثالث أنا أنا رابعا رابعا الثاني الثاني 5 الثالث الثالث أنا أنا رابعا رابعا الثاني الثاني 6 الثالث الثالث أنا أنا رابعا رابعا الثاني الثاني 7 الثالث الثالث أنا أنا رابعا رابعا الثاني الثاني 8 الثالث الثالث أنا أنا رابعا رابعا الثاني الثاني 9 ملاحظة ملاحظة ملاحظة ملاحظة ملاحظة ملاحظة ملاحظة ملاحظة 10 ملاحظة ملاحظة ملاحظة ملاحظة ملاحظة ملاحظة ملاحظة ملاحظة 11 12 GTP GTP GTP GTP GTP GTP GTP GTP < / > PS - معيار الفوسفات
  4. ضع لوحة qPCR في جهاز PCR مع ضبط البرنامج على دورة 40 دقيقة عند 30 درجة مئوية.
  5. قم بإعداد 20 ميكرولتر من كاشف العمل الأخضر الملكيت في صفيحة سعة 96 بئرا. أضف 60 ميكرولتر من المخزن المؤقت للبلمرة من التجربة إلى الممرات 1'-8'. سيتم تخفيف العينة 4 مرات مقارنة بمعيار الفوسفات ، يرجى مراعاة هذه الحقيقة أثناء الحسابات النهائية. أ ب ج د ه ويف ز ح 1 ' الثالث الثالث أنا أنا رابعا رابعا الثاني الثاني 2 ' الثالث الثالث أنا أنا رابعا رابعا الثاني الثاني 3 ' الثالث الثالث أنا أنا رابعا رابعا الثاني الثاني 4 ' الثالث الثالث أنا أنا رابعا رابعا الثاني الثاني 5 ' الثالث الثالث أنا أنا رابعا رابعا الثاني الثاني 6 ' الثالث الثالث أنا أنا رابعا رابعا الثاني الثاني 7 ' الثالث الثالث أنا أنا رابعا رابعا الثاني الثاني 8 ' الثالث الثالث أنا أنا رابعا رابعا الثاني الثاني 9 ' ملاحظة ملاحظة ملاحظة ملاحظة ملاحظة ملاحظة ملاحظة ملاحظة 10 ' ملاحظة ملاحظة ملاحظة ملاحظة ملاحظة ملاحظة ملاحظة ملاحظة
  6. أضف 20 ميكرولتر من GTP إلى المسار 1 ، وقم بتحريك الماصة لأعلى ولأسفل للخلط ، وبدء مؤقت (هذه هي نقطة البداية الزمنية للتفاعل لمدة 30 دقيقة).
  7. بعد 10 دقائق و 30 ثانية ، أضف GTP إلى المسار 2 ، وقم برفع الماصة لأعلى ولأسفل للخلط (تفاعل لمدة 20 دقيقة).
  8. بعد 16 دقيقة ، أضف GTP إلى الممر 3 ، وقم بتمرير الماصة لأعلى ولأسفل للخلط (تفاعل لمدة 15 دقيقة).
  9. بعد 21 دقيقة و 30 ثانية ، أضف GTP إلى المسار 4 ، وقم بتحريك الماصة لأعلى ولأسفل للخلط (تفاعل لمدة 10 دقائق).
  10. بعد 25 دقيقة ، أضف GTP إلى الممر 5 ، وقم بتحريك الماصة لأعلى ولأسفل للخلط (تفاعل 7 دقائق).
  11. بعد 27 دقيقة و 30 ثانية ، أضف GTP إلى المسار 6 ، وقم بتحريك الماصة لأعلى ولأسفل للخلط (تفاعل 5 دقائق).
  12. بعد 29 دقيقة ، أضف GTP إلى الممر 7 ، وقم بتحريك الماصة لأعلى ولأسفل للخلط (تفاعل 4 دقائق).
  13. بعد 30 دقيقة ، قم بنقل 20 ميكرولتر من الممر 1 إلى الممر 1 ، قم بنقل الماصة لأعلى ولأسفل للخلط (نقطة البداية لتطور اللون الأخضر للملكيت للتفاعل لمدة 30 دقيقة).
  14. بعد 30 دقيقة و 30 ثانية ، انقل 20 ميكرولتر من حارة 2 إلى 2 بوصة ، قم بتحريك الماصة لأعلى ولأسفل للخلط (نقطة البداية لتطور اللون الأخضر للملكيت للتفاعل لمدة 20 دقيقة).
  15. كرر الخطوة للممرات من 3 إلى 7 كل 30 ثانية.
  16. بعد 33 دقيقة و 30 ثانية ، أضف 20 ميكرولتر من GTP إلى المسار 8 ، وقم بإزالة الماصة لأعلى ولأسفل لخلط ونقل 20 ميكرولتر إلى حارة 8 بوصات ، وقم بتحريك الماصة لأعلى ولأسفل للخلط (0 دقيقة من التفاعل ونقطة البداية لتطوير اللون الأخضر للملكيت للتفاعل).
  17. بعد 34 دقيقة ، أضف 80 ميكرولتر من الممر 9 إلى 9 '، الماصة لأعلى ولأسفل للخلط (نقطة البداية لتطوير اللون الأخضر الملكيت لمعيار الفوسفات 1).
  18. بعد 34 دقيقة و 30 ثانية ، انقل 80 ميكرولتر من حارة 10 إلى 10 بوصات ، ماصة لأعلى ولأسفل للخلط (نقطة البداية لتطوير اللون الأخضر للملكيت لمعيار الفوسفات 2).
  19. قم بإزالة جميع فقاعات الهواء من العينات واحتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 25 دقيقة و 30 ثانية أخرى.
  20. ضع اللوحة في قارئ الألواح 96 بئر.
  21. بعد 60 دقيقة ، قم بقياس اللوحة 10x كل 30 ثانية بطول موجي 630 نانومتر (تطور اللون الأخضر الملكيت هو الآن 30 دقيقة للتفاعل الأول). يتوافق كل قياس مع كل نقطة زمنية من الخطوتين 7.6-7.12 و 7.16 ويجب حسابه بشكل منفصل أثناء تحليل البيانات.
  22. احسب الفوسفات الحر في كل عينة باستخدام منحنى المعايرة القياسي للفوسفات.
  23. ارسم البيانات على أنها إطلاق الفوسفات بمرور الوقت ، واحسب نشاط التحلل المائي FtsZ GTP من النطاق الخطي للمنحنى.

