يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

طرق تحديد رنين الرنين المغناطيسي النووي ل 13C-dimethyl N-terminal amine على البروتينات الميثيلية المختزلة

5.8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/50875

⸱

ديسمبر 12, 2013

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Louisiana State University

في هذه المقالة

ملخص

< p class = "jove_content" > يتم وصف طريقتين لتعيين إشارات الرنين المغناطيسي النووي α و ε-dimethylamine ليسين N-terminal N 13ميثيلا مختزلا. تستخدم إحدى الطرق الانتقائية الناجمة عن الأس الهيدروجيني لتفاعل المثيلة الاختزالي ، والأخرى تستخدم أمينوببتيداز لإزالة اللايسين الطرفي N بشكل انتقائي.

الملخص

التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي (NMR) هو تقنية مثبتة لبنية البروتين والدراسات الديناميكية. لدراسة البروتينات التي تحتوي على الرنين المغناطيسي النووي ، عادة ما يتم دمج النظائر المغناطيسية المستقرة أيضيا لتحسين الحساسية والسماح بتعيين الرنين المتسلسل. المثيلة المختزلة 13C هي طريقة بديلة لوضع العلامات على البروتينات غير القابلة للتعبير المفرط عن المضيف البكتيري ، وهي الطريقة الأكثر شيوعا لدمج النظائر. الاختتزال 13C-methylation هو تفاعل كيميائي يتم إجراؤه في ظل ظروف معتدلة يعدل المجموعات الأمينية الأولية للبروتين (المجموعات الأمينية ε ليسين ومجموعة α الأمينية N) إلى 13مجموعة C-dimethylamino لا يتم تغيير بنية ووظيفة معظم البروتينات عن طريق التعديل ، مما يجعلها بديلا قابلا للتطبيق لوضع العلامات الأيضية. نظرا لأن مثيلة 13C المختزلة تضيف ملصقات نظائرية متناثرة ، فإن الطرق التقليدية لتعيين إشارات الرنين المغناطيسي النووي غير قابلة للتطبيق. تم تطوير طريقة تخصيص بديلة باستخدام قياس الطيف الكتلي (MS) للمساعدة في تعيين إشارات البروتين 13C-dimethylamine NMR. تعتمد الطريقة على كميات جزئية ومختلفة من 13علامة C في كل مجموعة أمينية أولية. ينشأ أحد قيود الطريقة عندما تكون بقايا البروتين الطرفية N هي ليسين لأن مجموعات α و ε-dimethylamino من Lys1 لا يمكن قياسها بشكل فردي باستخدام MS. للتحايل على هذا القيد ، تم وصف طريقتين لتحديد رنين الرنين المغناطيسي النووي ل 13C-dimethylamines المرتبطة بكل من α-amine الطرفية N والسلسلة الجانبية ε-أمين. تم تحديد إشارات الرنين المغناطيسي النووي ل α-dimethylamine الطرفية N والسلسلة الجانبية ε-dimethylamine لليزوزيم بياض بيض الدجاجة ، Lys1 ، في 1 H-13C أطياف التماسك أحادي الكم غير المتجانسة.

المقدمة

التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي (NMR) هو أداة قيمة لتوضيح الهيكل للبروتينات1. يمكن استخدام التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي لتحديد بنية محلول البروتين في حالته الأصلية. للتغلب على الوفرة الطبيعية المنخفضة للنظائر المغناطيسية المستقرة ، من الضروري دمج 13درجة مئوية و 15نيوتن في البروتين محل الاهتمام. الطريقة الأكثر شيوعا المستخدمة هي التعبير المؤتلف في مضيف بكتيري2-3. ومع ذلك ، فإن عيبين للإفراط في التعبير عن المضيف البكتيري هما أنه لا يمكن أن ينتج تعديلات ما بعد الترجمة ولا يعمل مع جميع البروتينات3-4. عندما لا يكون التعبير البكتيري طريقا قابلا للتطبيق لإنتاج البروتين ، يمكن استخدام الإفراط في التعبير في المضيفين غير البكتيريين ، ولكن وضع العلامات النظيرية صعب ومكلف5. تشمل طرق التعبير البديلة لدمج نظائر 13C و 15N في البروتينات لتحليل الرنين المغناطيسي النووي تقنيات وضع العلامات المتناثرة باستخدام السلائف الأيضية لوضع العلامات على الميثيل6 والأحماض الأمينية المفردة 13C و 15N7-9. النهج الكيميائي لوضع العلامات المتفرقة المستخدم هنا هو تفاعل مثيلة C المختزل الراسخ 13(الشكل 1) ، حيث يتم ميثيل المجموعات الأمينية الأولية على البروتين - α-أمين الطرفي N والليسين ، السلسلة الجانبية ε-الأمينات. بمجرد تكوين أحادي ميثيل أمينات ، يخضع الأمين بسهولة للمثيلة مرة أخرى ، بسبب ارتفاع قيمة pKa ، لتكوين ثنائي ميثيل أمين.

