Method Article

A منصة القائم على الحنق عالية الإنتاجية التي تتلاءم مع تحديد وتوصيف البوتولينوم السموم العصبية ضوء سلسلة المغيرون

DOI:

10.3791/50908

⸱

December 27th, 2013

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, The Scripps Research Institute, 2Worm Institute of Research and Medicine (WIRM), The Scripps Research Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

السلسلة الخفيفة للسموم العصبية البوتولينوم من النوع A (BoNT / A LC) عبارة عن تياز معدني يدخل الخلايا العصبية الحركية ، ويشق ركيزته SNAP-25 ، ويعطل النقل العصبي ، مما يؤدي إلى شلل رخو. باستخدام اختبار قائم على FRET متوافق مع الإنتاجية العالية ، يمكن فحص المكتبات الكبيرة من الجزيئات الصغيرة بحثا عن تأثيرها على النشاط الأنزيمي BoNT / A LC.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Botulinum neurotoxin (BoNT) هو سم بكتيري قوي ومميت يرتبط بالخلايا العصبية الحركية المضيفة ، ويتم استيعابه في الخلية ، ويشق البروتينات داخل الخلايا الضرورية لإطلاق الناقل العصبي. يتكون BoNT من سلسلة ثقيلة (HC) ، والتي تتوسط ارتباط الخلية المضيفة واستيعابها ، وسلسلة خفيفة (LC) ، والتي تشق البروتينات المضيفة داخل الخلايا الضرورية لإطلاق الأسيتيل كولين. في حين أن العلاجات التي تمنع ربط / استيعاب السموم لها نافذة زمنية صغيرة للإعطاء ، فإن المركبات التي تستهدف نشاط LC داخل الخلايا لها نافذة زمنية أكبر بكثير من الإدارات ، خاصة ذات صلة بالنظر إلى عمر النصف الطويل للغاية للسام. في السنوات الأخيرة ، تم تحليل الجزيئات الصغيرة بشكل كبير كمثبطات LC محتملة بناء على نفاذيتها الخلوية المتزايدة بالنسبة للعلاجات الأكبر (الببتيدات ، الأبتامير ، إلخ). غالبا ما يتضمن تحديد الرصاص فحصا عالي الإنتاجية (HTS) ، حيث يتم فحص مكتبات كبيرة من الجزيئات الصغيرة بناء على قدرتها على تعديل الوظيفة العلاجية المستهدفة. نصف هنا مقايسة قائمة على FRET مع ركيزة BoNT / A LC تجارية و LC مؤتلف يمكن أتمتة HTS لمثبطات BoNT المحتملة. علاوة على ذلك ، نصف تقنية يدوية يمكن استخدامها لمتابعة الفحص الثانوي ، أو لمقارنة فاعلية العديد من المركبات المرشحة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_content" > Botulinum neurotoxin A (BoNT / A) ، أقوى سم معروف حاليا (LD50 ~ 1 نانوغرام / كجم) 1 ، هو سم عصبي قوي تنتجه بكتيريا المطثية البوتولينوم. داخل المضيف المصاب ، يعطل BoNT / A النقل العصبي عند التقاطع العصبي العضلي عن طريق ربط الخلايا العصبية الحركية ، واستيعابها في العصارة الخلوية ، وفي النهاية شق البروتينات العصبية الضرورية لإفراز الخلايا الأسيتيل كولين. بمجرد دخولها إلى الخلايا العصبية ، يمكن أن يستمر BoNT / A لمدة تصل إلى عدة أشهر2. تثبيط طويل الأمد لإطلاق الأسيتيل كولين يعيق تقلص العضلات الطبيعي ويؤدي إلى شلل رخو, الذي, في الحالات الشديدة, قد يؤدي إلى فشل القلب و / أو الجهاز التنفسي. نظرا لقوائها الشديدة وسهولة إنتاجها وتأثيراتها طويلة المدى داخل المضيف ، فقد صنف مركز السيطرة على الأمراض جميع الأنماط المصلية ل BoNT على أنها عوامل إرهاب بيولوجي عالية الخطورة.

