طرق لتعديل وتحليل NF كيلوبايت التي تعتمد على تكوين الخلايا العصبية الكبار

Summary

وصفت وسائل للتلاعب وتحليل NF كيلوبايت التي تعتمد على تكوين الخلايا العصبية الحصين الكبار. ويرد بروتوكول مفصلة لاختبار تعتمد على التلفيف المسنن السلوكية (وهو ما يسمى نمط المكاني فصل بارنز متاهة) للتحقيق في نتائج المعرفية في الفئران. هذا الأسلوب من شأنه أن يساعد أيضا تمكين التحقيقات في إعدادات التجريبية الأخرى.

Abstract

الحصين يلعب دورا محوريا في تشكيل وترسيخ ذكريات العرضية، والتوجه المكاني. تاريخيا، تم استعراض الحصين الكبار كمنطقة تشريحية جامدة جدا للدماغ الثدييات. ومع ذلك، فقد أظهرت النتائج الأخيرة التي التلفيف المسنن لقرن آمون هو مجال اللدونة هائلة في البالغين، والتي تنطوي ليس فقط إدخال تعديلات على الدوائر العصبية الموجودة، ولكن أيضا تكوين الخلايا العصبية الكبار. وينظم هذا اللدونة عن طريق الشبكات النسخي المعقدة، التي عامل النسخ NF كيلوبايت يلعب دورا بارزا. لدراسة والتلاعب تكوين الخلايا العصبية الكبار، نموذج الفأر وراثيا لتثبيط الدماغ الأمامي محددة العصبية النشاط NF كيلوبايت يمكن استخدامها.

في هذه الدراسة، وصفت وسائل لتحليل الخلايا العصبية NF كيلوبايت تعتمد، بما في ذلك جوانبه الهيكلية وموت الخلايا المبرمج العصبية وانتشار السلف، وأهميتها المعرفية، whicتم تقييم ح تحديدا عبر التلفيف المسنن (DG) التي تعتمد على اختبار السلوكية، ونمط المكاني فصل بارنز متاهة (SPS-BM). بروتوكول SPS-BM يمكن تكييفها لمجرد استخدام مع النماذج الحيوانية المعدلة وراثيا أخرى مصممة لتقييم تأثير جينات معينة على تكوين الخلايا العصبية الحصين الكبار. علاوة على ذلك، SPS-BM يمكن استخدامها في إعدادات التجريبية الأخرى التي تهدف إلى التحقيق والتلاعب التعلم DG-تعتمد، على سبيل المثال، وذلك باستخدام وكلاء الدوائية.

Introduction

وجوديا، وقرن آمون هو واحد من أقدم الهياكل التشريحية في الدماغ المعروفة. أنها مسؤولة عن المهام المعقدة المتنوعة، مثل وظائف محوريا في تنظيم الذاكرة طويلة المدى، والتوجه المكاني، وتشكيل وتوطيد الذاكرة منها. تشريحيا، ويتألف من طبقات الحصين الخلايا الهرمية (الطبقة الهرمية) بما في ذلك قرن آمون (CA1، CA2، CA3، وCA4) والمناطق التلفيف المسنن (التلفيف المسنن)، الذي يحتوي على الخلايا الحبيبية وعدد قليل من الأسلاف العصبية داخل منطقته جزئي التحبب . المشروع الخلايا الحبيبية تجاه المنطقة CA3 عبر ما يسمى الألياف المطحلب (محاور الخلايا الحبيبية).

حتى نهاية القرن الماضي، وكان يعتقد أدمغة الثدييات الكبار ليكون جهازا ثابتة تفتقر إلى اللدونة الخلوية وتكوين الخلايا العصبية. ومع ذلك، خلال العقدين الماضيين، كمية متزايدة من الأدلة يدل بوضوح على تكوين الخلايا العصبية الكبار التي تجري في ما لا يقل عنمناطق الدماغ، وهما منطقة subventricular (SVZ) والمنطقة جزئي التحبب من قرن آمون.