تم تقديم المثيلة الاختزالية لأول مرة كطريقة لتعديل البروتينات كيميائيا بواسطة Means and Feeney10. تتمثل مزايا هذا التفاعل في قابليته للتطبيق الواسع وظروف التفاعلات الخفيفة عند درجة الحموضة الفسيولوجية المخزنة ودرجات الحرارة المنخفضة11،12. في وجود الفورمالديهايد وعامل اختزال ، مثل مركب ثنائي ميثيل أمين بوران (DMAB) ، يتم ميثيل مجموعات اللايسين ε الأمينية والمجموعة الأمينية α الطرفية N بشكل انتقائي لإنتاج الأمينات ثنائية الميثيل. على الرغم من أن الفورمالديهايد معروف بربط البروتينات من خلال تكوين جسور الميثيلين ، إلا أن هذه العملية يتم حظرها بواسطة عامل الاختزال13،14.

تم استخدام المثيلة الاختزالية بنجاح لدراسة البروتينات باستخدام كل من الرنين المغناطيسي النووي وعلم البلورات بالأشعة السينية. تستخدم المثيلة المختزلة لتسهيل تبلور البروتينات المستعصية15. كان ليزوزيم بياض بيض الدجاجة أول بروتين متبلور في شكله ثنائي الميثيل. الفرق التربيعي الجذري المتوسط بين الذرات الثقيلة في هياكل الليزوزيم الميثيلية وغير الميثيلة هو 0.40 Å16. توضح هذه المقارنة أنه يمكن الحفاظ على بنية البروتين بعد المثيلة المختزلة ، مما يجعل التفاعل أداة قابلة للتطبيق لوضع العلامات لتوضيح الهيكل.

< p class = "jove_content">باستخدام 13فورمالديهايد المسمى C في تفاعل المثيلة المختزل ، يتم إنتاج 13أمينات ثنائي ميثيل C. 13 C-dimethylamines هي مجسات يمكن اكتشافها بواسطة الرنين المغناطيسي النووي وقد استخدمت على نطاق واسع لدراسة ديناميكيات البروتين وهيكله ووظيفته. تم استخدام الرنين المغناطيسي النووي والمثيلة المختزلة 13C لدراسة تفاعلات البروتين والترابط والبروتين للمستقبلات الأدريناليةβ 2 17 ، والريبونوكلياز A18 ، والليزوزيم19 ، والجين fd 5 بروتين20 ، والسيتوكروم ج21. وبالمثل ، تمت دراسة الخصائص الهيكلية والوظيفية ل 13ريبونوكلياز ميثيل C A22 ، الليزوزيم23 ، جين fd 5 بروتين24 ، المطثية pasteurianum ferredoxin25 ، جزء Fc من IgG26 ، صميم البروتين الشحمي A-I27 ، و MIP-1α28 تمت دراسة ديناميكيات مجموعات C-dimethylamino البالغ عددها 13على concanavalin A29-30 و calmodulin31.

