مقالة منهجية

تحريض الغازية سرطان المثانة الانتقالية الخليوي في المناعة السليمة الإنسان MUC1 الفئران المعدلة وراثيا: نموذج للتنمية الخلايا الجذعية

DOI:

10.3791/50868

⸱

أكتوبر 30, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, Division of Hematology and Oncology, University of California, Davis, 2Comparative Pathology Laboratory, UC Davis School of Veterinary Medicine, University of California, Davis, 3Merck Serono Research, Merck KGaA, Darmstadt, Germany

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وN-بوتيل-N-(4-hydroxybutyl) نيتروماسين التي يسببها تم تطوير نموذج سرطان المثانة في الميوسين الإنسان 1 (MUC1) الفئران المعدلة وراثيا لغرض اختبار MUC1 العلاج المناعي الموجه. بعد بالإدارة لقاح الببتيد MUC1 المستهدفة، وأكد استجابة الخلايا اللمفاوية التائية السامة للخلايا لMUC1 من خلال قياس مستويات خلوى المصل ونشاط محدد تي خلية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم تطوير نموذج ما قبل السريرية لسرطان المثانة الغازية في الميوسين الإنسان 1 (MUC1) المعدلة وراثيا (MUC1.Tg) الفئران لغرض تقييم العلاج المناعي و / أو العلاج الكيميائي السامة للخلايا. للحث على سرطان المثانة، C57BL / 6 الفئران (نوع MUC1.Tg والبرية) وعولج شفويا مع مسرطن N-بوتيل-N-(4-hydroxybutyl) نيتروماسين (OH-BBN) في 3.0 ملغ / يوم، 5 أيام / الأسبوع لمدة 12 أسبوعا. لتقييم آثار OH-BBN على ملف خلوى المصل خلال تطوير الورم، وقد تم جمع الدم كله عبر ينزف تحت الفك السفلي قبل العلاج وكل أربعة أسابيع. وبالإضافة إلى ذلك، كانت تدار لقاح الببتيد MUC1 استهداف وهمي لمجموعات من الفئران أسبوعي لمدة ثمانية أسابيع. أجريت متعددة immunoanalyses microbead فلوروميتريك من السيتوكينات في مصل الدم أثناء تطوير ورم والتطعيم التالي. في الإنهاء، انترفيرون غاما (الإنترفيرون γ) / انترلوكين 4 (IL-4) تحليل ELISPOT لMUC1 محددة الاستجابة المناعية T-خلية والتقييمات الأنسجة من نوع الورموأجريت الصف. أظهرت النتائج ما يلي: (1) كانت نسبة حدوث سرطان المثانة في كلا MUC1.Tg والبرية نوع الفئران 67٪، (2) سرطان الخلايا الانتقالية (TCC) وضعت في نسبة 2:1 مقارنة مع سرطان الخلايا الحرشفية (SCC) ، (3) زيادة السيتوكينات الالتهابية مع الوقت خلال تطوير الورم، و (4) إعطاء اللقاح الببتيد يؤدي الى TH1 الاستقطاب الشخصي خلوى المصل وMUC1 محددة استجابة خلايا T. وكانت جميع الأورام في الفئران MUC1.Tg إيجابية لMUC1 التعبير، وكانت نصف جميع الأورام في MUC1.Tg والبرية نوع الفئران الغازية. وفي الختام، وذلك باستخدام نهج الفريق من خلال تنسيق جهود الصيادلة، مناعة، علم الأمراض والأحياء الجزيئية، قمنا بتطوير نموذج سليمة الماوس المعدلة وراثيا المناعي للسرطان المثانة التي تعبر عن hMUC1.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

سرطان المثانة هو الشكل الأكثر شيوعا من سرطان الرابعة والسبب الرئيسي الثامنة لوفيات السرطان في الرجال الأمريكيين. في الولايات المتحدة، ومن المتوقع بين الرجال والنساء جنبا إلى جنب في عام 2013 ما يقدر ب 1 72،500 حالة جديدة و 15،000 حالة وفاة بسبب سرطان المثانة. حالات الإصابة بسرطان المثانة هو ما يقرب من ثلاثة أضعاف في الرجال مقارنة بالنساء. في الولايات المتحدة، سرطان الخلايا الانتقالية (TCC) تمثل أكثر من 90٪ من الحالات، في حين أن سرطان الخلايا الحرشفية (SCC) لديها معدل أقل من 2٪ 2. النسبية معدل البقاء على قيد الحياة لمدة 5 سنوات شاملة لTCC حليمي هو 91.5٪ مقارنة مع 30.9٪ فقط لSCC 2. على الرغم من أن البلدان المساهمة بقوات حليمي موسع تمثل حوالي 75٪ من الحالات في وقت التشخيص، حتى مع العلاج أكثر من 50٪ من المرضى سوف تشهد تكرار في غضون 5 سنوات، مع ما يصل إلى 30٪ من هؤلاء المرضى يتقدم إلى العضلات مرض الغازية 3،4 . نظم المعالجة النموذجية للالجرد غير العضلاتتشمل أمراض asive بتر عبر الإحليل (تركيا)، يليه العلاج الكيميائي داخل المثانة. في المرضى الذين يعانون من تا عالية الجودة أو الأورام T1، قد يتم تنفيذ تكرار TUR قبل العلاج الكيميائي 3،4. بالنسبة لأولئك المرضى الذين يعانون من تكرار تا بدرجة منخفضة أو تا عالية الجودة أو آفات T1، والطور يليها العلاج الكيميائي المواد المساعدة أو العلاج المناعي في شكل عصيات كالميت غيران (BCG) يمكن أن تستخدم 3،4. وقد تبين BCG داخل المثانة لتكون متفوقة على إينترفسكل ميتوميسين C مع الاحترام لآخر لتكرار 5. لعضلة T2 المرض الغازية، استئصال المثانة الجذري مع أو بدون العلاج الكيميائي المواد الجديدة المساعدة هو المسار الموصى بها من العلاج 3. في المرضى الذين يعانون من SCC، استئصال المثانة الجذري يبدو أن العلاج الأكثر فعالية 6. وبالنظر إلى معدلات عالية جدا من تكرار على الرغم من أفضل العلاجات المتوفرة، ومن الواضح أن هناك حاجة لعلاجات جديدة وأكثر فعالية لسرطان المثانة.

