يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التوليد السريع للأميلويد من البروتينات الأصلية في المختبر

6.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/50869

⸱

ديسمبر 5, 2013

 ,  , 
1Department of Immunology, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

في هذه المقالة

ملخص

يمكن للبروتينات إما أن تتبنى بنية أصلية أو تتحول إلى أميلويد غير قابل للذوبان. تؤدي الظروف التي تفضل مسار الطي الخاطئ إلى تكوين أنواع مختلفة من ألياف الأميلويد. تسمح الطرق الموضحة هنا بالتحويل السريع للبروتينات الأصلية إلى أميلويد في المختبر.

الملخص

تقوم البروتينات بمهام حاسمة في الكائنات الحية من خلال ممارسة الوظائف المستمدة من طياتها ثلاثية الأبعاد المحددة. على الرغم من أن الهياكل الأصلية لعديد الببتيدات تحقق العديد من الأغراض ، إلا أنه من المسلم به الآن أن معظم البروتينات يمكن أن تتبنى مجموعة بديلة من الأميلويد الغني بطبقة بيتا. ترتبط ألياف الأميلويد غير القابلة للذوبان في البداية بأمراض بشرية متعددة ، ولكن يتم عرضها بشكل متزايد كلاعبين وظيفيين يشاركون في العديد من العمليات الخلوية المهمة. بالإضافة إلى ذلك ، يحتوي الأميلويد المودع في أنسجة المريض على مكونات غير بروتينية ، مثل الأحماض النووية والجليكوزامينوجليكان (GAGs). يمكن أن تسهل هذه العوامل المساعدة تكوين الأميلويد ، مما يؤدي إلى توليد أنواع مختلفة من الرواسب غير القابلة للذوبان. من خلال الاستفادة من فهمنا لكيفية طي البروتينات بشكل خاطئ عبر مرحلة وسيطة من سلائف الأميلويد القابلة للذوبان ، ابتكرنا طريقة لتحويل البروتينات الأصلية إلى ألياف الأميلويد في المختبر. يسمح هذا النهج للمرء بتحضير الأميلويد بكميات كبيرة ، وفحص خصائص الأميلويد المتولد من بروتينات معينة ، وتقييم التغييرات الهيكلية المصاحبة للتحويل.

المقدمة

< p class = "jove_content" >البروتينات هي أكثر الجزيئات البيولوجية وفرة الموجودة في جميع أنواع الخلايا. تحدث في مجموعة كبيرة ومتنوعة من الأحجام والهياكل والتعديلات اللاحقة للترجمة ، وتؤدي مجموعة هائلة من الوظائف البيولوجية المهمة عندما تكون في أشكالها الأصلية. أكثر من عشرين من عديد الببتيدات الشاذة متورطة في العديد من الحالات المرضية البشرية ، مثل مرض الزهايمر ومرض باركنسون ومرض السكري من النوع 21-4. تتراكم البروتينات الطرفية غير المطوية على شكل ألياف أميلويد ، وهي المجاميع المستقرة غير القابلة للذوبان التي تحدث خارج الخلية أو داخل الخلية.

على الرغم من الآثار المترتبة على بروتينات معينة في بعض الأمراض ، فإن الأدلة المتزايدة تدعم فكرة أن جميع عديد الببتيدات لها خصائص جوهرية تمكن من تحويل الأميلويد. حدد مسح التسلسل على مستوى الجينوم "الأميلوم" ، والذي تشكل من خلاله الشظايا المعرضة للأميلويد ما يقرب من 15٪ من جميع أجزاء الببتيد المشفرة من الإشريكية القولونية إلى البشر5. وفقا لذلك ، تم اكتشاف عدد متزايد من الأميلويدات الوظيفية ، التي تشارك في العديد من العمليات الخلوية المهمة ، في السنوات الأخيرة. على سبيل المثال ، تقوم البكتيريا بتجميع الأميلويد لتشكيل هياكل الأغشية الحيوية والأبواغ التي تعتبر ضرورية لبقائها وإمراضها6-9. تشكل هرمونات الببتيد رواسب أميلويد أثناء التخزين داخل حبيبات إفرازية الثدييات قبل إطلاقها ، مما يعني أيضا أن شكل البروتين النشواني يمكن أن يخدم وظائف بيولوجية مفيدة6،10،11. علاوة على ذلك ، يمكن أن تتجمع البروتينات أيضا في ألياف الأميلويد لنقل الإشارات الخلوية الحرجة12،13.