النتائج

تم وصف تنقية FtsZ من مصادر بكتيرية مختلفة في الدراسات السابقة، وهي ملخصة في الجدول 1.

المصدرالطريقةالتعديلالحصيلة التي تم الحصول عليها [mg/L من المزرعة]>المراجع
B. subtilis1) الترسيب بكبريتات الأمونيوم/كروماتوغرافيا التبادل الأيونيلا يوجد40هذا العمل، 11، 15
2) كروماتوغرافيا الألفةHis-tagND17
E. coli1) الترسيب بكبريتات الأمونيوم/كروماتوغرافيا التبادل الأيونيلا يوجد35هذا العمل، 11، 15
2) الترسيب بالكالسيوم، كروماتوغرافيا التبادل الأيونيلا يوجد4018
Methanococcus jannaschii1) كروماتوغرافيا الألفة تحت ظروف مسخ/إعادة الطي/الترسيب بكبريتات الأمونيوم/الترشيح الهلاميHis-tag1.319
2) كروماتوغرافيا الألفة/ الترشيح الهلاميHis-tagND20
Thermotoga maritimaكروماتوغرافيا التبادل الأيوني/الترشيح الهلاميلا يوجد6.719
Pseudomonas aeruginosaكروماتوغرافيا الألفة/الترشيح الهلاميStrep-tag, His-tagND21
Mycobacterium tuberculosis1) كروماتوغرافيا الألفة/التبادل الأيونيلا يوجدND22
2) كروماتوغرافيا الألفة/ الترشيح الهلاميلا يوجد3023
Aquifex aeolicusكروماتوغرافيا الألفة/الترشيح الهلاميHis-tag، بتر الطرف الكربوكسيلي (331-367)ND24
Caulobacter crescentusكروماتوغرافيا التبادل الأيوني/الترسيب بكبريتات الأمونيوم/الترشيح الهلاميلا يوجدND25

الجدول 1. بروتوكولات تنقية FtsZ الموضحة. ND: لم يتم تحديده.

ترسيب بوليمرات FtsZ

في البداية، استخدمنا سرعتين مختلفتين لترسيب بوليمرات FtsZ عن طريق الطرد المركزي. ووجدنا أنه عند سرعة 350,000 x g فقط يتم ترسيب البوليمرات الفردية لـ FtsZEc (الشكل 1)، بينما عند 190,000 x g توجد فقط حزم من FtsZBs في جزء الراسب (البيانات غير معروضة). وبناءً على ذلك، تم استخدام 350,000 x g في تجاربنا اللاحقة. وكانت نسبة FtsZEc وFtsZBs المبولمرة متشابهة عند 50 mM KCl، على الرغم من أن تجارب تشتت الضوء كشفت عن إشارة تشتت أعلى بكثير لـ FtsZBs. ويرجع ذلك إلى الحزم التي يشكلها FtsZBs والتي تشتت الضوء بشكل أكبر من البوليمرات الفردية لـ FtsZEc. ولم يكن من الممكن الحصول على كمية كبيرة من بوليمرات FtsZ في جزء الراسب في التجربة التي استخدمت 300 mM KCl لكل من FtsZEc وFtsZBs (الشكل 1). ونعزو ذلك إلى مزيج من التفكك السريع لبنى FtsZ وانخفاض تكتل الخيوط في حزم.