توسيع المناعية جديدة للbladdإيه السرطان هو أحد النهج الممكنة التي قد تبشر لتمديد بقاء خالية من الأمراض. تاريخيا، كان BCG الخلايا الجذعية الوحيد الفعال لسرطان المثانة. ويعتقد أن آلية عملها لتشمل تحريض غير محدد من نوع تي المساعد 1 (TH1) الاستجابة المناعية عن طريق زيادة مستويات انترلوكين 2 (IL-2) والانترفيرون غاما (الإنترفيرون γ) 4. الخلوية، أو TH1 الحصانة، أمر بالغ الأهمية في العلاج المناعي السرطان كما الخلطية، أو TH2، ولم يثبت قط الحصانة لتكون فعالة ضد الأورام الصلبة، مع استثناء من الأجسام المضادة الموجهة ضد مستقبلات عامل النمو 7. في محاولة لتحسين بناء على فوائد BCG حيد، تم تقييم الإنترفيرون α 2B/BCG تركيبة الخلايا الجذعية في التجارب السريرية المرحلة الثانية مع نتائج غير حاسمة 8. نهج بديل لزرع الخلايا الجذعية لسرطان المثانة قد تكون لاستهداف مستضدات الأورام المرتبطة (TAAS)، وتحديد والتي جعلت الخلايا الجذعية السرطانية أكثر تحديدا 7 .

واحدة من هذه TAA هو الميوسين 1 (MUC1)، وهو بروتين سكري سطح الخلية بإفراط (overexpressed) في العديد من أنواع السرطان الخلايا الظهارية مثل المثانة والثدي والرئة، وسرطان البنكرياس 9،10. أيضا يتم تبديل التعبير وتعديل MUC1 بشكل كبير خلال التسرطن، بحيث underglycosylation يعرض تسلسل الأنتيجين من الأحماض الأمينية المعروفة باسم عدد متغير من يكرر جنبا إلى جنب (VNTR) على جوهر الببتيد. بينما MUC1 هو جزيء النفس، لا تتعرض هذه المناطق VNTR سائد مناعيا عادة بسبب ارتباط بالغليكوزيل واسعة، وبالتالي ينظر إليهم من قبل النظام المناعي كما 11،12 الأجنبية. تم السامة للخلايا T-الخلايا الليمفاوية (CTLs) التي تعترف على وجه التحديد MUC1 الحواتم معزولة عن ورم الغدد الليمفاوية استنزاف لمرضى سرطان الثدي 13، وكذلك الدم ونخاع العظام للمرضى المايلوما 14،15، مما يجعل MUC1 هدفا محتملا ل الاستجابة المناعية الخلوية. وVNTRs سائد مناعيا من underglycosylateيتم التعرف على شكل D من MUC1 بواسطة CTLs، مما أدى إلى تدمير الخلايا السرطانية 16-19. الأم الاستجابات المناعية الخلوية و / أو الخلطية إلى MUC1 سرطانية، ومع ذلك، ليست قوية بما فيه الكفاية للقضاء على الأورام. لزيادة ضعف الاستجابة المناعية الموجودة بالفعل لMUC1، ويمكن إدخال الببتيدات سائد مناعيا الاصطناعية من خلال التطعيم لتوليد استجابة CTL قوية بما فيه الكفاية لتكون ذات فائدة سريرية 18،20. وقد تبين بالفعل هناك لقاح الليبوسومال MUC1 لزيادة البقاء على قيد الحياة في مرضى سرطان الرئة 21،22، وتوليد CTLs قادرة على قتل الخلايا السرطانية إيجابية MUC1، وإنتاج رد فعل خلوى TH1 الاستقطاب 23،24. مع مستوى عال من MUC1 التعبير 9،11،25، وسرطان المثانة هو المرشح المنطقي لاختبار MUC1 العلاج المناعي الموجه 26،27. وعلاوة على ذلك، MUC1 لديها امكانات كعامل النذير في سرطان المثانة 28، MUC1 التعبير في TCC يرتبط بشكل كبير مع المرحلة والصف، والنقيلي TCCوقد تبين أن يواصل التعبير عن MUC1 29.