< p class = "jove_content" >على الرغم من استخدام مثيلة C المختزلة 13على نطاق واسع لدراسة البروتينات باستخدام الرنين المغناطيسي النووي ، إلا أن طريقة وضع العلامات كانت دائما محدودة بسبب صعوبات تعيين رنين الرنين المغناطيسيالنووي 26. اعتمدت معظم استراتيجيات التخصيص ل 13بروتينا ميثيلا C بشكل مختزل على أعداد صغيرة من المواقع ، 20،28 الخصائص الهيكليةالمعروفة 11،19،23،26،31،32. أو تعديلات جينية واسعةالنطاق 33. لم تنجح أي من هذه الدراسات في تعيين جميع قمم C-dimethylamine البالغ عددها 13باستثناء دراسة calmodulin ، حيث تم تعيين القمم عن طريق الطفرات الموجهة للموقع لكل ليسين33. في دراسة تكوين ثنائي MIP-1α ، تم الإبلاغ لأول مرة عن استخدام قياس الطيف الكتلي (MS) للمساعدة في تعيين الرنين المغناطيسي النووي ل 13أمينتا ميثيلا C مختزلا28. تم استخدام MS لتأين الامتصاص بالليزر بمساعدة المصفوفة (MALDI-TOF) MS لتحديد اللايسين في واجهة الثنائي. تم تحديد اللايسينات الميثيلية جزئيا للببتيدات التريبتية MIP-1α البشرية مع MS وربطت بظهور إشارات أحادية وثنائي ميثيل أمين للبروتين السليم الذي لوحظ في أطياف 2D 1 H-13C HSQC NMR28. توسعت مجموعتنا في استخدام مرض التصلب العصبي المتعدد وقدمت طريقة تعيين لا تتطلب معرفة مسبقة ببنية البروتين أو خصائصه بخلاف تسلسل الأحماض الأمينية34. هذه الطريقة قابلة للتطبيق على معظم البروتينات. أحد الاستثناءات هو عندما يحتوي البروتين على ليسين N-terminal لأنه لا يمكن قياس الملف النظيري MS لليسين N-terminal α- و ε-13C-dimethylamines بشكل مستقل.

< p class = "jove_content">نقدم هنا طريقتين ، واحدة كيميائية والأخرى إنزيمية ، لتحديد α-dimethylamine الطرفية N ومواقع السلسلة الجانبية ε-dimethylamine لبقايا اللايسين N-terminal. الطريقة الأولى مستوحاة من كوردوفا وآخرون.الذين استخدموا الأس الهيدروجيني للتحكم في انتقائية أستلة البروتين35. يفضل التفاعل α-أمين الطرفي N عند درجة الحموضة المنخفضة والسلسلة الجانبية ε-أمينات عند درجة حموضة عالية ، مما يسمح بتمييز مجموعات البروتين α و ε الأمينية ، في دراساتهم ، مع الرحلان الكهربائي الشعري35. نوضح كيف يتم استخدام الأس الهيدروجيني المرتفع والمنخفض لتغيير وضع العلامات على المجموعات الأمينية البروتينية باستخدام تفاعل مثيلة C المختزل 13وللسماح بتطبيق استراتيجية التعيين بمساعدة MS. الطريقة الثانية لتعيين α- و ε-13C-dimethylamines تستفيد من الإزالة الانتقائية للبقايا (البقايا) الطرفية N باستخدام المؤتلف Aeromonas proteolytica aminopeptidase.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