لدينا دراسات سابقة، وتلك من المجموعات الأخرى، أظهرت أن عامل النسخ NF كيلوبايت هي واحدة من المنظمين الجزيئية الحاسمة لتكوين الخلايا العصبية الكبار، وأن نتائج إلغاء التنظيمات في قرن آمون العيوب الهيكلية الحادة وإدراكيا ^1-6. NF كيلوبايت هو اسم عام لعامل النسخ محرض تتألف من مجموعات مختلفة من مثنوي خمس مفارز الحمض النووي ملزم: P50، P52، ج، الرطوبة، RelB، وP65 (RELA)، وهذه الأخيرة ثلاثة من التي لديها المجالات transactivation. داخل الدماغ، الشكل الأكثر وفرة وجدت في السيتوبلازم هو مغاير للP50 P65 والتي يتم الاحتفاظ بها في شكل غير نشط من قبل المانع من كابا B (IκB) البروتينات.

لدراسة ومعالجة مباشرة تكوين الخلايا العصبية NF كيلوبايت يحركها، ونحن نستخدم نماذج الماوس المعدلة وراثيا لتمكين تثبيط بسيطة من كل من subun NF كيلوبايتلها، وتحديدا في الدماغ الأمامي ⁷ (انظر الشكل 1). لهذا الغرض، ونحن عبور لدت-خطوط الماوس المعدلة وراثيا التالية، IκB / - و-/tTA. تم إنشاء خط باستخدام متحولة السلبية عبر المهيمن NF-كيلوبايت المانع IκBa (فائقة قامع IκBa-AA1) ⁸ - وIκB المعدلة وراثيا /. وعلى النقيض من النوع البري IκBα، IκBα-AA1 اثنين من بقايا سيرين تحور إلى alanines (V32 V36 و)، والتي تعيق الفسفرة وتدهور proteasomal لاحقة من المانع. للعصبون الدماغ الأمامي محددة التعبير عن IκBa-AA1-التحوير، IκB / - تم الفئران ولدت المتبادل مع الفئران بايواء كيناز الكالسيوم كالمودولين التي تعتمد IIα (CAMKIIα) المروج التي يمكن أن تكون مدفوعة من قبل التتراسيكلين عبر المنشط (TTA) ^9.

P65 الفئران خروج المغلوب لها النمط الظاهري الجنينية قاتلة بسبب موت الخلايا المبرمج الكبد ضخمة ^10، وبالتالي فإن النهج هو موضح هنا يوفر طريقة أنيقةللتحقيق في دور NF كيلوبايت في تكوين الخلايا العصبية بعد الولادة والكبار.

وقد وصفت الاختبار السلوكية الكلاسيكية لدراسة التعلم والذاكرة المكانية في 1980s من قبل ريتشارد موريس، وهو اختبار المعروفة باسم موريس المياه متاهة (MWM) ^11. في هذا المجال المفتوح المياه متاهة، الحيوانات تتعلم من الفرار من المياه مبهمة على منصة مخفية على أساس الميول وخارج المتاهة العظة. متغير الجافة من MWM هو ما يسمى متاهة بارنز (BM) ^12. هذا الاختبار يستخدم لوحة دائرية مع 20 حفرة دائرية رتبت على الحدود من لوحة، مع واحد ثقب يعرف بأنه مربع الهروب، والعظة من خارج المتاهة البصرية لتحديد اتجاهاتها. كلا نماذج تجريبية تعتمد على سلوك طيران الناجمة عن القوارض سيصدره النفور من الماء، أو مفتوحة، ومساحات مضيئة الزاهية. الاختبارين السماح بإجراء تحقيق من التوجه المكاني، وأداء الذاكرة ذات الصلة. على الرغم من أن الحصين يلعب دورا العامة والأساسية في تشكيل الذاكرة المكانية، ص الحصينegions تشارك تختلف تبعا لاختبار تطبيقها. الذاكرة اختبارها في BM تنشأ من نشاط الخلايا العصبية بين القشرة enthorinal (EC) والخلايا العصبية الهرمية الموجودة في CA1-منطقة قرن آمون دون مساهمة DG ^13-16. على وجه الخصوص، BM الكلاسيكية تعتمد بشكل رئيسي على الملاحة عبر الممر-الصدغي ammonic الأحادي المشبك من EC الثالث لCA1 لEC خامسا الأهم من ذلك، DG تشارك بشكل حاسم في ما يسمى نمط الاعتراف المكانية ^17، وهو ما يعني ضمنا ليس فقط معالجة المعلومات البصرية والمكانية، ولكن أيضا تحويل بيانات أو ذكريات مماثلة في متباينة، تمثيلات غير المتداخلة. هذه المهمة تتطلب الدوائر ثلاثي متشابك وظيفية من EC DG الثاني للCA3 لCA1 وEC السادس، والتي لا يمكن اختبارها في BM ^15.