من أجل تقييم الفائدة المحتملة من العلاج المناعي الموجه MUC1 في سرطان المثانة، وضعنا على MUC1 الإنسان سليمة المناعي (hMUC1)، معربا عن المعدلة وراثيا (MUC1.Tg) نموذج الفأر من مسانج سرطان المثانة على C57BL / 6 خلفية 30. وأعرب عن MUC1 الإنسان باعتبارها من البروتين الذاتي تحت سيطرة المروج الخاصة بها، مما أدى إلى نمط التعبير الأنسجة متسقة مع تلك التي لوحظت في البشر 30،31. وقد حثت الفئران مع المثانة مسرطنة معروفة N-بوتيل-N-(4-hydroxybutyl) نيتروماسين (OH-BBN) 32، ثم تم تقييم الأورام الناتجة عن hMUC1 التعبير ونوع الورم والصف. لتقييم تأثير مسرطن على Th1/Th2 مستويات خلوى خلال تطوير الورم، تم جمع عينات من مصل الدم بصورة دورية للتحليل المتعدد. ثم عولجت الفئران مع لقاح الببتيد MUC1 المستهدفة، وكانت خلوى المصل والاستجابات المناعية EVALUAتيد بواسطة متعدد فلوروميتريك المناعية microbead وELISPOT.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجريت جميع الدراسات على الحيوانات والتجارب في إطار البروتوكول المعتمد من قبل جامعة كاليفورنيا، ديفيس المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام اللجنة الاستشارية الإدارية.

1. MUC1.Tg تربية ماوس والدعوة

  1. وديفيس برنامج علم الأحياء ماوس UC (ب ب) السلالات البرية نوع C57BL / 6 الفئران الذكور مع متخالف MUC1.Tg C57BL / 6 الفئران الإناث إلى إنشاء لدينا مستعمرة التكاثر. يتم تسليم MUC1.Tg ذرية للدراسات حسب الحاجة.
  2. أفراد MBP مقطع أصابع ذرية في نمط المعرفة (0-99) لتحديد الماوس، وعندما ينطبق مقطع الذيل. تتم معالجة الأنسجة اصبع القدم أو ذيل لالتنميط الجيني باستخدام استخراج الحمض النووي القياسية وتفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) تحليل.

2. تصميم الدراسة

  1. دراسة وظائف بيتية المجموعة
    1. وزن كل فأر بشكل منفصل على التوازن وتسجيل الوزن في غرام لكل الماوس.
    2. هذا الجزء من الإجراء الجردolves المنهجية وتصميم الدراسة. بالنسبة للجزء الأول من الدراسة، تعيين العمر المتطابقة MUC1.Tg والبرية نوع الفئران لبدء الاستقراء سرطان المثانة مع OH-BBN. الموت ببطء الفئران بعد 8 أسابيع من مشاركة OH-BBN جرعة للتأكد من وجود أورام المثانة بواسطة الأنسجة.
    3. بالنسبة للجزء الثاني من الدراسة، الفئران بطريقة عشوائية MUC1.Tg الذكور إلى العدد المناسب من العلاج ومجموعات المراقبة. وسيتم رصد هذه الفئران لالسيتوكينات في مصل الدم والاستجابات المناعية T-الخلية خلال الاستقراء والتنمية الورم، ومن ثم في إنهاء الدراسة بعد 8 أسابيع من الجرعة OH-BBN الماضي.
  2. سرطان المثانة التعريفي
    1. OH-BBN هي مادة مسرطنة وشديدة السمية. يرجى قراءة واتباع المبادئ التوجيهية للورقة بيانات سلامة المواد عند التعامل مع هذه المادة الكيميائية وتخزينها.
    2. حساب تركيز المحلول الجرعات اللازمة لتقديم الجرعة المناسبة (3 ملغ)، في حجم 100 ميكرولتر، إلى كل فأر على أساس متوسط ​​أوزان وnumbeR من الفئران في كل دراسة والمجموعة.
    3. تمييع OH-BBN في الإيثانول بنسبة 100٪. جلب التركيز النهائي إلى 30 ملغ / مل مع الماء المعقم. الإيثانول النهائي: يجب أن يكون تركيز الماء 20:80، V / V.
    4. إدارة OH-BBN شفويا باستخدام الفولاذ المقاوم للصدأ، 20 G الإبر أنبوب تغذية يوميا، 5 أيام / الأسبوع لمدة 12 أسبوعا، بناء على الاحالة المجموعة بدء العلاج في سن 8 أسابيع.
  3. علاجات التلقيح
    1. إعادة كل قنينة من لقاح مجفف بالتجميد الببتيد في 600 ميكرولتر من المياه المالحة عقيمة 0.9٪ و resuspend بدقة عن طريق رسم الحل من خلال 0.5 بوصة 27 G إبرة 6X. باستخدام المياه المالحة، وضبط تركيز بحيث يتم تسليم جرعة المطلوبة في حجم 100 ميكرولتر.
    2. ابتداء من الأسبوع 20، بعد آخر جرعة من OH-BBN، ويدير لقاح على أساس أسبوعي لدورة لمدة ثمانية أسابيع بواسطة الحقن تحت الجلد من 100 ميكرولتر باستخدام إبرة G 25 (عدد الأسبوع يتوافق مع عمر الفئران).
  4. رصد وجمع العينات
    1. تزن كل الفئران وجس لوجود أورام جديدة مرة واحدة كل أسبوع. الموت ببطء أي الفئران التي فقدت ≥ 20٪ من وزن الجسم أو إذا كان هناك أورام واضح، والدم في البول، و / أو احتباس البول.
    2. قبل أول جرعة OH-BBN ومن ثم على فترات الأسبوع 4 بعد ذلك، وجمع الدم كله عبر ينزف تحت الفك السفلي. جمع الدم في أنابيب تخثر الدم (BD Microtainer)، والسماح ل30 دقيقة على تجلط الدم.
    3. الطرد المركزي عينات الدم في microcentrifuge في 3،500 x ج لمدة 10 دقيقة. نقل بعناية المصل إلى المسمار cryotubes قبعة باستخدام ماصة.
    4. تجميد فلاش في النيتروجين السائل، وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى إجراء مزيد من التحليل بواسطة متعددة.
    5. بعد ثمانية أسابيع من آخر جرعة من OH-BBN، الموت ببطء كل الفئران عن طريق CO 2 الاختناق.
    6. وضع كل الماوس على لوحة التشريح وحصره من قبل جميع أطرافه الأربعة.
    7. باستخدام ملقط ومقص، يا أماهكه شق أفقي في منطقة البطن العلوية. إدراج مقص في شق بين طبقة البشرة وجدار البطن وفصل بلطف على الجلد من الأنسجة الكامنة بمساعدة ملقط.
    8. جعل شق عمودي من شق أفقي في أعقاب محور الأوسط نحو نهاية الأمامي من الفأرة. فصل الجلد من القفص الصدري، وباستخدام حقنة 1 مل وإبرة G 22، ثقب القلب وجمع الدم بالتعادل على نحو سلس ومطرد.
    9. الرجوع إلى الخطوة 2.4.3 و2.4.4 لعزل وتخزين المصل.
    10. باستخدام ملقط ومقص، وقطع وقشر عودة بقية طبقة البشرة. قطع طريق جدار البطن والصفاق وجو معقم و مطهر إزالة ورم المثانة لالمناعية (IHC) وطخة غربية.
    11. جمع الطحال للتحليل بقاء الخلية (موسى) وELISPOT. لIHC، مكان المثانة عينة الورم في الأنسجة كاسيت والإصلاح في ليلة وضحاها الفورمالين المبردة في درجة حرارة الغرفة.
    12. في اليوم التالي، استبدال الفورمالين مع الايثانول 70٪.
    13. لتحليل لطخة غربية من الورم، والتجانس الورم، إضافة العازلة استخراج البروتين بالإضافة إلى مثبطات الأنزيم البروتيني وقف ونقل إلى 1.5 مل أنابيب microcentrifuge.
    14. دوامة لمدة 30-60 ثانية مع الاستمرار على الجليد لمدة 5 دقائق. تجميد فلاش في النيتروجين السائل وذوبان الجليد في المياه المحيطة. تكرار عملية vortexing ل، وتجميد والذوبان مرتين.
    15. أجهزة الطرد المركزي العينات في 10،000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية، ونقل مقتطفات الخلوية إلى أنابيب جديدة المسمى.
    16. قياس تركيز عن طريق إجراء الفحص Bicinchoninic حمض البروتين (BCA) لقياس البروتين. عينات في مخزن -80 درجة مئوية لتصبح جاهزة للتحليل لطخة غربية.