فئة

1. المثيلة الاختزالية لليزوزيم

  1. تحضير 500 مل من محلول فوسفات الصوديوم 50 ملي مولار عند درجة الحموضة 7.5. يحفظ في درجة حرارة الغرفة.
  2. قم بتسمية ثلاثة أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1 مل للعينة ذات العلامات الكاملة (FLS) ، وعينة منخفضة الأس الهيدروجيني المسمى جزئيا (LpH) ، وعينة عالية الأس الهيدروجيني المسمى جزئيا (HpH).
  3. قم بوزن 10 مجم من الليزوزيم وقم بإذابه في 2 مل من محلول فوسفات الصوديوم المؤقتة لإنشاء محلول مائي بتركيز 5 مجم / مل. قم بتغطية الأنابيب بورق الألمنيوم لحماية الفورمالديهايد من التدهور بسبب التعرض للضوء. أضف 500 ميكرولتر من محلول الليزوزيم إلى كل أنبوب.
  4. قم بإعداد محاليل طازجة بطول 1.0 متر من مركب ثنائي ميثيل أمين بوران (DMAB) و 13سي فورمالديهايد. يحفظ في درجة حرارة 0 درجة مئوية.
  5. بالنسبة للعينة المصنفة بالكامل ، استخدم نسبة مولية تبلغ 1:10 (الأمين التفاعلي: الفورمالديهايد) ، وبالنسبة للعينات المصنفة جزئيا ، استخدم نسبة 1: 5. بدلا من ذلك ، يمكن تحسين النسبة. على سبيل المثال ، من أجل رؤية هيمنة ذروة C-dimethylamine α-13عند درجة حموضة منخفضة ، كانت هناك حاجة إلى نسبة 2: 7.
  6. أضف 6.1 ميكرولتر من 1.0 M DMAB إلى FLS ، وأضف 3.2 ميكرولتر من 1.0 M DMAB إلى LpH و HpH ، وقم بالدوامة برفق. ثم أضف 12.3 ميكرولتر من 1.0 M و 13C-formaldehyde إلى FLS و 6.1 ميكرولتر من 1.0 M 13C-formaldehyde إلى LpH و HpH. رج مخاليط التفاعل عند 4 درجات مئوية لمدة ساعتين.
  7. أضف كمية أخرى من 1.0 M DMAB و 13C-formaldehyde كما في الخطوة السابقة ورج خليط التفاعل طوال الليل عند 4 درجات مئوية لوقت تفاعل إجمالي من 18-24 ساعة.
  8. استبدل المخزن المؤقت للعينة بالفوسفات عند درجة الحموضة 7.5 لإزالة الكواشف الزائدة والمنتجات الجانبية باستخدام مرشح الطرد المركزي (قطع الوزن الجزيئي 3 كيلو دالتون).
  9. بالنسبة للعينات المصنفة جزئيا ، قم بميثيل العينات بشكل مختزل عند درجة الحموضة 7.5 مع الفورمالديهايد الوفرة الطبيعية لإنشاء بروتين معدل بشكل متجانس. قم بإعداد محاليل جديدة بطول 1.0 متر من DMAB والفورمالديهايد الوفرة الطبيعية.
  10. قم بتغطية أنابيب العينة بورق الألمنيوم ، وأضف 6.1 ميكرولتر من DMAB إلى LpH و HpH ، وقم بالدوامة برفق. ثم أضف 12.3 ميكرولتر من الفورمالديهايد الوفرة الطبيعية. رج مخاليط التفاعل عند 4 درجات مئوية لمدة ساعتين.
  11. أضف كمية أخرى من 1.0 M DMAB والفورمالديهايد الوفرة الطبيعية كما في الخطوة السابقة ورج مخاليط التفاعل طوال الليل عند 4 درجات مئوية لوقت تفاعل إجمالي يتراوح بين 18 و 24 ساعة. ثم قم بالتبادل المؤقت باستخدام الخطوات 2.5-2.6 وقم بتخزين عينات 50 ميكروغرام عند -20 درجة مئوية لمرض التصلب المتعدد.

2. تحضير العينة لتحليل الرنين المغناطيسي

النووي
  1. قم بإعداد محلول عازل لبورات الصوديوم 2.0 M عند درجة الحموضة 8.5 في H2O.
  2. أضف 375 ميكرولتر من محلول بورات الصوديوم 2.0 M إلى أربعة أنابيب مخروطية سعة 15 مل. Parafilm القمم وثقب الثقوب. ضع القارورة في قارورة مجففة وقم بتجميد العينة.
  3. ضع العينة المجمدة على مجفف التجفيف. قم بإزالته عندما يجف.
  4. باستخدام ماصة ، أضف 15 مل من D2O إلى كل أنبوب واخلطه.
  5. قم بتسمية ثلاثة مرشحات طرد مركزي سعة 4 مل (قطع الوزن الجزيئي 3 كيلو دالتون) باستخدام FLS و LpH و HpH. أضف العينة المقابلة إلى أنابيب الترشيح (~ 500 ميكرولتر). أضف 3.0 مل من 50 ملي مولار من بورات الصوديوم المخزن المؤقت عند درجة الحموضة 8.5 إلى كل أنبوب. اصنع أنبوب توازن للأنبوب الثالث وركز العينات على 500 ميكرولتر باستخدام جهاز طرد مركزي مع دوار بزاوية ثابتة 35 درجة عند 4 درجات مئوية و 7,500 RCF.
  6. أفرغ التراكب اللوني أسفل كل مرشح. أضف 3.0 مل أخرى من المخزن المؤقت إلى العينات وركز العينات مرة أخرى على 500 ميكرولتر. كرر الخطوة 2.5 4x.
  7. باستخدام اختبار بروتين حمض البيسنكونينيك (BCA)36 ، حدد تركيز كل عينة. خفف عينات الليزوزيم بمحلول بورات الصوديوم 50 ملي مولار لعمل عينات 150 ميكرومتر.
  8. نقل 530 ميكرولتر إلى أنبوب الرنين المغناطيسي النووي 5 مم أو 250 ميكرومتر إلى أنبوب متطابق للحساسية المغناطيسية 5 مم.
  9. قم بإعداد محلول مخزون 80 ملي من 1،2-ثنائي كلورو الإيثان -13C2 في D2O. قم بتخزين محلول المخزون هذا عند -80 درجة مئوية. خفف إلى 24 ملي مولار في 80 ميكرولتر ونقله إلى أنبوب إدخال متحد المحور لاستخدامه كمرجع في تحليل الرنين المغناطيسي النووي. تحليل العينات باستخدام الرنين المغناطيسي النووي. ملاحظة: قم بتشغيل 1D 1 H-13C HSQC وقم بدمج مناطق الذروة لكل رنين. يجب أن تكون مناطق الذروة هي نفسها للعينة المصنفة بالكامل.
< p class = "jove_title" >3. تحلل أمينوببتيداز من الليزوزيم