للتصدي لهذه التحديات، ونحن قد وضعت SPS-BM بمثابة اختبار لاختبار السلوكية على وجه التحديد التي تعتمد على التلفيف المسنن في الأداء الإدراكي المشتركالحيوانات ntrol، وفي IκB / TTA نموذج فائقة قامع التالية NF كيلوبايت تثبيط. الأهم من ذلك، وعلى النقيض من MWM أو BM، يمكن للSPS-BM تكشف العجز السلوكية الناتجة عن انخفاض القيمة خفية من الخلايا العصبية. منذ المكانية ونمط الفصل يعتمد بشكل صارم على دائرة وظيفية بين EC II وDG وCA3 وCA1 وEC السادس، وهذا الاختبار هو حساسة للغاية للتغيرات المحتملة في تكوين الخلايا العصبية، إدخال تعديلات على مسار الألياف المطحلب أو تغيرات في توازن الأنسجة داخل DG.

من الناحية الفنية، ويستند انشاء الاختبار لدينا في الدراسة التي Clelland وآخرون، حيث تم اختبار نمط الفصل المكاني باستخدام خشبية 8 الذراع ذراع شعاعي المتاهة (RAM) ^19. لدينا في تعديل مجموعة المتابعة، تم استبدال ثمانية السلاح من قبل سبع متطابقة المنازل الغذاء الأصفر. وباختصار، فإن الأساليب هو موضح هنا، بما في ذلك تحليل (DCX +) الخلايا، معربا عن doublecortin داخل الحصين، والتوقعات الألياف المطحلب، خلية العصبية دياته وعلى وجه الخصوص قدمت SPS-BM هنا، يمكن تطبيقها على التحقيقات في نماذج الماوس الأخرى دمج الجينات المحورة التي لها تأثير على تكوين الخلايا العصبية الكبار. ويمكن أن تشمل التطبيقات مزيد من الدراسة من وكلاء الدوائية وقياس أثرها على DG والمكانية فصل النمط.

Protocol

بيان الأخلاق

وقد أجريت هذه الدراسة وفقا للوائح صارمة للجنة رعاية الحيوان واستخدام الحكومية، LANUV من ولاية شمال الراين وستفاليا، (دوسلدورف، ألمانيا). تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل LANUV، دوسلدورف تحت الرخصة رقم 8.87-51.04.20.09.317 (LANUV، NRW). تم بذل جميع الجهود للحد من الاستغاثة وعدد الحيوانات اللازمة للدراسة.