3. علم الأحياء الجزيئية / ويسترن

تم تنفيذ الإجراءات التالية للتحقق من التعبير عن MUC1 في الماوس المثانة نسيج الورم باستخدام معيار الغربية وصمة عار بروتوكول (البيانات لا تظهرن).

  1. فصل مستخلصات البروتين بواسطة SDS-بولكرلميد الكهربائي للهلام (SDS-PAGE) ثم نقل على غشاء PVDF باستخدام جهاز شبه الجافة.
  2. منع نقل البروتين الغشاء مع الحليب الخالي 5٪ في 0.1٪ توين 20 في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS-T) ودرجة الحموضة 7.4 لمدة 1 ساعة على شاكر المداري في درجة حرارة الغرفة.
  3. احتضان الغشاء لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة على شاكر مع الأجسام المضادة لمكافحة MUC1 أو مكافحة β-الأكتين في 0.1٪ PBS-T.
  4. يغسل الغشاء من قبل الصب الحل وإضافة 0.1٪ PBS-T. دوامة الغشاء على شاكر لمدة 5 دقائق وصب. كرر هذه الخطوة مرتين.
  5. احتضان الغشاء لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع البيروكسيداز الفجل (HRP) الأجسام المضادة الثانوية مترافق.
  6. غسل 3X (يرجى الرجوع إلى الخطوة 3.4).
  7. اتبع بروتوكول لتعزيز Chemiluminesence (ECL) عدة لتنشيط وقراءة تصوير تألقي.