  1. تحضير محلول 5 مجم / مل من الليزوزيم في ماء عالي النقاء.
  2. أضف 250 ميكرولتر من محلول الليزوزيم إلى أنبوب طرد مركزي نظيف سعة 1 مل.
  3. أضف 25 ميكرولتر من محلول tricine 0.1 M ، ودرجة الحموضة 8.0 ، و 6 ميكرولتر من محلول Aeromonas proteolytica aminopeptidase 2.16 ميكروغرام / مل.
  4. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 6 ساعات.
  5. أضف 6 ميكرولتر إضافية من محلول أمينوببتيداز 2.16 ميكروغرام / مل إلى العينة للحصول على نسبة مولية تبلغ 1:50 من أمينوببتيداز إلى الليزوزيم. احتضان للإضافة 20 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  6. تحلية 30 ميكرولتر من العينة باستخدام عمود دوران C18 ، (اتبع بروتوكول الشركة المصنعة). يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية لتحليل MALDI MS.
  7. قم بإعداد عينة البروتين المتبقية للرنين المغناطيسي النووي كما هو موضح في البروتوكول 2).
< p class = "jove_title" >4. تحضير عينات لقياس الطيف الكتلي

  1. باستخدام 50 ميكروغرام من العينة المحجوزة في الخطوة 2.3 ، قم باستبدال المخزن المؤقت ب 100 ملي مولار بيكربونات الأمونيوم ، ودرجة الحموضة 8.0 ، والتركيز إلى حوالي 50 ميكرولتر باستخدام مرشح طرد مركزي 1 مل (قطع الوزن الجزيئي 3 كيلو دالتون). انقل العينة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1 مل ولفه بورق الألمنيوم.
  2. أضف 2.0 ميكرولتر من 500 ملي مولار ديثيوثريتول لتقليل روابط ثاني كبريتيد. احتضان المحلول عند 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  3. أضف 2 ميكرولتر من 500 ملي مولار من اليودوأسيتاميد الطازج لأكللة مجموعات الثيول. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
  4. قم بإزالة ورق القصدير وأضف 1.0 ميكرولتر من محلول ديثيوثريتول 500 ملي مولار لإخماد التفاعل.
  5. أضف 2.0 ميكروغرام من التربسين بدرجة التسلسل لهضم البروتين. احتضان الخليط عند 37 درجة مئوية لمدة 16-24 ساعة.
  6. أضف TFA حتى يصبح الرقم الهيدروجيني أقل من 2 لإرواء عملية الهضم. (يمكن استخدام أحماض الفورميك والخليك أيضا)
  7. قم بتحلية العينة على عمود دوران C18 وقم بإزالة البروتين في 80٪ أسيتونيتريل / 0.1٪ TFA. جفف العينة باستخدام مكثف فراغ.
  8. أعد تكوين العينة في 5.0 ميكرولتر من 50٪ أسيتونيتريل / 0.1٪ TFA لتحليل MALDI MS. امزج كميات متساوية من العينة المعاد تكوينها ومحلول مشبع من محلول مصفوفة حمض ثنائي هيدروكسي بنزويك 2،5 على اللوحة المستهدفة MALDI. تحليل العينات على MALDI MS. ملاحظة: استخدم MS الترادفي لتأكيد هوية قمم الببتيد. قم بتنعيم الأطياف الكتلية وتحليلها. لكل ببتيد يحتوي على ثنائي ميثيل أمين ، حدد كثافة الذروة ومساحة الذروة لكل نظير في الملف الشخصي. احسب النسبة المئوية ل 13C-incorporation كما هو موضح سابقا34.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

المثيلة الاختزالية والأس الهيدروجيني (pH)