1. رعاية الحيوان والإسكان

1. يجب أن تبقى جميع الحيوانات المستخدمة في بروتوكولات الموصوفة هنا تحت ظروف معينة خالية من مسببات الأمراض، على النحو المحدد من قبل جمعية الاتحاد الأوروبي مختبر علم الحيوان (FELASA).
2. يجب أن تبقى الفئران في أقفاص القياسية في درجة الحرارة والرطوبة التي تسيطر عليها (22 ° C) غرفة تحت ظروف نهاري (12 ساعة ضوء / دورة الظلام) مع HEPA تصفية الهواء.
3. وينبغي توفير الغذاء والماء بالمال وبالشهرة أيضا موحدة الإعلان.
4. إذا IκB / TTA وIκB / - تستخدم السيطرة على الفئران، يجب أن يتم تنفيذ التنميط الجيني PCR القائم لكل حيوان، كما هو موضح في ^{7 و 18.}
5. الحيوانات الذكور مع فارق السن أقل من أربعة أيام يجب أن يتم استخدامها للحد من تقلب الفردية.
6. (اختياري): لNF كيلوبايت التجارب تنشيط، يجب أن تدار الدوكسيسيكلين في مياه الشرب (2 ملغ / مل مع 2.5٪ سكروز) لمدة 14 يوما على الأقل.

2. نمط المكاني فصل بارنز المتاهة (SPS-BM)

1. وينبغي إجراء جميع الاختبارات السلوكية وفقا للمبادئ التوجيهية الدولية والمحلية.
2. هام! فقط استخدام الفئران الذكور مع سن ستة أشهر أو أكثر. فارق السن بين الحيوانات من سلسلة اختبار واحد ينبغي أن يكون أقل من أربعة أيام. يجب إجراء اختبار من قبل نفس المشغل لكل سلسلة. الفئران يجب أن يحصل على نظاما غذائيا عاديا قبل الاختبار لزيادة الدافع مدفوعة جزئيا كماweet مكافأة الغذاء.
3. إعداد لوحة دائرية بيضاء مصنوعة من البلاستيك الصلب (قطر 120 سم، انظر الشكل 5A) في والرطوبة غرفة التحكم في درجة حرارته (22 درجة مئوية)، مع مضيئة لا يقل عن 4 × 80 واط و 3 × 215 W مصابيح الفلورسنت النيون . هام! ضمان يتم استخدام الإضاءة الصحيحة، والدافع من الفئران لدخول المنازل الغذاء مدفوعة جزئيا كرههم للمشرق، والأماكن المكشوفة.
4. إعداد نظام الفيديو تتبع. ينبغي أن توضع الكاميرا 115 سم فوق وسط لوحة (انظر الشكل 5A).
5. نعلق متعددة الالوان العظة خارج المتاهة (EMC) على قطعة قماش بيضاء اللون في المناصب بسهولة للحيوانات، ما يقرب من 100 سم من الحدود من لوحة (انظر الشكل 5A) مرئية.
6. تنظيف بعناية لوحة بمطهر السريع الذي يمكن أن يزيل أي رائحة من التجريبية مجموعة المتابعة.
7. وضع سبع متطابقة المنازل الأصفر الطعام (12 سم × 7 سم × 8 سم، انظر الشكل 5A ) على لوحة بيضاء. وينبغي أن تكون مواقف تميزت بشكل لا لبس فيه (انظر الشكل 5A).
8. وضع الحلو المكافآت الغذاء بيليه (ربع منزل Froot حلقة / الغذاء Kellogs سيصدره) داخل كل البيوت الغذاء على مواقع محددة (انظر الشكل 5A) واحد فقط مع بيت الغذائية المحددة التي يمكن الوصول إليها بحرية للحيوان (الموقع F، انظر الشكل 5A ). إغلاق المنازل الغذائية غير المستهدفة مع رقائق شفافة.
9. قبل إجراء الاختبار، نفذ التعود (قبل بدء المهمة يوم واحد). جعل جميع المنازل الغذائية المتاحة بحرية والسماح للفئران لاستكشاف متاهة بحرية واسترداد مكافأة الغذاء بيليه (10 دقيقة / الحيوان).
10. تبديل جهاز الكمبيوتر والكاميرا والبدء في برنامج نظام الفيديو تتبع.
11. بدء التسجيل.
12. وضع الحيوان في نقطة بداية محددة على لوحة دائرية (الشكل 5A، S: بدء الموقف) والسماح الفئران للبحث عن منزل الغذائية المستهدفة لمدة 10 دقيقة.
13. ستوع وتتبع الفيديو.
14. هام! تنظيف لوحة دائرية والمنازل الطعام بعد كل محاكمة مع مطهر سريع.
15. كرر الاختبار يوميا لمدة سبعة أيام متتالية (لكل حيوان).
16. تحليل النتائج (الكمون، والمسافة المقطوعة والأخطاء) باستخدام برنامج الإحصاءات المناسبة. تحديد الأخطاء كما يقترب من بيت الغذائية الخاطئة و / أو الاتصال مع مربع السليم دون إدخال واسترجاع المكافأة بيليه الغذاء. لتحليل مجمعة استخدام اتجاهين أنوفا مع Bonferroni اختبار بعد مخصصة.
17. (اختياري) التضحية الفئران وتحليل الحصين كما هو موضح أدناه.