4. متعددة فلوروميتريك المناعية Microbead

  1. الإعداد والحسابات
    1. باستخدام خريطة وحة 96 جيدا، تعيين الفراغات، والمعايير، والضوابط، والمجاهيل إلى الآبار. حساب عدد وحجم التحاليل، والتقاط الأجسام المضادة وStreptavidin-فيكوإيريترين (SA-PE) اللازمة للفحص.
    2. السماح لجميع مخازن ومنظفة لكي تتوازن إلى درجة حرارة الغرفة. إعداد المعايير والتخفيفات عينة باستخدام لوحة 96 جيدا فارغة.
    3. إعادة تشكيل مصفوفة المصل ومستوى مجفف بالتجميد وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة وجعل 01:05 التخفيفات التسلسلي للمعيار مع مخفف المناسبة في لوحة 96 جيدا. لآبار فارغة، استخدم مخفف المناسبة.
    4. تمييع جميع الضوابط وعينات غير معروفة في 01:02 مخفف المناسبة في بقية من لوحة 96 جيدا.
    5. لمزيج حبة، ماصة حجم المطلوب من مخفف المناسبة في أنبوب مل 15. دوامة كل قارورة حبة لمدة 20 ثانية وماصة حجم المطلوب من كل الحليلة في أنبوب مل 15.
    6. دائما حماية حبات من ضوء لتجنب photobleaching. لا تضع لوحة 96 جيدا على مادة ماصة لتجنب فقدان العينة من خلال فتل.
  2. بروتوكول مقايسة
    1. Prewet لوحة أسفل 96-جيدا مرشح مع 200 ميكرولتر من الاحتياطي الفحص والسماح للاستحمام الكامل للمرشح. استنزاف بلطف باستخدام 96 جهاز فراغ لوحة جيدا وصمة عار تجف الجزء السفلي من لوحة مع منشفة ورقية.
    2. باستخدام ماصة الأقنية، ماصة 25 ميكرولتر من المصفوفة المصل إلى الآبار المخصصة للفراغات والمعايير وماصة 25 ميكرولتر من الاحتياطي الفحص إلى الآبار المخصصة للضوابط والمجاهيل.
    3. ماصة 25 ميكرولتر من الفراغ، والمعايير، والضوابط، والمجاهيل إلى الآبار المخصصة منها. دوامة المزيج حبة لمدة 20 ثانية ونقل الخرز إلى خزان.
    4. ماصة 25 ميكرولتر من مزيج حبة في كل بئر. تغطية لوحة بورق الألمنيوم أو غطاء لوحة مبهمة للحماية من ضوء.
    5. هزة لوحة في 500 دورة في الدقيقة لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة على طبق من ذهب شاكر. يصفى ويغسل اللوحة مع 200 ميكرولتر من 0.1٪ توين 20 في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS-T) مرتين. استنزاف وصمة عار الجافة.
    6. إعداد الحل الضد الالتقاط. ماصة المبلغ المطلوب من 0.1٪ PBS-T والتقاط الأجسام المضادة إلى 15 مل أنبوب ودوامة لمدة 10 ثانية. نقل مزيج الأجسام المضادة القبض على خزان وماصة 25 ميكرولتر في كل بئر.
    7. يهز لوحة في 500 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة على طبق من ذهب شاكر. يصفى ويغسل اللوحة مع 200 ميكرولتر من 0.1٪ PBS-T مرتين. استنزاف وصمة عار الجافة.
    8. إعداد الحل SA-PE. ماصة حجم المطلوب من 0.1٪ PBS-T و SA-PE إلى 15 مل أنبوب ودوامة لمدة 10 ثانية. نقل الحل إلى خزان وماصة 25 ميكرولتر في كل بئر.
    9. يهز لوحة في 500 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على طبق من ذهب شاكر. يصفى ويغسل اللوحة مع 200 ميكرولتر من 0.1٪ PBS-T مرتين. استنزاف وبالكثير الجافة.
    10. ماصة 100 ميكرولتر من 0.1٪ PBS-T ويهز على طبق شاكر في 500 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين على الأقل ل resuspend الخرز. قراءة وتحليل لوحة على الجهاز LX200 LUMINEX.

5. IFN-γ/IL-4 ELISPOT إعداد وتحليل

  1. في خزانة السلامة البيولوجية، معالجة الطحال من خلال 100 ميكرون الأنسجة نايلون غرابيل إلى 5 مل العقيمة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في أطباق بتري معقمة. طبقة splenocytes على 3 مل من المتوسط ​​فصل الخلايا اللمفاوية في أنابيب 15 مل العقيمة.
  2. أنابيب الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 15 دقيقة لفصل الخلايا الليمفاوية من خلايا الدم الحمراء. نقل الخلايا الليمفاوية الطبقات فوق التدرج إلى 15 مل أنابيب جديدة معقمة.
  3. ضبط مستوى الصوت إلى 10 مل مع برنامج تلفزيوني العقيمة. الطرد المركزي تعليق في 600 x ج لمدة 10 دقيقة لخلايا بيليه.
  4. نضح في وطاف resuspend الخلايا في 1 مل من برنامج تلفزيوني لمدة بقاء الخلية والعد مع موسىمحلل. اتبع عدد موسى وبروتوكول كيت قدرتها على البقاء.
  5. جعل التخفيفات المسلسل من الخلايا الليمفاوية في 1.5 مل المسمار كأب أنابيب الطرد المركزي في عوامل التخفيف من 1:10، 1:20، 1:40 و(أو عند الضرورة) في عدد والكاشف الجدوى (الحد الأدنى إجمالي حجم 300 ميكرولتر). ماصة كل تخفيف صعودا وهبوطا عدة مرات لخلط وتحليل على موسى.
  6. إعداد خريطة لوحة من العينات وشروط لوحة ELISPOT. إعداد لوحة ELISPOT وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة وماصة 100 ميكرولتر من المتوسطة، الببتيد (10 ميكروغرام / مل)، أو التدافع الببتيد (10 ميكروغرام / مل) إلى كل بئر.
  7. ماصة 100 ميكرولتر من تعليق خلية، وتقديم 1.0 × 10 6 خلايا إلى كل بئر واحتضان لوحة عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
  8. اتبع بروتوكول الشركة المصنعة للمقايسة ELISPOT. تحليل لوحة ELISPOT تطويرها باستخدام مجهر تشريح.
  9. قياس النتائج عن طريق حساب عدد من البقع الملونة correspondiنانوغرام لكل الحليلة في كل بئر. البقع تتوافق مع عدد من بقعة تشكيل الخلايا (SFC) في كل بئر.