تتضمن آلية عمل السم العديد من الخطوات ، بما في ذلك الارتباط بمستقبلات سطح الخلايا العصبية ، والامتصاص الخلوي عن طريق الالتقام الخلوي بوساطة المستقبلات ، والانتقال إلى العصارة الخلوية للخلايا العصبية. يتكون BoNT / A من سلسلتين ، سلسلة ثقيلة وخفيفة ، وكلتا السلسلتين مطلوبتان للسمية. تحتوي السلسلة الثقيلة (HC) على مجالات ربط ونقل ، في حين أن السلسلة الخفيفة (LC) عبارة عن ميتالوبروتياز يعتمد على الزنك ينتقل من الجسيم الداخلي إلى السيتوبلازم. بمجرد دخوله إلى العصارة الخلوية ، يتمركز LC / A metaloprotease في الغشاء السيتوبلازمي الداخلي ويشق البروتين المضيف المرتبط بالغشاء SNAP-25. SNAP-25 هو عضو في عائلة بروتين SNARE (مستقبلات البروتين القابل للذوبان N-Ethylmaleimide Sensitive Factor Attachment) ، والتي تلعب دورا مهما في إفراز الخلايا الأسيتيل كولين (تمت مراجعته في المرجع3). يضعف انقسام LC / A ل SNAP-25 وظيفة SNARE المعقدة ، مما يمنع إطلاق الناقل العصبي الأسيتكولين ويضعف تقلص العضلات.

حاليا ، علاج التسمم الغذائي محدود وغالبا ما يتضمن إعطاء جسم مضاد معادل للخيول4 ؛ ومع ذلك ، نظرا لأن السم يتم استيعابه بسرعة في الخلايا العصبية ، فإن الجسم المضاد لديه نافذة زمنية ضيقة للإدارة. وبالتالي ، يعتقد العديد من الباحثين أن BoNT / A LC قد يكون هدفا علاجيا أفضل. نظرا لأن LC هو ميتالوبروتياز يعتمد على الزنك ، فقد كان أحد طرق تثبيط نشاط LC / A هو تطوير مركبات تعمل على مخلب أيون الزنك في الموقع النشط. على سبيل المثال ، تعمل مركبات الهيدروكسامات على استخلاص الزنك في الموقع النشط ولها فاعلية ممتازة في المختبر (Ki من أفضل مثبطات جزيئات صغيرة BoNT / A LC حتى الآن هي 77 نانومتر)5. ومع ذلك ، فإن العديد من الجزيئات الصغيرة تفشل في التقدم كعلاجات بسبب مشاكل مختلفة خارج الجسم الحي أو في الجسم الحي ، بما في ذلك ضعف الذوبان المائي ، والتمثيل الغذائي السريع ، و / أو السمية الخلوية العالية. لذلك ، هناك حاجة إلى مركبات جديدة ذات خصائص دوائية وحركية دوائية محسنة. غالبا ما يتضمن تحديد مركب الجزيئات الصغيرة فحصا عالي الإنتاجية (HTS) لتحديد السقالات الجديدة. استندت الطرق الأولية لفحص نشاط BoNT / A LC إلى اكتشاف HPLC لانقسام الركيزة الببتيد القصير ، والذي يستغرق وقتا طويلا وغير قابل للتطبيق HTS6-8. بعد ذلك ، طور شميدت وزملاؤه9 مقايسة نشاط BoNT / A LC عالية الإنتاجية تستخدم ركيزة ببتيد تحمل علامة الفلورسين متصلة تساهميا بلوحة ميكروتيتر. يشق BoNT / A LC الركيزة ويطلق الفلورسين ، والذي يمكن قياسه كميا باستخدام مقياس الفلور. يسمح شكل لوحة هذا الاختبار بفحص العديد من المركبات في وقت واحد. ومع ذلك ، يتطلب الاختبار وضع العلامات على الببتيدات الاصطناعية بالفلورسين وطلاء ألواح الفحص بجزيئات الركيزة المشتقة ، وهي تقنيات مرهقة. تم وصف طريقة أبسط بكثير للكشف عن نشاط BoNT / A LC بتركيزات منخفضة لاحقا بواسطة Schmidt et al. ، حيث تم استخدام سلسلة من الركائز الفلورية لمراقبة نشاط BoNT LC في الوقت الفعلي10. تشمل التقنيات الإضافية الموصوفة في الأدبيات إزالة الاستقطاب بعد الاختبار القائم على نقل الطاقة بالرنين لاكتشاف وقياس نشاط BoNT في المستخلصات الخام. يمكن استخدام هذه الطريقة للتطبيقات عالية الإنتاجية10،11 ، على الرغم من أنها تتطلب معدات متطورة لقياس نقل طاقة الرنين الفلوري (FRET) وإشارات الاستقطاب. أخيرا ، تم الإبلاغ عن العديد من النماذج القائمة على الخلايا لتسمم BoNT (تمت مراجعتها في المرجع11) والتي ستمكن الباحثين من دراسة الخصائص المقيدة في كثير من الأحيان للمركبات المذكورة سابقا ، بما في ذلك السمية الخلوية ونفاذية الخلية والاستقرار. ومع ذلك ، فإن معظم المقايسات القائمة على الخلايا الحالية غير قابلة لهيئة تحرير الشام ، وهي تتطلب عمالة ووقتا مكثفا.

هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا لطريقة HTS التي تستخدم ركيزة BoNT / A LC المتوفرة تجاريا القائمة على FRET. تعتمد الركيزة على تسلسل الانقسام SNAP-25 وهي عبارة عن ببتيد اصطناعي 13 mer يحتوي على فلوروفور طرفي ومروء. يفصل انقسام BoNT / A بين الفلوروفور والتبريد ، مما يلغي FRET ويزيد من التألق المقاس ، والذي يمكن قياسه باستمرار في قارئ لوحة مقياس الفلور. يتم استخدام الاختبار بشكل روتيني في مختبراتنا ، وكذلك في مختبراتنا الأخرى ، لتحديد فئات جديدة من مثبطات BoNT / A LC أو لتحديد الفاعلية النسبية للمركبات المحددة مسبقا5،12-15. هذا الاختبار مناسب ل HTS بسبب بساطته وإمكانات الأتمتة وانخفاض تكلفة المواد وقدرته على فحص العديد من المركبات في وقت واحد (انظر المرجع16; Caglič et al. ، قدم. Bompiani et al. ، قيد التحضير). بالإضافة إلى HTS ، يمكن استخدام هذا الاختبار لمقارنة الفاعلية النسبية للمركبات عن طريق تحديد قيمة IC50 (التركيز المطلوب لتثبيط 50٪ من نشاط BoNT / A LC) للمركب. يمكن إجراء الفحص يدويا بتنسيق 96 بئرا (قسم الفرز اليدوي في نص البروتوكول) أو يمكن أتمتته بتنسيق 384 بئرا ل HTS (قسم التشغيل الآلي في نص البروتوكول).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
فئة

الفحص اليدوي أو تحديد IC50

يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد الفاعلية النسبية للمركب (قيمة IC50) عن طريق تحضير سلسلة تخفيف للمركب ، أو للفحص يدويا لمثبطات الجزيئات الصغيرة بتركيز واحد.

1. تحضير المخازن المؤقتة والكواشف والأجهزة المطلوبة

  1. تحضير 50 مل من عازلة الفحص (40 ملي مولار HEPES ، درجة الحموضة 7.4 و 0.01٪ Tween-20) وتعقيم الترشيح. يمكن تخزين المخزن المؤقت في درجة حرارة الغرفة (RT) لعدة أشهر.
  2. قم بإعداد تخفيف عمل 70 نانومتر من السم العصبي المؤتلف / سلسلة خفيفة (LC / A (1-425)) 17 في مخزن مؤقت للفحص ، دوامة برفق ، وتخزينها على الثلج. يتطلب اختبار كل مركب ما لا يقل عن 120 ميكرولتر من تخفيف العمل LC / A.
  3. قم بإعداد 7 ميكرومتر من FRET القائم على BoNT / A LC لتخفيف العمل في المخزن المؤقت للفحص الذي يحتوي على 10٪ DMSO. في البداية ، قم بتخفيف محلول مخزون 5 ملي مولار من الركيزة بحجم مناسب من 100٪ DMSO ثم أضف ببطء (من حيث الإسقاط) المخزن المؤقت للفحص أثناء الخلط برفق. لفها بورق القصدير واحفظها على الثلج. يتطلب اختبار كل مركب ما لا يقل عن 130 ميكرولتر من تخفيف عمل الركيزة.
  4. قم بتكوين قارئ لوحة ميكروتيتر مضان لهز اللوحة بسرعة متوسطة لمدة 10 ثوان ، ثم راقب التألق عند الأطوال الموجية للإثارة والانبعاث 490 نانومتر و 523 نانومتر ، على التوالي ، كل 5 دقائق (الوضع الحركي) لمدة 90 دقيقة في RT. لاحظ أن تكوين المنتج (أي الزيادة في التألق) يكون خطيا طوال هذه الفترة الزمنية (الشكل 1 أ).
فئة < p = "jove_title" >2. تحضير سلسلة التخفيف المركب