3. BrdU وصفها

1. حقن الغشاء البريتونى 50 ملغ / كغ الملكية الفكرية BrdU مرة واحدة يوميا لمدة 3 أيام (تحليل التفاضل والتكامل) أو 200 ملغ / كغ الملكية الفكرية لحقنة واحدة (تحليل الانتشار).
2. تضحية الحيوانات، تشريح الحصين وإعداد 40 ميكرومتر أقسام كما هو موضح أدناه.
3. Denaturate وأقسام مع 2 M حمض الهيدروكلوريك لمدة 10 دقيقة واحتضان في 0.1 م العازلة بورات لمدة 10 دقيقة.
4. تسمية سلسلة واحدة في واثني عشر من 40 ميكرومتر أقسام (240 ميكرون بعيدا) من كل حيوان immunohistochemically، كما هو موضح أدناه باستخدام الأجسام المضادة الموجهة ضد BrdU.
5. تحديد الخلايا المسمى عن طريق التحليل المجهري متحد البؤر في جميع أنحاء مدى rostrocaudal من طبقة الخلايا الحبيبية ومنطقة جزئي التحبب. مضاعفة الأرقام الناتجة بنسبة 12 في الحصول على العدد الإجمالي المقدر للخلايا المسمى BrdU في قرن آمون والقسمة على اثنين للحصول على العدد الكلي للخلايا المسمى في DG.