لسنوات عديدة ، يتم تحضير الأميلويد الأكثر دراسة من الببتيدات الفردية المرتبطة بالأمراض البشرية ، مثل أميلويد بيتا أو ببتيد البريون. عادة ما تفتقر هذه الببتيدات إلى بنية محددة جيدا وتشكل الأميلويد تلقائيا في المحلول بمرور الوقت ، وهي عملية بوساطة وسيط غير مطوي جزئيا يعمل كمقدمة للأميلويد غير القابل للذوبان. تسمى مقدمة الأميلويد أيضا بقليل البروتين القابل للذوبان ، وهو نادر وغير مستقر عند إنشاؤه من الببتيدات الطبيعية14،15. ومع ذلك ، كما هو موضح سابقا ، يمكن لأي بروتين تقريبا من حيث المبدأ أن يتبنى تشكل الأميلويد في ظل الظروف المناسبة. لقد أنشأنا مؤخرا طريقة لتحضير أوليغومرات قابلة للذوبان مستقرة من البروتينات الأصلية ، والتي تشكل الأميلويد بسهولة في وجود عوامل مساعدة مختلفة16. تعكس ألياف الأميلويد الناتجة الطبيعة المعقدة لمجاميع البروتين الطرفي غير القابلةللطي 17،18. نستخدم هنا مصطلح الأميلويد البروتيني فقط لإحالة ألياف البروتين بدون عوامل مساعدة والأميلويد الهجين للألياف التي تحتوي على مكونات غير بروتينية

< p class = "jove_content" > في السابق ، تم تطوير طرق مختلفة لتوليد الأميلويد في المختبر من خلال تطبيق ظروف معروفة بأنها تفضل طي البروتين بشكل خاطئ ، مثل ارتفاع درجة الحرارة ، والبيئة الكارهة للماء ، وتغيرات الأس الهيدروجيني19-23. ومع ذلك ، فإنها ترتبط بمشاكل مختلفة ، مثل الكفاءة المنخفضة أو الطي القابل للانعكاس أو اختلافات الدفعات الكبيرة أو الحركية البطيئة. النهج الموصوف هنا قابل للتكرار ، وسهل التوسع ، ويسمح للمرء بالتحكم بدقة في توقيت وحالة تحويل الأميلويد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد MES Buffer

  1. استخدم المخزن المؤقت MES (0.1 M 2- (N-morpholino) حمض الإيثان سلفونيك و 0.9 M كلوريد الصوديوم) لتحضير كل من الأميلويد الذي يحتوي على البروتين فقط بالإضافة إلى قلة البروتين القابلة للذوبان المستقرة. تزن 1.95 جم من MES و 5.27 جم من كلوريد الصوديوم. أضف H2O واضبط الرقم الهيدروجيني على 4.7. اصنع الحجم النهائي إلى 100 مل. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
< p class = "jove_title" >2. تحضير الأميلويد البروتيني فقط مباشرة من البروتينات الأصلية

  1. قم بوزن البروتين المفضل (أي بروتين أو ببتيد أصلي) وأعد تشكيله إلى 10 مجم / مل في مخزن MES المؤقت.
  2. احتضن عند 65 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 4 ساعات. بحلول نهاية الفترة ، يكون الراسب الأبيض مرئيا في المحلول.
  3. قم بتحييد العينة بنسبة 10٪ (حجم / حجم) من Tris-HCl (1 م ، درجة الحموضة 10.5).
  4. غسيل الكلى بالبروتين في شريط غسيل الكلى طوال الليل لاستبداله إلى المخزن المؤقت المطلوب لمزيد من التحليل.
  5. يمكن تحضير عينة تحكم من البروتين الأصلي باتباع الخطوات 2.1 و 2.3 و 2.4 بدون هطول الأمطار الحرارية (الخطوة 2.2).
فئة

3. تحضير الأميلويد الهجين من أوليغومرات قابلة للذوبان المستقرة للبروتينات الأصلية