تم إثبات تفاعل مثيلة كيميائية انتقائية مختزلة لـ 13C محفزة بالـ pH على إنزيم الليزوزيم. عند pH منخفض، يفضل التفاعل الـ α-amine في النهاية N على الـ ε-amines في السلسلة الجانبية، والعكس صحيح عند pH مرتفع. في المحلول، توجد المجموعات الأمينية للبروتين في حالة توازن بين الأمين الحر والحمض المرافق، وهو توازن يمكن ضبطه عن طريق الـ pH. يعتمد نطاق pH الأمثل لهذا التفاعل على العامل المختزل المستخدم؛ وفي هذه الحالة، يكون الـ pH الأمثل لـ dimethy...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يعد تعيين إشارات الرنين المغناطيسي النووي ل 13بروتينا مختزلا بميثيل C أمرا ضروريا للاستفادة الكاملة من طريقة وضع العلامات النظيرية هذه. يعد استخدام MS للمساعدة في تخصيص إشارات الرنين المغناطيسي النووي من خلال ارتباط بيانات الدمج الجزئية 13C تقنية واعدة. تتمثل ميزة هذه التقنية على طرق التعيين الأخرى في أن هناك حاجة فقط إلى تسلسل الأحماض الأمينية الأولية. تكون طريقة التعيين بمساعدة MS محدودة عندما يكون الحمض الأميني N-terminal عبارة عن ليسين لأن دمج 13C في α-ثنائي ميثيل أمين و ε-ثن...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدينا ما نكشف عنه.

شكر وتقدير

< p class = "jove_content">تم دعم هذا البحث من قبل الجائزة رقم R00RR024105 من المركز الوطني لموارد البحث ، المعهد الوطني للصحة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أسيتونيتريلسيجما34851
أميكون الترا 4 مل فلتر طرد مركزي (3 كيلو MWCO)فيشر UFC800308 العلمي(8 عبوات)
أمينوبيبتيدازكرييفت بيو مارتأمينوبيبتيداز -86 أمبير
بيكربونات الأمونيومسيجماA6141
كبريتات الأمونيومسيجماA5132
مركب البوران ثنائي ميثيل أمينسيجما180238اصنع محلول طازج بطول 1 متر قبل الاستخدام.
حمض البوريكسيجماB6768
البنكرياس البقري الأنسولينSigmaI5500
C18 أعمدة الدورانالحرارية العلمية89870
أكسيد الديوتيريوممختبرات كامبريدج للنظائرDLM-4-100
1،2-ثنائي كلورو الإيثان-13< / sup>C2< / sub>Sigma714321محلول مخزون 80 ملي مولار مخزن عند -80 درجة مئوية. يستخدم كمرجع في أطياف الرنين المغناطيسي النووي عند 24 ملليمتر.
الفورمالديهايد (36.5٪ بالوزن / الوزن)سيجما33220اصنع محلول 1 متر طازجا قبل الاستخدام.
13C-formaldehyde (99٪)Cambridge Isotope LaboratoriesCLM-806-1اصنع محلول 1 M طازجا قبل الاستخدام.
ليزوزيم (بياض بيض الدجاجة)سيجماL6376
فوسفات الصوديوم (ثنائي الهيبتاهيدرات ثنائي القاعدة)سيجماS9390
فوسفات الصوديوم (أحادي القاعدة)سيجماS9638
تريسينسيجماT0377
حمض ثلاثي فلورو أسيتيكسيجما302031
700 ميجاهرتز فاريان VNMRS مع مسبار 5 مم HCN 5922Agilent تقنيات
Bruker UltrafleXtreme MALDI TOF / TOFBruker