ترسيب أنيبات FtsZ-SepF

لتحليل تفاعل FtsZ مع منشطات معينة، يمكن إجراء مقايسات الترسيب عند سرعات طرد مركزي منخفضة. عند هذه السرعة، يمكن ترسيب الهياكل الكبيرة من FtsZ فقط، على سبيل المثال، الأنابيب الكبيرة التي تشكلها حلقات SepF وخيوط FtsZBs5، أو الحزم التي يشكلها FtsZ و ZapA. لقد استخدمنا طرداً مركزياً أقل (24,600 x g) لإثبات جدوى هذا النهج بالنسبة للأنابيب التي يشكلها FtsZ و SepF. تم استعادة FtsZ في الراسب فوق مستويات الخلفية فقط عندما كان كل من SepF و GTP موجودين في العينة (الشكل 2)، كما أن وجود SepF لا يؤثر على نشاط GTPase لـ FtsZ7، مما يوضح أن FtsZ يكون نشطاً بالكامل في وجود SepF. يبلغ الترسيب النوعي لـ SepF و FtsZ حوالي 45% من إجمالي SepF و 15% من إجمالي FtsZ (مقارنة بالمواد التي تترسب عند إضافة GDP). وهذا يوضح أن أنابيب SepF-FtsZ تحتوي على كمية من SepF أكثر من FtsZ. قد يكون ذلك بسبب قيام العديد من حلقات SepF بتنظيم أنابيب FtsZ-SepF5,7. إن القياس الكمي الدقيق لـ SepF-FtsZ في هذه الأنابيب غير معروف، ولكن نتائجنا تشير إلى وجود كمية من SepF أكثر من FtsZ.

خصائص بلمرة وتجميع FtsZEc و FtsZBs في حزم

لتوصيف كفاءة بلمرة FtsZبصيرة و FtsZEc قمنا بتحليل كلا البروتينين في محاليل منظمة مختلفة عن طريق 90° تشتت الضوء بزاوية. عند تركيز 50 ملي مولار من KCl، فإن FtsZبأس (Bs) يعطي إشارة تشتت ضوئي أعلى بـ 20 إلى 40 ضعفاً مقارنة بـ FtsZإي كولاي (Ec) بناءً على الرقم الهيدروجيني (pH) للمحلول المنظم (الشكل 3A و B) تأكيد نتائج Buske وآخرون.26 لم تؤدِ زيادة تركيز KCl في المحلول المنظم إلى تأثير ملحوظ على إشارة تشتت الضوء لبروتين FtsZ.إس شيريكيا كولاي (Escherichia coli) (الشكل 3D) ولكن إشارة FtsZبصمات الأصابع (Bs) انخفض بمقدار 80 ضعفاً تقريباً عند الرقم الهيدروجيني 7.5، و30 ضعفاً تقريباً عند الرقم الهيدروجيني 6.8، و45 ضعفاً تقريباً عند الرقم الهيدروجيني 6.5 في محلول KCl بتركيز 300 ملي مولار (الشكل 3ج) مقارنةً بالمحاليل المنظمة التي تحتوي على 50 مللي مولار من كلوريد البوتاسيوم (KCl) (الشكل 3أيكون تفكيك بوليمرات FtsZ أسرع عند التركيزات الأعلى من KCl لكلا البروتينين (الأشكال 3C و د). دراسات باتشيكو غوميز (Pacheco-Gómez) وآخرونبَيِّن أنَّ *E. coli* تعتمد بلمرة FtsZ وتجميعه في حزم على الرقم الهيدروجيني (pH). وقد وجد هؤلاء المؤلفون أنه في محلول منظم يحتوي على 50 ميليمول من KCl، كانت إشارة تشتت الضوء لبلمرة FtsZ أعلى، واستغرق تفكك FtsZ وقتاً أطول عند الرقم الهيدروجيني 6.0 مقارنة بالرقم الهيدروجيني 7.0. 8لا تتفق هذه النتائج مع البيانات التي حصلنا عليها من بلمرة FtsZ.إشيريشيا كولاي (E. coli) عند تركيز 50 ملي مولار من كلوريد البوتاسيوم (KCl (الشكل 3B)، ولكن تجدر الإشارة إلى أننا استخدمنا ثلاثة محاليل منظمة مختلفة (HEPES وMES وPIPES) في حين استخدم Pacheco-Gómez وآخرونتم استخدام MES فقط. وبناءً على ذلك، لا يؤثر الرقم الهيدروجيني فحسب، بل تؤثر تركيبة المنظم (القوة الأيونية) أيضاً على حركية بوليمرات FtsZ عند تركيز 50 ملي مولار من KCl. ومع ذلك، عند تركيز 300 ملي مولار من KCl، لم تؤثر تركيبة المنظم ولا الرقم الهيدروجيني على FtsZ.إي كولاي (Ec) تجميع بطريقة قابلة للكشف.

لم يكن من الممكن إجراء تجربة تشتت الضوء لبروتين FtsZBs في محاليل منظمة خالية من KCl بسبب ترسيب البروتين في ظل هذه الظروف. وعندما تم خفض تركيز FtsZBs إلى 3 µM، لم يحدث ترسيب. ومع ذلك، فإن 3 µM ليس التركيز الفسيولوجي لـ FtsZ في الخلية. وفي الكيوفيتات البلاستيكية، لم يترسب FtsZBs عند تركيز 12 µM وبدرجة حموضة pH 7.5، ولكن عند pH 6.8 و 6.5، ظل FtsZ يترسب في غياب KCl.