  1. تحضير قلة البروتين القابلة للذوبان المستقرة
    1. قم بوزن البروتين المفضل وأعد تكوينه إلى 10 مجم / مل في المخزن المؤقت MES. اتركيه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
    2. قم بوزن 1-إيثيل -3- [3-ثنائي ميثيل أمينوبروبيل] كاربوديميد هيدروكلوريد (EDC) وقم بإعداد مخزون جديد من 20 مجم / مل في مخزن MES المؤقت.
    3. امزج محاليل البروتين و EDC بنسبة 2: 5 (حجم / حجم) ، أي 2 مجم من البروتين لكل 10 مجم من EDC.
    4. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة.
    5. قم بتحييد العينة بنسبة 10٪ (حجم / حجم) من Tris-HCl (1 م ، درجة الحموضة 10.5).
    6. غسيل الكلى بالبروتين في شريط غسيل الكلى طوال الليل لاستبداله إلى المخزن المؤقت المطلوب لمزيد من التحليل.
    7. قم بتخزين البروتين القابل للذوبان المستقر عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 4 أسابيع.
  2. تحضير الأميلويد الهجين من قليل البروتين القابل للذوبان المستقر.
    1. لتحضير الأميلويد المحتوي على الحمض النووي ، امزج الحمض النووي وقليل البروتين القابل للذوبان المستقر بنسبة 1: 1 (وزن / وزن). اتركيه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة ساعتين على الأقل. خلال هذه الفترة ، يكون الراسب غير القابل للذوبان مرئيا في المحلول عندما يكون تركيز البروتين الأولي 0.5 مجم / مل أو أعلى.
    2. لتحضير الأميلويد المحتوي على الحمض النووي الريبي ، امزج الحمض النووي الريبي وقليل البروتين القابل للذوبان المستقر بنسبة 1: 1 (وزن / وزن). اتركيه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة ساعتين على الأقل. خلال هذه الفترة ، يكون الراسب غير القابل للذوبان مرئيا في المحلول عندما يكون تركيز البروتين الأولي 0.5 مجم / مل أو أعلى.
    3. لتحضير الأميلويد المحتوي على الهيبارين ، اخلطي الهيبارين وقليل البروتين القابل للذوبان المستقر بنسبة 1: 1 (وزن / وزن). اتركيه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة ساعتين على الأقل. خلال هذه الفترة ، يكون الراسب غير القابل للذوبان مرئيا في المحلول عندما يكون تركيز البروتين الأولي 0.5 مجم / مل أو أعلى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تعتمد القدرة على تحويل البروتينات الأصلية مباشرة إلى أميلويد على التغيير التشكلي الذي يحدث عند درجة حرارة عالية في محلول MES المنظم. ويعد الترسيب في المحلول مؤشراً جيداً على تجمع البروتينات واحتمالية تكوين الأميلويد. ومن ناحية أخرى، لتمكين استقرار قليلات القسيمات البروتينية الذائبة، يُستخدم EDC لربط البروتينات تشابكياً لتثبيت التشكيل قليلي القسيمات المستحث في محلول MES المنظم. ونتيجة لذلك، تكون قليلات القسيمات البروتينية المستقرة عبارة عن بروتينات متعددة الوحدات (الشكل 1)، والتي تختلف عن البروتينات الأصل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

توفر الطريقة الموضحة هنا وسيلة سريعة ومرنة لتحضير ألياف الأميلويد في المختبر من أي بروتين أو ببتيد من اختياره. يمكن تحضير عدة أنواع مختلفة من الأميلويد بشكل موثوق - ألياف البروتين فقط أو المجاميع الهجينة التي تحتوي على الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي أو الجليكوزامينوجليكان. الإجراءات المتبعة بسيطة ومباشرة ولا تتطلب تدريبا تقنيا متقدما. الأميلويد المحضر بهذه الطريقة مستقر تماما ويمكن تخزينه بأمان عند 4 درجات مئوية أو تجميده عند -80 درجة مئوية لفترة أطول.

أحد أهم العوامل لضمان التول...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدينا ما نكشف عنه.

شكر وتقدير

هذا العمل مدعوم بمنح لمرحاض المياه من AI074809 منح المعاهد الوطنية للصحة وبرنامج منح الأبحاث المؤسسية لمركز إم دي أندرسون للسرطان بجامعة تكساس.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2- (N-مورفولينو) حمض الإيثان سلفونيك (MES)سيجما ألدريتشM8250
كلوريد الصوديومفيشرBP358-10
1-إيثيل -3- [3-ثنائي ميثيل أمينوبروبيل] كاربوديميد هيدروكلوريد (EDC) ثيرمو/ بيرس22980
الحمض النووي من المنوية السلمونسيجماD1626
الحمض النووي الريبي من خميرة التورولاسيجماR6625
الهيبارين من الغشاء المخاطي المعوي للخنازيرSigmaH3149
قاعدة تريسفيشرBP152-1
المعدات:
حمام مائيفيشر ساينسIsotemp 210
Slide-A-Lyzer كاسيت غسيل الكلىThermo / Pierce66380