المراجع

  1. Bax, A., Grzesiek, S. Methodological Advances in Protein NMR. Accounts of Chemical Research. 26 (4), 131-138 (1993).
  2. Shimba, N., Yamada, N., Yokoyama, K., Suzuki, E. Enzymatic Labeling of Arbitrary Proteins. Analytical Biochemistry. 301 (1), 123-127 (2002).
  3. Palomares, L., Estrada-Moncada, S., Ramírez, O. Production of Recombinant Proteins. Recombinant Gene Expression. Balbás, P., Lorence, A. 267, Humana Press. New York City, New York, USA. 15-51 (2004).
  4. Graslund, S., et al. Protein Production and Purification. Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).
  5. Terwilliger, T. C., Stuart, D., Yokoyama, S. Lessons from Structural Genomics. Annual Review of Biophysics. 38, 371-383 (2009).
  6. Goto, N. K., Kay, L. E. New Developments in Isotope Labeling Strategies for Protein Solution NMR Spectroscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 10 (5), 585-592 (2000).
  7. Lian, L., Middleton, D. Labelling Approaches for Protein Structural Studies by Solution-State and Solid-State NMR. Progress in Nuclear Magn. Reson. Spectroscopy. 39 (3), 171-190 (2001).
  8. Mason, A., Siarheyeva, A., Haase, W., Lorch, M., van Veen, H., Glaubitz, C. Amino Acid Type Selective Isotope Labelling of the Multidrug ABC Transporter LmrA for Solid-State NMR Studies. Febs Lett. 568 (1-3), 117-121 (2004).
  9. Chen, C., et al. Preparation of Amino-Acid-Type Selective Isotope Labeling of Protein Expressed in Pichia pastoris. Proteins:Structure Function and Bioinformatics. 62 (1), 279-287 (2006).
  10. Means, G., Feeney, R. Reductive Alkylation of Amino Groups in Proteins. Biochem. 7 (6), 2192 (1968).
  11. Jentoft, J. E., Jentoft, N., Gerken, T. A., Dearborn , D. G. C-13 NMR-Studies of Ribonuclease-A Methylated With Formaldehyde-C-13. J. Biol. Chem. 254 (11), 4366-4370 (1979).
  12. Rayment, I. Reductive alkylation of lysine residues to alter crystallization properties of proteins. Macromolecular Crystallography, Pt A. 276 (97), 171-179 (1997).
  13. French, D., Edsall, J. T. The Reactions of Formaldehyde with Amino Acids and Proteins. Adv. Protein Chem. 2, 277-335 (1945).
  14. Jentoft, N., Dearborn, D. G. Labeling of Proteins by Reductive Methylation Using Sodium Cyanoborohydride. J. Biol. Chem. 254 (11), 4359-4365 (1979).
  15. Walter, T., et al. Lysine Methylation as a Routine Rescue Strategy for Protein Crystallization. Struct. 14 (11), 1617-1622 (2006).
  16. Rypniewski, W., Holden, H., Rayment, I. Structural Consequences of Reductive Methylation of Lysine Residues in Hen Egg-White Lysozyme - An X-ray Analysis at 1.8-Angstrom Resolution. Biochem. 32 (37), 9851-9858 (1993).
  17. Bokoch, M. P., et al. Ligand-specific regulation of the extracellular surface of a G-protein-coupled receptor. Nat. 463 (7277), (2010).
  18. Jentoft, J., Gerken, T., Jentoft, N., Dearborn, D. C-13] Methylated Ribonuclease-A - C-13 NMR Studies of the Interaction of Lysine 41 with Active Site. 256 (1), 231-236 (1981).
  19. Sherry, A., Teherani, J. Physical Studies of C-13-Methylated Concanavalin A - pH and Co2+-Induced Nuclear Magn. Reson. Shifts. J. Biol. Chem. 258 (14), 8663-8669 (1983).
  20. Dick, L., Sherry, A., Newkirk, M., Gray, D. Reductive Methylation and C-13 NMR Studies of the Lysyl Residues of fd Gene 5 Protein - Lysines 24, 46, and 69 May be Involved in Nucleic Acid Binding. J. Biol. Chem. 263 (35), 18864-18872 Forthcoming.
  21. Moore, G. R., et al. N-epsilon,N-epsilon-dimethyl-lysine cytochrome c as an NMR probe for lysine involvement in protein-protein complex formation. Biochem. J. 332, 439-449 (1998).
  22. Jentoft, J. E., Gerken, T. A., Jentoft, N., Dearborn, D. G. Studies of the Active-Site Lysine of Ribonuclease-A By C-13 NMR. Biophys. J. 25 (2), 56 (1979).
  23. Gerken, T., Jentoft, J., Jentoft, N., Dearborn, D. Intramolecular Interactions of Amino Groups in C-13 Reductively Methylated Hen Egg-White Lysozyme. J. Biol. Chem. 257 (6), 2894-2900 (1982).