مورفولوجيا هياكل FtsZ من E. coli و B. subtilis

فُحصت البنى التي شكلها البروتين FtsZ بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ (TEM). وقد تجمع FtsZBs في بوليمرات متراصة بشدة غطت الشبكة بالكامل في جميع المحاليل المنظمة ذات الملوحة المنخفضة (الأشكال 4A-C). بينما شكل FtsZEc خيوطاً طويلة وكابلات وحزمات في جميع المحاليل المنظمة ذات الملوحة المنخفضة (الأشكال 4D-F). ومع ذلك، كانت كمية البوليمرات الملحوظة التي شكلها FtsZEc أقل من الكمية التي شكلها FtsZBs. وفي المحاليل المنظمة ذات الملوحة العالية، شكل FtsZBs خيوطاً أولية أحادية السلسلة وأطول لم تتجمع في حزمات (الأشكال 4G-I). وبينما تغيرت بنية خيوط FtsZBs الأولية عند تركيز ملحي أعلى، شكل FtsZEc بنىً لا تختلف عن تلك الموجودة في المحلول المنظم ذي الملوحة المنخفضة (الأشكال 4J-L). ولم يظهر أي تأثير ملحوظ للأس الهيدروجيني (pH) على بلمرة FtsZEc، ولكن FtsZBs شكل المزيد من الحزمات عند pH 6.5، والتي ظهرت كبوليمرات وصفائح متراصة بشدة (الشكل 4B). وتتفق هذه النتائج مع تجارب تشتت الضوء وأعمال المجهر الإلكتروني النافذ المنشورة سابقاً8,11,26.

نشاط GTPase لبروتين FtsZ عند تركيزات KCl العالية والمنخفضة

تم قياس نشاط تحلل GTP لبروتين FtsZ تحت ظروف مختلفة باستخدام مقايسة لونية للفوسفات الحر. وكما ورد سابقاً15، زاد نشاط GTPase لبروتين FtsZ مع زيادة تركيز KCl: واعتماداً على المنظم المستخدم، أظهر FtsZBs زيادة بمقدار 3-7 أضعاف، بينما أظهر FtsZEc زيادة بمقدار 1.5-2.5 ضعف في نشاط GTPase عند تركيز 300 mM KCl مقارنة بتركيز 50 mM KCl. ويعود انخفاض نشاط GTPase عند 50 mM KCl إلى تكتل خيوط FtsZBs. وعند تركيز 50 mM KCl، كان نشاط GTPase في FtsZEc أعلى بمقدار 3-6 أضعاف منه في FtsZBs بسبب التفكك الأسرع لبوليمرات FtsZEc. وقد قل الفرق في نشاط تحلل GTP بين FtsZBs وFtsZEc عند تركيز 300 mM KCl، وربما يرجع ذلك إلى انخفاض تكتل خيوط FtsZBs (الشكل 5).

بلمرة FtsZ، تحليل نسبة الراسب، رسم بياني شريطي، الفصل الكهربائي للهلام، مقارنة تأثير GTP/GDP.
الشكل 1. تقدير كمية بلمرة FtsZ عن طريق الترسيب. (A) تمت بلمرة 12 µM من FtsZ في وجود 2 mM من GTP أو GDP عند pH 7.5 (الأشرطة السوداء)، أو 6.8 (الأشرطة الرمادية)، أو 6.5 (الأشرطة البيضاء). تم تحديد كمية البروتين المترسب عن طريق التحليل الكثافتي لهلامات مصبوغة بصبغة Coomassie. استُخدم GDP كضابط للترسيب النوعي، وطُرحت نسبة FtsZ المترسبة مع GDP من نسبة FtsZ المترسبة مع GTP للحصول على القيم الموضحة في الرسم البياني. على اليسار: FtsZ المترسب عند 50 mM KCl، وعلى اليمين: FtsZ المترسب عند 300 mM KCl. (B) نتائج ممثلة من هلامات مصبوغة بصبغة Coomassie. بلمرة FtsZBs (الهلام العلوي) و FtsZEc (الهلام السفلي) عند 50 mM KCl. (S) السائل العلوي، (P) أجزاء الراسب من التجربة. انقر هنا لعرض صورة أكبر.

رسم بياني لتفاعل FtsZ و SepF وهلام يوضح تأثير GTP/GDP على النسبة المئوية للبروتين المترسب.
الشكل 2. ترسيب أنابيب SepF/FtsZ عند سرعة منخفضة. (A) تم بلمرة 12 µM من FtsZBs بوجود 2 mM من GDP (الأعمدة البيضاء) أو GTP (الأعمدة السوداء). تم تحديد كمية البروتين المترسب عن طريق تحليل كثافة الهلام المصبوغ بصبغة Coomassie. تشير علامتا + و - تحت محور السينات إلى وجود أو غياب FtsZ و SepF في التفاعل. (B) نتائج تمثيلية من هلام مصبوغ بصبغة Coomassie. بلمرة FtsZBs في وجود وغياب SepF. تم استخدام SepF بدون FtsZ كمجموعة ضابطة. أجريت البلمرة باستخدام GTP و GDP. (S) الرائق، (P) أجزاء الراسب من التجربة. انقر هنا لعرض صورة أكبر.

رسوم بيانية لتشتت الضوء لبروتين FtsZ مع تركيزات مختلفة من KCl؛ تظهر تأثيرات pH 6.5 و6.8 و7.5.
الشكل 3. تشتت الضوء لـ 12 μM من FtsZEc و12 μM من FtsZBs. تم تجميع بروتينات FtsZ في وجود 2 mM من GTP وتمت مراقبة البلمرة عن طريق تشتت الضوء بزاوية 90°. بلمرة FtsZBs (A) وFtsZEc (B) عند 50 mM من KCl عند pH 7.5 وpH 6.8 وpH 6.5. بلمرة FtsZBs (C) وFtsZEc (D) عند 300 mM من KCl عند pH 7.5 وpH 6.8 وpH 6.5. انقر هنا لعرض صورة أكبر.