6. المناعية (IHC) والهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) تلطيخ

  1. اتخاذ المثانة أنسجة الورم الحفاظ على النحو المبين أعلاه (القسم 2.4.11)، تغرس في البارافين والباب خطوة في 4 ميكرومتر لتحليل المناعى.
  2. أداء IHC باستخدام الأجسام المضادة MUC1 أن تعترف تكرار المنطقة جنبا إلى جنب من MUC1. استخدام عدة بحوث الحيوان البيروكسيديز لتقليل تفاعل الأجسام المضادة مع الماوس الثانوي المناعي الذاتية موجودة في الأنسجة.
  3. أداء H & E تلطيخ باستخدام البروتوكولات القياسية.

7. الأساليب الإحصائية

لملتيبليكس فلوروميتريك المناعية Microbead، استخدم اختبار t لطالب ثنائي الطرف لاحظ مقارنة متوسط ​​تركيزات خلوى المصل بين العلاج ومجموعات المراقبة. لELISPOT، استخدم-W واحدةAY ANOVA لمقارنة بقعة تشكيل المستعمرات بين سيطرة وسائل الإعلام، سارعت الببتيد والجماعات الببتيد. استخدام عدة اختبار المقارنة DUNNETT لتقليل احتمال وجود نتيجة إيجابية كاذبة. يعتبر A-P من قيمة ≤ 0.05 اختلافا كبيرا عن جميع التحليلات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقييم ما قبل السريرية من آثار المناعية رواية ومجموعات في سرطان المثانة يتطلب تطوير نموذج حيواني المناسبة. في نموذجنا الماوس المعدلة وراثيا، أدى الاستقراء مع مادة مسرطنة الكيميائية OH-BBN في ارتفاع معدل حدوث سرطان المثانة في الغالب من TCC مع بعض SCC، الذي يشبه سرطان المثانة لدى البشر. لتحديد الأنسجة الورم، MUC1 حالة التعبير والاستجابة المناعية لعلاج لقاح الببتيد، الموت الرحيم كانت 21 و 18 MUC1.Tg الفئران نوع البرية لجمع الدم، وقربة، والطحال (الشكل 1) ثمانية أسابيع ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والاستقراء الناجح الغازية سرطان الخلايا الحرشفية والمثانة الانتقالية في الفئران MUC1.Tg الإنسان يقدم نموذجا قبل السريرية للتنمية الخلايا الجذعية. تتطلب دراسات Immunotherapeutic استخدام عفوية، نموذج سليمة المناعي من أجل تقييم الاستجابة الالتهابية لتطور الورم على مر الزمن، فضلا عن الاستجابة المناعية لعلاج مناعي. في نموذج التنمية الورم عفوية، يبقى المكروية الورم سليمة وأورام تطوير في أكثر معدل النمو ممثل الذي يسمح لتقييم الآثار انتيتومور من العلاج. وعلاوة على ذلك، فإن الجهاز المناعي ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DPV، GTW، SMG، كجك، AMG، وGKH تعلن أي تضارب مصالح. MWD هو الباحث الرئيسي من المنحة المقدمة من ميرك، وMW هو موظف من ميرك.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فإن الكتاب أود أن أشكر ديفيس برنامج علم الأحياء ماوس UC لتربية الفئران. وأيد هذا البحث من خلال منحة من ميرك، دارمشتات، ألمانيا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Reagent  < / قوي >
N-بوتيل - N- (4-هيدروكسي بوتيل) - نيتروزامين (OH-BBN)TCI AmericaB0938
20 G Gavage NeedlesPopper Sons، Inc.7921
لقاح الببتيدN / AN / Aعامل استقصائي
BD MicrotainersBD365957
أشرطة الأنسجةSimportM490-12
10٪ محايد مخزن الفورمالينفيشر ScientificSF100-4
تحلل عازلةبيرس87787
وقف البروتياز & كوكتيل مثبط الفوسفاتيزThermo Scientific78444
Pierce BCA Protein Assay Kitبيرس23225
الفأر السيتوكين 20plex KitInvitrogenLMC006
حبات الكرة المجهرية المغناطيسيةLuminexMC100xx-01xx هي منطقة الخرزة
المضادة للفأر TNF- التقاط الجسم المضادBD Pharmingen551225
مضاد للفأر TNF- الكشف عن الأجسام المضادةBD Pharmingen554415
مضاد للفأر IFN- التقاط الأجسام المضادةAbcamab10742
مكافحة الماوس IFN- الكشف عن الأجسام المضادةAbcamab83136
PBS ، درجة الحموضة 7.4SigmaP3813-10PAK
Tween-20FisherBP337-500
الفحص العازلةMilliporeL-MAB
السيتوكين القياسيةMilliporeMXM8070
لوحات تصفية HTS 96well متعددة الشاشاتMilliporeMSBVN1210
SA-PEInvitrogenSA10044
100 م مناخل مناديل نايلونBD352360
وسائط فصل خلايا الطحالLonza17-829E
TNF- / IL-4 لوحات ELISpotR & D SystemsELD5217
الأرانب المضادة للأجسام المضادة أحادية النسيلةEpitomics2900-1
الماعز المضاد للأكتين الأجسام المضادة أحادية النسيلةSigmaA1978
الأجسام المضادة للأرانب HRPPromegaW401B
الماعز المضادة للفأر HRP الأجسام المضادةسانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية، Inc.SC-2005
غشاء PVDFBioRad162-0174
جل صغير Protean TGX مسبقة الصبBioRad456-1083
Muse Count & amp طقم الجدوىMilliporeMCH100104
MUC1 الأجسام المضادةBD Pharmingen550486IHC الأجسام المضادة
لأبحاث طقم بيروكسيدازDakoK3954IHC تلطيخ
<قوي > المعدات والبرمجيات < / قوي >
Millipore جهاز فراغMilliporeMSVMHTS00