  24. Dick, L. R., Geraldes, C., Sherry, A. D., Gray, C. W., Gray, D. M. C-13 NMR of Methylated Lysines of fd Gene-5 Protein - Evidence for A Conformational Change Involving Lysine-24 Upon Binding of A Negatively Charged Lanthanide Chelate. Biochem. 28 (19), 7896-7904 (1989).
  25. Gluck, M., Sweeney, W. V. C-13-NMR of Clostridium-Pasteurianum Ferredoxin After Reductive Methylation of the Amines Using C-13 Formaldehyde. Biochimica Et Biophysica Acta. 1038 (2), 146-151 (1990).
  26. Jentoft, J. E. Reductive Methylation and C-13 Nuclear-Magnetic-Resonance in Structure-Function Studies of Fc Fragment and Its Subfragments. Methods in Enzymology. 203, 261-295 (1991).
  27. Sparks, D., Phillips, M., Lundkatz, S. The Conformation of Apolipoprotein A-I in Discoidal and Spherical Recombinant High Density Lipoprotein Particles - C-13 NMR Studies of Lysine Ionization. J. Biol. Chem. 267 (36), 25830-25838 (1992).
  28. Ashfield, J., et al. Chemical Modification of a Variant of Human MIP-1 Alpha, Implications for Dimer Structure. Protein Science. 9 (10), 2047-2053 (2000).
  29. Goux, W., Teherani, J., Sherry, A. Amine Inversion in Proteins - A C-13-NMR Study of Proton Exchange and Nitrogen Inversion Rates in N-Epsilon,N-Epsilon,N-Alpha,N-Alpha-[C-13]Tetramethyllysine, N-Epsilon,N-Epsilon,N-Alpha,N-Alpha[C-13]Tetramethyllysine Methyl-Ester, and Reductively Methylated Concanavalin-A. Biophysical Chemistry. 19 (4), 363-373 (1984).
  30. Sherry, A. D., Keepers, J., James, T. L., Teherani, J. Methyl Motions in C-13 Methylated Concanavalin-as Studied by C-13 Magnetic-Resonance Relaxation Techniques. Biochemistry. 23 (14), 3181-3185 (1984).
  31. Huque, M., Vogel, H. C-13 NMR Studies of the Lysine Side Chains of Calmodulin and Its Proteolytic Fragments. Journal of Protein Chemistry. 12 (6), 695-707 (1993).
  32. Brown, L., Bradbury, J. Proton-Magnetic-Resonance Studies of Lysine Residues of Ribonuclease-A. Eur. J. Biochem. 54 (1), 219-227 (1975).
  33. Zhang, M., Vogel, H. Determination of the Side Chain pKa Values of the Lysine Residues in Calmodulin. J. Biol. Chem. 268 (30), 22420-22428 (1993).
  34. Macnaughtan, M., Kane, A., Mass Prestegard, J. Spectrometry Assisted Assignment of NMR Resonances in Reductively C-13-Methylated Proteins. J. Am. Chem. Soc. 127 (50), 17626-17627 (2005).
  35. Cordova, E., Gao, J., Whitesides, G. M. Noncovalent Polycationic Coatings for Capillaries in Capillary Electrophoresis of Proteins. Anal. Chem. 69 (7), 1370-1379 (1997).
  36. Smith, P. K., et al. Measurement of Protein Using Bicinchoninic Acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
  37. Larda, S. T., Bokoch, M. P., Evanics, F., Prosser, R. S. Lysine methylation strategies for characterizing protein conformations by NMR. J. Biomolec. NMR. 54 (2), 199-209 (2012).
  38. Bradbury, J. H., Brown, L. R. Determination of Dissociation Constants of Lysine Residues of Lysozyme by Proton-Magnetic-Resonance Spectroscopy. Eur. J. Biochem. 40 (2), 565-576 (1973).
  39. Frey, S. T., Guilmet, S. L., Egan, R. G., Bennett, A., Soltau, S. R., Holz, R. C. Immobilization of the Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica on Mg2+/Al3+ Layered Double Hydroxide Particles. Acs Appl. Mater., & Interfaces. 2 (10), 2828-2832 (2010).
  40. Poncz, L., Dearborn, D. G. The Resistance to Tryptic Hydrolysis of Peptide-Bonds Adjacent to N-epsilon,N-Dimethyllysyl Residues. J. Biol. Chem. 258 (3), 1844-1850 (1983).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تعيين رنين الرنين المغناطيسي النوويالميثيلة الاختزالية للكربون 13وسم البروتينتحليل طيف الكتلةتعديل الليزوزيمالترابط الكمي المنفرد غير المتجانستحلل أمينوببتيدازإجراء تبديل المنظمدمج نظير الكربونالكشف عن أمين الطرف النتروجيني
طرق تحديد رنين الرنين المغناطيسي النووي ل 13C-dimethyl N-terminal amine على البروتينات الميثيلية المختزلة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.