المجهر الإلكتروني لبوليمرات FtsZ عند قيم pH وتركيزات KCl مختلفة؛ تحليل هيكلي.
الشكل 4. هياكل بوليمرات FtsZBs و FtsZEc التي تم تصورها بواسطة المجهر الإلكتروني. (A-L) صور لـ 12 µM من FtsZBs (A-C و G-I) و FtsZEc (D-F) و (J-L) تم بلمرتها باستخدام 2 mM GTP. (A-C) FtsZBs في محلول منظم بتركيز 50 mM KCl وقيم pH تبلغ 7.5 و 6.8 و 6.5 على التوالي. (D-F) FtsZEc في محلول منظم بتركيز 50 mM KCl وقيم pH تبلغ 7.5 و 6.8 و 6.5 على التوالي. (G-I) FtsZBs في محلول منظم بتركيز 300 mM KCl وقيم pH تبلغ 7.5 و 6.8 و 6.5 على التوالي. (J-L) FtsZEc في محلول منظم بتركيز 300 mM KCl وقيم pH تبلغ 7.5 و 6.8 و 6.5 على التوالي. شريط المقياس: 100 nm. انقر هنا لعرض صورة أكبر.

رسم بياني لنشاط GTPase؛ مخطط أعمدة لـ FtsZ عند 50mM مقابل 300mM KCl، مع تغيرات في pH بمقادير 7.5، 6.8، 6.5.
الشكل 5. تحلل GTP أثناء بلمرة FtsZ في 6 محاليل منظمة مختلفة. تم استخدام 2 mM GTP في جميع التجارب. واستُخدمت عينة ضابطة بدون MgCl2. تم طرح نشاط FtsZ بدون MgCl2 من نشاط FtsZ في وجود MgCl2. على اليسار: نشاط GTPase لـ FtsZ عند 50 mM KCl، وعلى اليمين: نشاط GTPase لـ FtsZ عند 300 mM KCl. انقر هنا لعرض صورة أكبر.

المناقشة

نصف مجموعة من الطرق التي تسمح بتحليل سريع لنشاط FtsZ وتفاعله مع البروتينات الأخرى. تم استخدام تشتت الضوء والترسيب ومقايسات GTPase بالإضافة إلى الفحص المجهري الإلكتروني على نطاق واسع لدراسة بلمرة FtsZ. لقد أجرينا بعض التحسينات على البروتوكولات الحالية ، وأظهرنا تأثير الظروف المختلفة على تجميع FtsZ ، ونقترح ضوابط يجب تضمينها في دراسات FtsZ.

نقدم الطرد المركزي منخفض السرعة للتمييز بين الهياكل الكبيرة التي تشكلت من خلال الارتباط بين FtsZ والبروتينات المتفاعلة من بوليمرات FtsZ. تظهر هذه الطريقة ميزتين على مقايسة الترسيب القياسية. أولا ، لا يتم تشكيل خلفية بواسطة بوليمرات FtsZ في جزء الحبيبات حيث لا يتم نسجها عند 24,600 × جم. ثانيا ، يمكن حساب كمية FtsZ الموجودة في الهيكل المتكون من بروتين متفاعل من الجل. خطوتان حاسمتان في هذه الطريقة هما وقت الحضانة وتركيز GTP. من المهم أن تقوم بجهاز الطرد المركزي لبنية البروتين الكبيرة عند اكتمالها ولكن قبل تفكيكها عندما يتم تحلل كل GTP. أفضل تحكم لهذه الدراسة هو بلمرة FtsZ مع الناتج المحلي الإجمالي. هناك قيد محتمل واحد للمقايسة. يشكل FtsZ مركبا مستقرا مع SepF ، والذي يمكن نسجه بسهولة عند 24,600 × جم. إذا تم إجراء الترسيب باستخدام منشط آخر أو دواء يجمع بوليمرات FtsZ ، فقد يكون من الضروري تكييف الفحص. يمكن القيام بذلك عن طريق تغيير وقت الحضانة ، أو زيادة سرعة الطرد المركزي.

يعد التحضير السليم للعينة هو الأهم لتجارب تشتت الضوء. يجب مسح البروتينات مسبقا عن طريق الغزل ويجب تصفية جميع المخازن المؤقتة قبل الاستخدام. في حالة وجود أي مجاميع في العينة ، فإنها ستعطل إشارة مستقرة تم الحصول عليها من بوليمرات FtsZ. لتحليل هياكل FtsZ بواسطة المجهر الإلكتروني ، فإن إعداد الشبكة هو الخطوة الرئيسية. سيكون لوقت حضانة العينة على الشبكة تأثير في إنتاج بوليمرات مضغوطة أكثر أو أقل. بالنسبة لحزم FtsZBs ، يجب أن يكون وقت الحضانة أقصر من FtsZEc و FtsZBs بتركيز KCl عال. استخدمنا تركيزا قدره 12 ميكرومتر لكل عينة لنتمكن من مقارنة النتائج. ومع ذلك ، بالنسبة ل FtsZBs عند 50 ملي KCl ، يجب استخدام تركيز أقل من FtsZ ، حيث أدى 12 ميكرومتر إلى تشبع كامل للشبكة. هذا يجعل البوليمرات مضغوطة للغاية ويصعب اكتشافها. من الأفضل اكتشاف البوليمرات الأقل ضغطا على EM.