4. إزالة المخ وإعداد Cryosections من Nonperfused الحيوانات

1. مراقبة الإجراءات المعتمدة محليا القتل الرحيم الحيوانات. الفئران قد يتم التخلص مباشرة من قبل خلع عنق الرحم.
2. (اختياري) الحيوانات يمكن تخدير قبل euthanization فقا للمبادئ التوجيهية المحلية والدولية، مثلا عن طريق inje داخل الصفاقكشن من 0.8 مل آفيرتين ل33 غرام الماوس (تقدم طازجة عن طريق خلط 150 مل حل الأسهم مصنوعة من 2.2 ملغ 2،2،2-ثلاثي بروم إيثانول في 1 مل أيزو أميلي الإيثانول مع 1.85 مل من المياه المالحة أو العازلة الفسيولوجية).
3. تعقيم الرأس مع بتدين (10٪ بوفيدون اليود) غارقة الشاش ومسحة في وقت لاحق مع الشاش غارقة في الايثانول 70٪.
4. قطع رأس الحيوان باستخدام مقص جراحي المناسبة وسحب الجلد جانبا.
5. (اختياري) التبعي يمكن تطبيقها لتجنب للطي الخلفي من الجلد المتخلفين.
6. جعل شق خط الوسط في الجمجمة وسحب بعناية شظايا الجمجمة جانبا.
7. إزالة بعناية الدماغ كله باستخدام أداة جراحية المناسبة (مثل موريا ملعقة).
8. Precool 25 مل من 2 methylbutane في 50 مل دورق (مثل شوت دوران) إلى -30 إلى -40 درجة مئوية على الثلج الجاف.
   ملاحظة: للحصول على تلطيخ التعويم الحر المقاطع "سميكة" والتي هي مناسبة بشكل مثالي لمتحد البؤر المسح المجهري بالليزر، وإزالة المخ، ويغسل 3مرات في المخزن وتخزينها في 4 درجات مئوية في الفوسفات مخزنة 30٪ محلول السكروز في أنبوب 50 مل حتى غرقت الدماغ أسفل إلى أسفل (عادة بين عشية وضحاها).
9. وضع بعناية الدماغ على قطعة من Nescofilm (Parafilm)، وتغطي مع كمية وافرة من TissueTek أكتوبر مركب، وتجميد Nescofilm في 2-methylbutane، مخزن في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
   ملاحظة: للحصول على تخزين لفترة طويلة في -20 درجة مئوية في مخزن 9٪ سكروز، 7 ملم MgCl _2، 50 ملي العازلة الفوسفات، 44٪ الجلسرين.
10. قطع الدماغ إلى 10-12 ميكرومتر أقسام سميكة على cryomicrotome المناسبة.
    ملاحظة: للحصول على والمقاطع التعويم الحر سميكة، وتجميد الدماغ على مبضع بردي مرحلة مبضع بردي المناسبة (على سبيل المثال رايشرت جونغ، Frigomobil.) وخفض 40 ميكرومتر أقسام أفقية في -20 ° إلى - 25 درجة مئوية. جمع المقاطع من سكين مع فرشاة غرامة، وجمع في المخزن أو الاحتفاظ بها في حل التخزين (الخطوة 4.9) في -20 درجة مئوية لمدة التخزين لفترة طويلة.
11. جبل بعناية شريحتين على الشرائح المجهر واحدة. ولناينصح بشدة (ه) من الشرائح Superfrost UltraPlus لتعظيم التصاق من الأقسام.
12. تجفيف الشرائح لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ويمكن تخزين الشرائح في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

5. إعداد أقسام من الحيوانات Perfused

1. تخدير الحيوانات كما هو موضح أعلاه (الخطوة 4.2).
2. يروي بعناية الحيوان transcardially مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) التي تحتوي على الهيبارين (0.025 g/100 مل PBS) وبروكايين (0.5 g/100 مل PBS) لمدة 2-4 دقيقة، تليها بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 10-15 دقيقة . يتم تنفيذ نضح على النحو الأمثل من قبل perfusing عبر البطين الأيسر وفتح الأذين الأيمن باستخدام الضغط الهيدروليكي من حوالي 1،2-1،4 متر أو باستخدام مضخة تحوي مجموعة إلى ما يقرب من 15 مل / دقيقة. النتائج نضح الأمثل في الدماغ الأبيض الشاحب مع عدم وجود الأوعية الدموية الحمراء كونها مرئية.
3. تشريح وإصلاح آخر، العقل المدبر في بارافورمالدهيد 4٪ عند 4 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
4. البردحماية أدمغة في 30٪ سكروز في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية لمدة لا تقل عن 24 ساعة.
5. تجميد العقول على الساحة مبضع بردي.
6. إعداد 40 ميكرومتر أقسام أفقية من forebrains بأكملها باستخدام مبضع بردي المناسبة.
7. ويمكن تخزين الشرائح في حل cryoprotectant (0.1 M العازلة الفوسفات، و 50٪ الجلسرين، 0.14٪ MgCl _2، 8.6٪ سكروز) في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.

6. المناعية من أقسام الدماغ من Nonperfused الحيوانات

1. بعد إصلاح cryosections، أعد كما هو موضح أعلاه، وذلك باستخدام -20 درجة مئوية الميثانول الباردة لمدة 10 دقيقة.
2. منع مع 5٪ مصل العادية تحتوي على 0.3٪ تريتون-X (من الأنواع التي كانت تستخدم لرفع الأجسام المضادة الثانوية) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
3. شطف 3X مع برنامج تلفزيوني 1X واحتضان مع الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
4. شطف 3X مع برنامج تلفزيوني 1X واحتضان مع الأجسام المضادة الثانوية في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.
5. شطف 3X مع برنامج تلفزيوني 1X
6. فصول التوجيه الجامعيnterstain قسم لالحمض النووي باستخدام SYTOX الأخضر، أو دابي (أو صبغ الحمض النووي البديلة).
7. شطف 3X مع برنامج تلفزيوني 1X
8. تضمين المقاطع في تضمين مائي المتوسط.
9. السماح للمتوسطة تضمين تتبلمر لمدة 48 ساعة على الأقل.