  1. تحديد نطاق التركيز المركب (أي عدد التخفيفات في سلسلة التخفيف وعامل التخفيف) ؛ يتم اختيار نطاق التركيز بناء على قيمة IC50 المتوقعة لضمان ملاءمة المنحنى المثلى. بالنسبة للمركبات ذات IC50 غير المعروف ، استخدم مخزون مركب غير مخفف كأعلى تركيز مركب.
  2. تسمية الأنابيب مع اسم المركب المناسب والتركيز.
  3. Aliquot 100٪ DMSO لجميع الأنابيب لإعدادها للتخفيف التسلسلي المركب. يوصى بحجم تخفيف نهائي لا يقل عن 2 ميكرولتر ، حيث يتم استخدام 1 ميكرولتر من كل تركيز لكل بئر في لوحة الفحص. على سبيل المثال ، تتطلب سلسلة التخفيف القياسية 1: 3 خلط 2 ميكرولتر من المركب مع 4 ميكرولتر DMSO لكل أنبوب.
  4. قم بإعداد التخفيفات التسلسلية للمركبات والدوامة أو امزجها يدويا جيدا بين كل تخفيف؛ قم بتغيير أطراف الماصة بين كل تخفيف. بالنسبة لسلسلة التخفيف القياسية 1: 3 ، أضف 2 ميكرولتر من المركب غير المخفف إلى 4 ميكرولتر من DMSO في الأنبوب الأول من سلسلة التخفيف واخلطه جيدا. باستخدام طرف ماصة جديد ، قم بإزالة 2 ميكرولتر من التخفيف الأول وأضف إلى 4 ميكرولتر من DMSO في الأنبوب الثاني ؛ اخلط جيدا. كرر مع التخفيفات المتبقية. تأكد من خلط التخفيفات المركبة جيدا للتأكد من دقة تركيزات المركب.
  5. غطي الأنابيب المركبة واتركيها جانبا في RT.
< p class = "jove_title" >3. تحضير اللوحة واكتشافها (الجدول 1)

  1. احصل على صفيحة سوداء ذات قاع مسطح ، معتم ، سعة 96 بئرا. راجع إعداد اللوحة الموصى به في الجدول 1 ، حيث يتم تنسيق كل سلسلة تخفيف مركبة في صفوف من لوحة 96 بئرا. قم بتوزيع 1 ميكرولتر من التخفيف المركب المعني يدويا مباشرة إلى قاع كل بئر مقابل (الآبار 1-9). توزيع 1 ميكرولتر من أعلى تركيز للمركب المراد اختباره على بئر 11 (التحكم في التألق الجوهري المركب).
  2. قم بتوزيع 1 ميكرولتر من مثبط قوي معروف يدويا إلى البئر 12 (التحكم الإيجابي) ، و 1 ميكرولتر 100٪ DMSO إلى البئر 10 (التحكم السلبي).
  3. باستخدام ماصة آلية ، قم بتوزيع 79 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص على جانب الآبار 1-10 و 12 (التخفيفات المركبة والتحكم الإيجابي) ، و 89 ميكرولتر إلى جانب البئر 11 (التحكم في التألق الجوهري المركب). تأكد من عدم لمس الطرف الموجود في قاع البئر حيث يوجد المركب حتى لا تلوث الآبار.
  4. قم بتدوير تخفيف العمل LC / A واستخدم ماصة آلية لإضافة 10 ميكرولتر إلى جانب كل بئر ، باستثناء البئر 11 (التحكم المضان الجوهري المركب). اضغط برفق على اللوحة للتأكد من أن كل الإنزيم المضاف يذهب إلى قاع البئر.
  5. امزج الطبق وقم بتغطيته واحتضانه برفق لمدة 5 دقائق في RT. توفر هذه الحضانة خطوة ما قبل التوازن للمركبات للارتباط ب LC / A قبل إضافة الركيزة.
< p class = "jove_title" >4. إضافة الركيزة وقياس التألق