اختبار GTPase هو التجربة الوحيدة المستخدمة لدراسة النشاط بدلا من هياكل FtsZ. Mg2+ ضروري لدوران GTP في بوليمرات FtsZ. وبالتالي ، في حالة عدم وجود Mg2+ ، لا يقوم FtsZ بالتحلل المائي ل GTP. لذلك ، فإن العينة التي لا تحتوي على Mg2+ هي عنصر التحكم الصحيح في هذا الاختبار ولكن كاتيونات Mg موجودة في مخزن تخزين FtsZ. يمكن إزالتها بإضافة 1 ملي مولار EDTA إلى عينة التحكم. الخطوة الحاسمة في هذا الفحص هي وقت الحضانة. من المهم إيقاف نشاط FtsZ بعد وقت معين. يتم تحقيق ذلك عن طريق نقل عينة FtsZ إلى محلول أخضر من الملكيت في صفيحة مكونة من 96 بئرا. ومع ذلك ، فإن تطوير اللون الأخضر الملكيت هو عملية مستمرة. وبالتالي يجب أخذ القياسات في نفس الوقت لكل عينة. باستخدام بروتوكول إضافة GTP مخطط جيدا مع قياسات مأخوذة كل 30 ثانية بترتيب محدد ، من الممكن الحصول على نفس وقت الحضانة ومعالجة العينة لكل نقطة زمنية. خطوة أخرى حاسمة هي اختيار تركيز البروتين للتجربة. في التجربة استخدمنا تركيزين مختلفين ل FtsZEc و FtsZBs. يعد التحلل المائي GTP أسرع بكثير بالنسبة ل FtsZEc مقارنة ب FtsZBs. نشاط GTPase ل FtsZEc في ظل الظروف المختارة وعند 12 ميكرومتر خطي فقط لمدة 5 دقائق كحد أقصى وبعد ذلك الوقت هضاب معدل التحلل المائي. وبالتالي ، من الصعب تفسير البيانات من التجربة عند إجراؤها في ظل هذه الظروف. في هذه الحالة ، يجب استخدام FtsZEc بتركيز أقل من FtsZBs لتتمكن من مقارنة أنشطة كلا البروتينين. قد يختلف نشاط GTPase ل FtsZs من مصادر مختلفة. وبالتالي ، يجب اختيار التركيز الصحيح. يجب أن يكون تركيز بلمرة FtsZ أعلى بكثير من التركيز الحرج (بشكل عام من 2.5-10 ميكرومتر). ديناميكيات تجميع وتفكيك FtsZ مهمة أيضا. تظهر بعض البروتينات تأخرا كبيرا في البلمرة بعد إضافة GTP ، كما هو موضح ل FtsZBs عند 50 ملي KCl. من المفيد إجراء فحص تشتت الضوء قبل فحص GTPase لتقريب وقت تجميع وتفكيك بوليمرات FtsZ. بعد ذلك ، يمكن اختيار وقت الحضانة وتركيز البروتين. نظرا لأن الشروط المختارة لبلمرة FtsZ حاسمة ، فمن المهم استخدام تركيز الأس الهيدروجيني و KCl الصحيح في كل طريقة. في هذا العمل درسنا 9 مخازن مؤقتة مختلفة بدرجة حموضة تتراوح من 6.5-7.5 وتركيزات KCl من 0 M إلى 300 mM. لاحظنا أن أفضل شرط لتحليل FtsZs من B. subtilis و E.coli ونشاطهما البيولوجي هو عند درجة الحموضة القريبة من المستوى الفسيولوجي (7.5) جنبا إلى جنب مع تركيز عال من KCl. عند تركيز KCl عال ، تتمتع FtsZ بنشاط GTPase أعلى وتنتج بوليمرات يمكن اكتشافها بشكل أفضل عن طريق المجهر الإلكتروني. أكدنا أيضا أن الرقم الهيدروجيني الفسيولوجي وتركيز KCl العالي أفضل لدراسة التفاعل بين FtsZ والبروتينات التنظيمية من أي مخازن مؤقتة أخرى تستخدم في الغالب لدراسة تجميع FtsZ. يظهر FtsZBs نشاطا مشابها ل FtsZEc عند دراسته بتركيز عال من KCl. بالإضافة إلى ذلك ، عند تركيز الملح المنخفض ، يكون تأثير الأس الهيدروجيني أكثر وضوحا من المخازن المؤقتة ذات التركيز العالي للملح. يترسب FtsZ أحيانا عند استخدام المخازن المؤقتة بدون KCl ، ونتيجة لذلك ، يجب تجنب المخازن المؤقتة بدون ملح. يكون ترسيب بوليمرات FtsZ منخفضا عند استخدام المخازن المؤقتة ذات التركيزات العالية من KCl. قد تكون هذه ميزة عند دراسة التفاعلات بين FtsZ والبروتينات التي تجمع خيوط FtsZ مثل SepF و ZapA حيث يسهل اكتشاف هذه الهياكل ذات الترتيب الأعلى باستخدام الطرد المركزي. في جميع تجاربنا ، استخدمنا MgCl2 بتركيز 10 ملي مولار. لقد تبين أن تركيز Mg2+ المرتفع نسبيا يعمل على استقرار بوليمرات FtsZ ويقلل من نشاط GTPase ل FtsZ. في الجدول 2 ، يتم تلخيص نتائج الدراسات المختلفة التي تصف بلمرة FtsZ ونشاط GTPase بتركيزات مختلفة من Mg2+ باستخدام ظروف عازلة متطابقة 27. التركيز المقاس للسيتوبلازم الحر Mg2+ هو 0.9 ملي مولار3. وتجدر الإشارة إلى أن GTP سوف يخلب كمية مكافئة من ملغ2+. وبالتالي ، فإن التركيز الأمثل ل Mg2+ لتجارب GTPase هو حوالي 2-2.5 ملي مولار ، وهو قريب من المستوى الفسيولوجي3. ومع ذلك ، في تجاربنا ، استخدمنا MgCl2 بتركيز 10 ملي مولار للحصول على إشارة تشتت ضوئي يمكن اكتشافها بسهولة وتثبيت بوليمرات FtsZ أثناء فحص الترسيب.