7. المناعية من أقسام الدماغ من Perfused الحيوانات

1. كتلة كما هو موضح في الخطوة 6.2 و في وقت لاحق احتضان أقسام الدماغ ثابتة في حل الأجسام المضادة الأولية مخففة في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.3٪ تريتون-X (مجاني العائمة) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
2. شطف ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X واحتضان في حل الضد الثانوية مخففة في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.3٪ تريتون-X (التعويم الحر) في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 ساعة.
3. شطف 3X مع برنامج تلفزيوني 1X
4. مباين لقسم الحمض النووي باستخدام SYTOX الأخضر أو ​​دابي (أو صبغ الحمض النووي البديلة).
5. شطف ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X
6. تضمين المقاطع في تضمين مائي المتوسط.
7. السماح للبلمرة المتوسطة التضمين لر الأقل 48 ساعة.

8. التحقيق في التوقعات موسي الألياف

1. تضحية الحيوانات، وإعداد 40 ميكرومتر المقاطع الاكليلية كما هو موضح أعلاه وصمة عار على القسم الحصين باستخدام الأجسام المضادة لخيط عصبي M.
2. مسح الأقسام في الطول الموجي المناسب باستخدام المجهر متحد البؤر المسح الضوئي ليزر لتصور الألياف المطحلب ونوى. بدء المسح الضوئي في التكبير المنخفض.
3. استخدام الصور التكبير منخفضة للتوجيه واستهداف الحصين مع التوقعات الألياف المطحلب.
4. مسح المقاطع (ض باجتزاء) بدقة عالية وتضخم عالية.
5. تحليل مظهر المورفولوجية والاتصال من الألياف المطحلب تصور عبر تلطيخ لNF-M.
6. (اختياري) تحليل حجم وحجم شفرات الحصين. استخدام الحمض النووي لإشارة القياسات.

9. الفلورية اليشم C الفحص (موت الخلية العصبية)

1. تضحية الحيوانات، تشريح hippocampus، وإعداد 12 ميكرومتر أقسام كما هو موضح أعلاه.
2. السماح للأقسام تجف لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
3. إصلاح المقاطع في PFA 4٪ لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
4. لفترة وجيزة غسل 3X مع المقاطع [ده ₂ O.
5. احتضان المقاطع مع 0.06٪ برمنجنات البوتاسيوم (KMnO ₄₎ لمدة 10 دقيقة تحت المستمر، والهز لطيف.
6. غسل المقاطع 3x أخرى مع [ده ₂ O.
7. احتضان المقاطع مع 0.002٪ الفلورية اليشم C الحل لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
8. (اختياري) لstainings النووية في وقت واحد، 0.002٪ الفلورية اليشم C الحل يمكن أن تستكمل مع 10 ميكروغرام / مل دابي.
9. لفترة وجيزة غسل 3X مع المقاطع [ده ₂ O.
10. السماح للأقسام تجف لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
11. احتضان المقاطع مع الزيلين (1 دقيقة)
12. تحميل المقاطع باستخدام وسيلة تصاعد مقرها الزيلين (DPX).

Results

التهجين من IκB / - وTTA خطوط الماوس المعدلة وراثيا يؤدي إلى تثبيط النشاط الشرطي NF كيلوبايت في قرن آمون.