Luminex Lx200Millipore / Luminex40-013تم تصنيعها بواسطة Luminex ، وزعتها Millipore
Luminex Xponent SoftwareMillipore / LuminexN / Aالإصدار 3.1 ؛ مضمنة مع برنامج Luminex Lx200
Milliple AnalystSoftware Milliplex / VigeneTech40-086الإصدار 5.1
Muse Cell AnalyzerMillipore0500-3115
Muse SoftwareMilliporeN / Aالإصدار 1.1.0.0 ؛ مضمن مع محلل
تشريح المجهرUnitronZ730
Graphpad Prism SoftwareGraphpad Software Inc.N / Aالإصدار 5.1
جهاز جل خلية Tetra Cell Mini ProteanBioRad165-8001
Trans Blot SD Cell و PowerPacBioRad170-3849
من الفولاذ المقاوم للصدأ لوحة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Siegel, R., Naishadham, D., et al. CA Cancer J. Clin. 63, 11-30 (2013).
  2. Lynch, C. F., Davila, J. A. Chapter 23. Cancer of the urinary bladder. SEER Survival Monograph: Cancer Survival Among Adults: U.S. SEER Program, 1988-2001, Patient and Tumor Characteristics. Ries, L. A. G., Young, J. L., et al. , National Cancer Institute, SEER Program. Bethesda, MD. 07-6215(2007).
  3. Jacobs, B. L., Lee, C. T., et al. Bladder cancer in 2010: how far have we come. CA Cancer J. Clin. 60 (4), 244-272 (2010).
  4. Sexton, W. J., Wiegand, L. R., et al. Bladder cancer: a review of non-muscle invasive disease. Cancer Control. 17 (4), 256-268 (2010).
  5. Bohle, A., Jocham, D., et al. Intravesical bacillus Calmette-Guerin versus mitomycin C for superficial bladder cancer: a formal meta-analysis of comparative studies on recurrence and toxicity. J. Urol. 169 (1), 90-95 (2003).
  6. Shokeir, A. A. Squamous cell carcinoma of the bladder: pathology, diagnosis and treatment. BJU Int. 93 (2), 216-220 (2004).
  7. Rosenberg, S. A. Progress in human tumour immunology and immunotherapy. Nature. 411 (6835), 380-384 (2001).
  8. Joudi, F. N., Smith, B. J., et al. Final results from a national multicenter phase II trial of combination bacillus Calmette-Guerin plus interferon alpha-2B for reducing recurrence of superficial bladder cancer. Urol. Oncol. 24 (4), 344-348 (2006).
  9. Lau, S. K., Weiss, L. M., et al. Differential expression of MUC1, MUC2, and MUC5AC in carcinomas of various sites: an immunohistochemical study. Am. J. Clin. Pathol. 122 (1), 61-69 (2004).
  10. Hollingsworth, M. A., Swanson, B. J. Mucins in cancer: protection and control of the cell surface. Nat. Rev. Cancer. 4 (1), 45-60 (2004).
  11. Scholfield, D. P., Simms, M. S., et al. MUC1 mucin in urological malignancy. BJU Int. 91 (6), 560-566 (2003).
  12. Devine, P. L., McKenzie, I. F. Mucins: structure, function, and association with malignancy. Bioessays. 14 (9), 619-625 (1992).
  13. Jerome, K. R., Barnd, D. L., et al. Cytotoxic T-lymphocytes derived from patients with breast adenocarcinomas recognize an epitope present on the protein core of a mucin molecule preferentially expressed by malignant cells. Cancer Res. 51 (11), 2908-2916 (1991).
  14. Takahashi, T., Makiguchi, Y., et al. Expression of MUC1 on myeloma cells and induction of HLA-unrestricted CTL against MUC1 from a multiple myeloma patient. J. Immunol. 153 (5), 2102-2109 (1994).
  15. Choi, C., Witzens, M., et al. Enrichment of functional CD8 memory T cells specific for MUC1 in bone marrow of patients with multiple myeloma. Blood. 105 (5), 2132-2134 (2005).
  16. Barnd, D. L., Lan, M. S., et al. Specific, major histocompatibility complex- unrestricted recognition of tumor-associated mucins by human cytotoxic T-cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (18), 7159-7163 (1989).
  17. Ioannides, C. G., Fisk, B., et al. Cytotoxic T-cells from ovarian malignant tumors can recognize polymorphic epithelial mucin core peptides. J. Immunol. 151 (7), 3693-3703 (1993).
  18. Tang, C. K., Katsara, M., et al. Strategies used for MUC1 immunotherapy: human clinical studies. Expert Rev. Vaccines. 7 (7), 963-975 (2008).
  19. Mukherjee, P., Ginardi, A. R., et al. MUC1-specific cytotoxic T lymphocytes eradicate tumors when adoptively transferred in vivo. Clin. Cancer Res. 7, 848-855 (2001).
  20. Acres, B., Limacher, J. M. MUC1 as a target antigen for cancer immunotherapy. Expert Rev. Vaccines. 4 (4), 493-502 (2005).