على الرغم من أننا طبقنا بروتوكولاتنا على FtsZ من الكائنات الحية النموذجية بكتريا قولونية و ب. رقيقة ، إلا أنه يمكن تكييفها مع FtsZ من أي كائن حي آخر. وتجدر الإشارة إلى أن الرقم الهيدروجيني الفسيولوجي وتركيزات الكاتيونات أحادية التكافؤ وثنائية التكافؤ تختلف بين الكائنات الحية. وبالتالي ، قد تختلف الظروف المثلى لبلمرة FtsZ. قد تؤدي الاختلافات في وقت المضاعفة وظروف نمو البكتيريا المختلفة إلى حركية تجميع مختلفة ل FtsZ والظروف المثلى للتجارب. ومع ذلك ، يوفر بروتوكولنا نقطة انطلاق جيدة للتجارب مع FtsZs من الكائنات الحية الأخرى. يجب أن تكون البروتوكولات مفيدة لدراسة FtsZ مع البروتينات التنظيمية أو دراسة تأثيرات المركبات الصغيرة والأدوية على FtsZ.

مصدرالبلمرة [٪ من FtsZ الرسوب]GTPase [Pi / FtsZ / دقيقة]تركيزملغ 2+ [ملي مولار]تركيز FtsZ [ميكرومتر]مراجع
FtsZEc~ 28٪~ 2.11012هذا العمل
~ 50٪~ 2.41012.527
~ 43٪~ 3.5512.527
~ 27٪~ 4.62.512.527
ND~ 5.42.5526
FtsZبكالوريوس~ 30٪~ 0.812هذا العمل
~ 52٪ (مع ديكستران DEAE)~ 0.5101011
ND~ 2.252.5526

الجدول 2. التأثير على Mg2+ على بلمرة FtsZ و GTPase. نتائج هذا العمل مقارنة بالبيانات المنشورة. أجريت جميع التجارب في 50 ملي مولار MES / هيدروكسيد الصوديوم ، الرقم الهيدروجيني = 6.5 ، 50 ملي كلوريسيوم الكلوريجان.

الإفصاحات

لم يتم الإعلان عن تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

يتم تمويل العمل في مختبرنا من خلال منحة VIDI من المنظمة الهولندية للبحث العلمي (إلى DJS). نشكر مارك ستيوارت وقسم المجهر الإلكتروني في جامعتنا ، للمساعدة في توفير الوصول إلى المجهر الإلكتروني للإرسال.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
GTPRoche10106399001الجزء 1 ، 2 ، 3 ، 4 ، 5 ، 6 ، 7
أنابيب بولي كربونات سميكة الجداربيكمان كولتر343776الجزء 2
Optima MAX-XP جهاز طرد مركزي فائقBeckman Coulter393315الجزء 2 ، 3
أنبوب بولي ألومر مع غطاء إضافيبيكمان كولتر357448الجزء 3
AIDA الحيوية ، 1D ، 2D ، FLRaytest Isotopenmessgerä te GmbH15000001الجزء 4
محلل صور التلألؤ LAS-4000Fujifilmالجزء 4
الطيف الحراري AMINCO-Bowman مطياف التلألؤالأدواتالجزء 5
خلية التألقتحليلات هيلما105-250-15-40الجزء 5
مربع 400 شبكة ، نحاس ، 100 / قارورةعلوم المجهر الإلكترونيG400-Cuالجزء 6
مجهر إلكتروني CM120 يعمل بجهد 120 كيلو فولتPhilipsالجزء 6
96 مل × 0.2 مل لوحةBIOplasticsB70501الجزء 7
مجموعة فحص الفوسفات الأخضر الملكيتنظام الفحص الحيويPOMG-25Hالجزء 7
PowerWave HT مقياس الطيف الضوئي MicroplateBioTekالجزء 7
حزمة الطيفية