المراجع

  1. Selkoe, D. J. Folding proteins in fatal ways. Nature. 426, 900-904 (2003).
  2. Schnabel, J. Protein folding: The dark side of proteins. Nature. 464, 828-829 (2010).
  3. Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426, 895-899 (2003).
  4. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annu. Rev. Biochem. 75, 333-366 (2006).
  5. Goldschmidt, L., Teng, P. K., Riek, R., Eisenberg, D. Identifying the amylome, proteins capable of forming amyloid-like fibrils. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 3487-3492 (2010).
  6. Fowler, D. M., Koulov, A. V., Balch, W. E., Kelly, J. W. Functional amyloid - from bacteria to humans. Trends Biochem. Sci. 32, 217-224 (2007).
  7. Chapman, M. R., et al. Role of Escherichia coli Curli Operons in Directing Amyloid Fiber Formation. Science. 295, 851-855 (2002).
  8. Barnhart, M. M., Chapman, M. R. Curli Biogenesis and Function. Annu. Rev. Microbiol. 60, 131-147 (2006).
  9. Claessen, D., et al. A n olved in aerial hyphae formation in Streptomyces coelicolor by forming amyloid-like fibrils. Genes Dev. 17, 1714-1726 (2003).
  10. Maji, S. K., et al. Functional Amyloids As Natural Storage of Peptide Hormones in Pituitary Secretory Granules. Science. 325, 328-332 (2009).
  11. Badtke, M. P., Hammer, N. D., Chapman, M. R. Functional Amyloids Signal Their Arrival. Sci. Signal. 2, pe43(2009).
  12. Li, J., et al. The RIP1/RIP3 Necrosome Forms a Functional Amyloid Signaling Complex Required for Programmed Necrosis. Cell. 150, 339-350 (2012).
  13. Hou, F., et al. MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response. Cell. 146, 448-461 (2011).
  14. Stefani, M. Biochemical and biophysical features of both oligomer/fibril and cell membrane in amyloid cytotoxicity. FEBS J. 277, 4602-4613 (2010).
  15. Glabe, C. G. Structural classification of toxic amyloid oligomers. J. Biol. Chem. 283, 29639-29643 (1074).
  16. Di Domizio, J., et al. Binding with nucleic acids or glycosaminoglycans converts soluble protein oligomers to amyloid. J. Biol. Chem. 287, 736-747 (2012).
  17. Zhang, X., Li, J. -P., Lijuan, Z. Heparan sulfate proteoglycans in amyloidosis. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 93, 309-334 (2010).
  18. Jiménez, J. S. Protein-DNA Interaction at the Origin of Neurological Diseases: A Hypothesis. J. Alzheimer's Dis. 22, 375-391 (2010).
  19. Bhattacharya, M., Jain, N., Mukhopadhyay, S. Insights into the Mechanism of Aggregation and Fibril Formation from Bovine Serum Albumin. J. Phys. Chem. B. 115, 4195-4205 (2011).
  20. Vetri, V., et al. Bovine Serum Albumin protofibril-like aggregates formation: Solo but not simple mechanism. Arch. Biochem. Biophysics. 508, 13-24 (2011).
  21. Bucciantini, M., et al. Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases. Nature. 416, 507-511 (2002).
  22. McParland, V. J., Kalverda, A. P., Homans, S. W., Radford, S. E. Structural properties of an amyloid precursor of b2-microglobulin. Nat. Struct. Mol. Biol. 9, 326-331 (2002).
  23. Chiti, F., et al. Designing conditions for in vitro formation of amyloid protofilaments and fibrils. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 3590-3594 (1999).
  24. McParland, V. J., et al. Partially Unfolded States of b2-Microglobulin and Amyloid Formation in vitro. Biochemistry. 39, 8735-8746 (2000).
  25. Liu, K., Cho, H. S., Lashuel, H. A., Kelly, J. W., Wemmer, D. E. A glimpse of a possible amyloidogenic intermediate of transthyretin. Nat. Struct. Mol. Biol. 7, 754-757 (2000).
  26. Pfefferkorn, C. M., McGlinchey, R. P., Lee, J. C. Effects of pH on aggregation kinetics of the repeat domain of a functional amyloid. Pmel17. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21447-21452 (2010).
  27. Di Domizio, J., et al. Nucleic acid-containing amyloid fibrils potently induce type I interferon and stimulate systemic autoimmunity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14550-14555 (2012).
  28. Halle, A., Hornung, V., Petzold, G. C., Stewart, C. R., Monks, B. G., Reinheckel, T., Fitzgerald, K. A., Latz, E., Moore, K. J., Golenbock, D. T. The NALP3 inflammasome is involved in the innate immune response to amyloid-β. Nat. Immunol. 9, 857(2008).
  29. Masters, S. L., O'Neill, L. A. Disease-associated amyloid and misfolded protein aggregates activate the inflammasome. Trends Mol. Med. 17, 276-282 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

MES EDC
التوليد السريع للأميلويد من البروتينات الأصلية في المختبر
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.