  21. Butts, C., Murray, N., et al. Randomized phase IIB trial of BLP25 liposome vaccine in stage IIIB and IV non-small-cell lung cancer. J. Clin. Oncol. 23 (27), 6674-6681 (2005).
  22. Butts, C., Maksymiuk, A., et al. Updated survival analysis in patients with stage IIIB or IV non-small-cell lung cancer receiving BLP25 liposome vaccine (L-BLP25), phase IIB randomized, multicenter, open-label trial. J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 137 (9), 1337-1342 (2011).
  23. Agrawal, B., Krantz, M. J., et al. Rapid induction of primary human CD4+ and CD8+ T cell responses against cancer-associated MUC1 peptide epitopes. Int. Immunol. 10 (12), 1907-1916 (1998).
  24. Palmer, M., Parker, J., et al. Phase I study of the BLP25 (MUC1 peptide) liposomal vaccine for active specific immunotherapy in stage IIIB/IV non-small-cell lung cancer. Clin. Lung Cancer. 3 (1), 49-57 (2001).
  25. Walsh, M. D., Hohn, B. G., et al. Mucin expression by transitional cell carcinomas of the bladder. Br. J. Urol. 73 (3), 256-262 (1994).
  26. Murray, A., Simms, M., et al. Production and characterization of rhenium-188-C595 antibody for radioimmunotherapy of transitional cell bladder cancer. J. Nucl. Med. 42 (5), 726-732 (2001).
  27. Hughes, O., Bishop, M., et al. Targeting superficial bladder cancer by the intravesical administration of 67copper-labelled anti-MUC1 mucin monoclonal antibody C595. J. Clin. Oncol. 18 (2), 363-370 (2000).
  28. Conn, I. G., Crocker, J., et al. HMFG-2 as a prognostic indicator in superficial bladder cancer. J. Clin. Pathol. 41 (11), 1191-1195 (1988).
  29. Hughes, O., Denley, H., et al. MUC1 mucin expression in transitional cell carcinoma of the bladder: a target for diagnosis and therapy with monoclonal antibody C595. J. Urol. Pathol. 12, 185-197 (2000).
  30. Rowse, G. J., Tempero, R. M., et al. Tolerance and immunity to MUC1 in a human MUC1 transgenic murine model. Cancer Res. 58 (2), 315-321 (1998).
  31. Mukherjee, P., Madsen, C. S., et al. Mucin-1 specific immunotherapy in a mouse model of spontaneous breast cancer. J. Immunother. 26 (1), 47-62 (2003).
  32. McCormick, D. L., Ronan, S. S., et al. Influence of total dose and dose schedule on induction of urinary bladder cancer in the mouse by N-butyl-N-(4-hydroxy-butyl)nitrosamine. Carcinogenesis. 2 (3), 251-254 (1981).
  33. Wurz, G. T., Gutierrez, A. M., et al. Antitumor effects of L-BLP25 antigen-specific tumor immunotherapy in a novel human MUC1 transgenic lung cancer mouse model. J. Transl. Med. 11, 10-1186 (2013).
  34. Kunze, E., Schauer, A., et al. Stages of transformation in the development of N-butyl-N-(4hydroxybutyl)-nitrosamine-induced transitional cell carcinomas in the urinary bladder of rats. Z Krebsforsch Klin. Onkol. Cancer Res. Clin. Oncol. 87 (2), 139-160 (1976).
  35. Crallan, R. A., Georgopoulos, N. T., et al. Experimental models of human bladder carcinogenesis. Carcinogenesis. 27 (3), 374-381 (2006).
  36. Samma, S., Uemura, H., et al. Rapid induction of carcinoma in situ in dog urinary bladder by sequential treatment with N-methyl-N'-nitrosourea and N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine. Gann. 75 (5), 385-387 (1984).
  37. Bornhof, C., Wolfrath, G., et al. Induction of urinary bladder urothelial cancers in the rabbit by dibutylnitrosamine with an artificial bladder calculus as cocarcinogen. Urologe A. 28 (6), 339-343 (1989).
  38. Irving, C. C., Tice, A. J., et al. Inhibition of N-n-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine-induced urinary bladder cancer in rats by administration of disulfiram in the diet. Cancer Res. 39 (8), 3040-3043 (1979).
  39. Mehta, N. R., Wurz, G. T., et al. L-BLP25 vaccine plus letrozole induces a TH1 immune response and has additive antitumor activity in MUC1-expresssing mammary tumors in mice. Clin. Cancer Res. 18 (10), 2861-2871 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

OH BBN ELISpot Th1

مقالات ذات صلة