المراجع

  1. Haydon, D. J., Stokes, N. R., et al. An inhibitor of FtsZ with potent and selective anti-staphylococcal activity. Science. 321 (5896), 1673-1675 (2008).
  2. Adams, D. W., Errington, J. Bacterial cell division: assembly, maintenance and disassembly of the Z ring. Nat. Rev. Microbiol. 7 (9), 642-653 (2009).
  3. Erickson, H. P., Anderson, D. E., Osawa, M. FtsZ in bacterial cytokinesis: cytoskeleton and force generator all in one. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74 (4), 504-528 (2010).
  4. Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division. EMBO J. 26 (22), 4694-4708 (2007).
  5. Król, E., van Kessel, S. P., van Bezouwen, L. S., Kumar, N., Boekema, E. J., Scheffers, D. J. Bacillus subtilis SepF binds to the C-terminus of FtsZ. PLoS One. 7 (8), e43293(2012).
  6. Singh, J. K., Makde, R. D., Kumar, V., Panda, D. SepF increases the assembly and bundling of FtsZ polymers and stabilizes FtsZ protofilaments by binding along its length. J. Biol. Chem. 283 (45), 31116-31124 (2008).
  7. Gündoğdu, M. E., Kawai, Y., et al. Large ring polymers align FtsZ polymers for normal septum formation. EMBO J. 30 (3), 617-626 (2011).
  8. Pacheco-Gomez, R., Roper, D. I., Dafforn, T. R., Rodger, A. The pH dependence of polymerization and bundling by the essential bacterial cytoskeletal protein FtsZ. PLoS One. 6 (6), e19369(2011).
  9. Mendieta, J., Rico, A. I., Lopez-Vinas, E., Vicente, M., Mingorance, J., Gomez-Puertas, P. Structural and functional model for ionic (K(+)/Na(+)) and pH dependence of GTPase activity and polymerization of FtsZ, the prokaryotic ortholog of tubulin. J. Mol. Biol. 390 (1), 17-25 (2009).
  10. Tadros, M., Gonzalez, J. M., Rivas, G., Vicente, M., Mingorance, J. Activation of the Escherichia coli cell division protein FtsZ by a low-affinity interaction with monovalent cations. FEBS Lett. 580 (20), 4941-4946 (2006).
  11. Scheffers, D. J. The effect of MinC on FtsZ polymerization is pH dependent and can be counteracted by ZapA. FEBS Lett. 582 (17), 2601-2608 (2008).
  12. Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. Analysis of FtsZ assembly by light scattering and determination of the role of divalent metal cations. J. Bacteriol. 181 (3), 823-832 (1999).
  13. Chen, Y., Erickson, H. P. Rapid in vitro assembly dynamics and subunit turnover of FtsZ demonstrated by fluorescence resonance energy transfer. J. Biol. Chem. 280 (23), 22549-22554 (2005).
  14. Hou, S., Wieczorek, S. A., et al. Characterization of Caulobacter crescentus FtsZ protein using dynamic light scattering. J. Biol. Chem. 287 (28), 23878-23886 (2012).
  15. Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. Dynamic assembly of FtsZ regulated by GTP hydrolysis. EMBO J. 17 (2), 462-469 (1998).
  16. Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate. Anal. Biochem. 100 (1), 95-97 (1979).
  17. Ray, S., Kumar, A., Panda, D. GTP regulates the interaction between MciZ and FtsZ: a possible role of MciZ in bacterial cell division. Biochemistry. 52 (2), 392-401 (2013).
  18. Rivas, G., Lopez, A., et al. Magnesium-induced linear self-association of the FtsZ bacterial cell division protein monomer. The primary steps for FtsZ assembly. J. Biol. Chem. 275 (16), 11740-11749 (2000).
  19. Oliva, M. A., Cordell, S. C., Lowe, J. Structural insights into FtsZ protofilament formation. Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (12), 1243-1250 (2004).
  20. Lowe, J., Amos, L. A. Crystal structure of the bacterial cell-division protein FtsZ. Nature. 391 (6663), 203-206 (1998).
  21. Cordell, S. C., Robinson, E. J., Lowe, J. Crystal structure of the SOS cell division inhibitor SulA and in complex with FtsZ. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (13), 7889-7894 (2003).
  22. Chen, Y., Anderson, D. E., Rajagopalan, M., Erickson, H. P. Assembly dynamics of Mycobacterium tuberculosis FtsZ. J. Biol. Chem. 282 (38), 27736-27743 (2007).
  23. White, E. L., Ross, L. J., Reynolds, R. C., Seitz, L. E., Moore, G. D., Borhani, D. W. Slow polymerization of Mycobacterium tuberculosis FtsZ. J. Bacteriol. 182 (14), 4028-4034 (2000).
  24. Oliva, M. A., Trambaiolo, D., Lowe, J. Structural insights into the conformational variability of FtsZ. J. Mol. Biol. 373 (5), 1229-1242 (2007).
  25. Thanbichler, M., Shapiro, L. M. ipZ. a spatial regulator coordinating chromosome segregation with cell division in Caulobacter. Cell. 126 (1), 147-162 (2006).
  26. Buske, P. J., Levin, P. A. Extreme C terminus of bacterial cytoskeletal protein FtsZ plays fundamental role in assembly independent of modulatory proteins. J. Biol. Chem. 287 (14), 10945-10957 (2012).
  27. Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. Analysis of FtsZ assembly by light scattering and determination of the role of divalent metal cations. J. Bacteriol. 181 (3), 823-832 (1999).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

GTP Escherichia coli Bacillus subtilis

مقالات ذات صلة