للتحقيق في التعبير عن IκBα-AA1-التحوير في مضاعفة المعدلة وراثيا الماوس (الشكل 1A)، تم عزل العقول، cryosectioned والملون باستخدام الأجسام المضادة ضد GFP (بروتين الفلورية الخضراء). كشفت متحد البؤر المسح المجهري بالليزر التعبير عالية من التحوير في المناطق CA1 CA3 و، وفي DG

Discussion

تكوين الخلايا العصبية الكبار، وإمكانية التلاعب بها عن طريق تثبيط NF كيلوبايت في الخلايا العصبية، وتنشيط في وقت لاحق عبر الدوكسيسيكلين، ويوفر نظام رائعة للتحقيقات في الخلايا العصبية في الدماغ حديثي الولادة والكبار، وكذلك في دي وإعادة توليد الخلايا العصبية . جمال هذا النظام هو أن NF كيلوبايت مسار الإشارات تثبيط الخلايا العصبية في النتائج ليس فقط في التغييرات في وفاة الخلايا العصبية الخلية، وانتشار السلف، والهجرة، والتغيرات الهيكلية والتشريحية شديدة، ولكن أيضا في عيوب التعلم واضحة. ا...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Moria MC17 ملعقة مثقبة	FST	10370-18	إزالة الأدمغة
المجهر	كارل زايس	ستيمي SV8	إزالة الأدمغة
مقص جراحي	FST	14084-08	إزالة الأدمغة
مقص جراحي	FST	14381-43	إزالة الأدمغة
Dumont # 5 ملقط	FST	11254-20	إزالة الأدمغة SuperFrost
Slides	Carl Roth	1879	شرائح للكيمياء المناعية
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Fixative TissueTek OCT مركب	Sakura Finetek	1004200018	الأدمغة
مصل الماعز العادي	Jackson Immunolabs	005-000-001	حجب في IHC
مصل الأرانب العادي	Jackson Immunolabs	011-000-001	حجب في IHC
مصل الحمار العادي	Jackson Immunolabs	017-000-001	حجب في IHC
المضادة للخيوط العصبية -	M دراسات النمو الورم الهجين بنك	2H3	IHC ، التخفيف 1: 200
مضاد دبل كورتين  الأجسام المضادة	sc-8066	سانتا كروز	IHC ، التخفيف 1: 800
الأجسام المضادة المضادة ل GFP	Abcam	ab290	IHC ، التخفيف 1: 2,000
الأجسام المضادة المضادة ل BrdU	OBT0030G	مواد كيميائية دقيقة	IHC ، التخفيف 1: 2،000 & nbsp ؛
Fluoro-Jade C	FJ-C	HistoChem	تحديد موت الخلايا العصبية
مطهر D08AG02 Betadine	Mundipharma
Cryomicrotome	Leica	CM1900	تحضير شرائح الدماغ
الصوديوم هيبارين	Sigma-Aldrich	H3393	التروية
صفيحة دائرية مصنوعة من البلاستيك الصلب (قطر 120 سم)	مصنوعة	في المختبرلا توجد	لوحة ل SPS-BM ، قطر 120 سم
مطهر بوراتون السريع   ؛	Schü lke Mayr	113 911	مطهر
نظام تتبع الفيديو TSE VideoMot 2 مع حزمة البرامج VideoMot2	TSE Systems	302050-SW-KIT	تتبع وتحليل SPS-BM
Triton X-100 & nbsp ؛	سيجما ألدريتش	T8787	نفاذية / IHC
Cryotome	Reichert Jung / Leica	Frigomobil 1206	إعداد 40 & مايكرو ؛ م شرائح الدماغ
Mowiol 4-88	Carl Roth	Art.-Nr. 0713	تضمين الشرائح
SYTOX green	Invitrogen	S7020	تلطيخ نووي
كريات الطعام (حلقات Kellog's Froot)	Kellog's		SPS-BM
Prism ، الإصدار 3.0	Graph Pad Software ، سان دييغو ، الولايات المتحدة الأمريكية		التقييم الإحصائي لبرنامج SPS-BM
Zen 2008 أو Zen 2011	Carl Zeiss		(مجهر متحد البؤر)
D.P.X	Sigma-Aldrich	317616	وسيط تركيب لتلوين Fluoro-Jade C