  1. قم بدوامة الركيزة BoNT / A LC برفق ، وباستخدام ماصة آلية ، أضف 10 ميكرولتر من الركيزة إلى الجانب الآخر من كل بئر. تأكد من إضافة الركيزة إلى جانب البئر المقابل للمكان الذي تمت إضافة الإنزيم فيه سابقا.
  2. اضغط برفق على اللوحة لخلط الكواشف ، وضعها على الفور في قارئ اللوحة وابدأ قياس التألق بالإعدادات المحددة مسبقا في الخطوة 1.4.
  3. يتم حساب سرعات الإنزيم من ميل الخط المتولد عن طريق رسم الرسم البياني لوحدة التألق النسبية (RFU) مقابل الوقت خلال الفترة الخطية للتفاعل.
< p class = "jove_content" >الجدول 1.تخطيط لوحة الفحص المقترح.

حسنا # وصف حسنا مركب المخزن المؤقت للفحص الركيزه خطاب الاعتماد DMSO 1 الجرعة المركبة 1 1 ميكرولتر 79 ميكرولتر 10 ميكرولتر 10 ميكرولتر --- 2 الجرعة المركبة 2 1 ميكرولتر 79 ميكرولتر 10 ميكرولتر 10 ميكرولتر --- 3 الجرعة المركبة 3 1 ميكرولتر 79 ميكرولتر 10 ميكرولتر 10 ميكرولتر --- 4 الجرعة المركبة 4 1 ميكرولتر 79 ميكرولتر 10 ميكرولتر 10 ميكرولتر --- 5 الجرعة المركبة 5 1 ميكرولتر 79 ميكرولتر 10 ميكرولتر 10 ميكرولتر --- 6 الجرعة المركبة 6 1 ميكرولتر 79 ميكرولتر 10 ميكرولتر 10 ميكرولتر --- 7 الجرعة المركبة 7 1 ميكرولتر 79 ميكرولتر 10 ميكرولتر 10 ميكرولتر --- 8 الجرعة المركبة 8 1 ميكرولتر 79 ميكرولتر 10 ميكرولتر 10 ميكرولتر --- 9 الجرعة المركبة 9 1 ميكرولتر 79 ميكرولتر 10 ميكرولتر 10 ميكرولتر --- 10 التحكم السلبي
(100٪ نشاط LC) --- 79 ميكرولتر 10 ميكرولتر 10 ميكرولتر 1 ميكرولتر 11 التحكم في التألق الجوهري المركب 1 ميكرولتر 89 ميكرولتر 10 ميكرولتر --- --- 12 التحكم الإيجابي
(0٪ نشاط LC) 1 ميكرولتر 79 ميكرولتر 10 ميكرولتر 10 ميكرولتر ---

التشغيل الآلي للفحص عالي الإنتاجية

5. تحضير المخازن المؤقتة والكواشف والألواح المركبة والرموز الشريطية والأجهزة المطلوبة

  1. قم بإذابة ألواح مركب المخزون المختومة في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة على الأقل.
  2. قم بإعداد 500 مل (أو أكثر ، اعتمادا على عدد المركبات المراد فحصها) من المخزن المؤقت للفحص (40 ملي مولار HEPES ، درجة الحموضة 7.4 و 0.01٪ Tween-20) وتعقيم الترشيح. يمكن تخزين المخزن المؤقت للمقايسة المصفى في RT لعدة أشهر.
  3. قم بإعداد تخفيف عمل 8.75 نانومتر من المؤتلف BoNT / A LC (1-425) في المخزن المؤقت للفحص ، والدوامة ، وتخزينها على الجليد. يتطلب كل بئر في صفيحة منخفضة الحجم 384 بئرا 8 ميكرولتر. قم بإعداد فائض بنسبة 10-15٪ ، أو حوالي 3.7 مل أو كل طبق منخفض الحجم 384 بئر.
  4. قم بإعداد تخفيف عمل الركيزة BoNT / A LC القائم على FRET 3.5 ميكرومتر في مخزن مؤقت للفحص يحتوي على 10٪ DMSO. في البداية ، قم بتخفيف محلول مخزون 5 ملي مولار للركيزة مباشرة بالحجم المناسب بنسبة 100٪ DMSO ، ثم أضف المخزن المؤقت للفحص ببطء (من حيث السقوط) أثناء الخلط برفق. لفها بورق القصدير واحفظها على الثلج. يتطلب كل بئر في صفيحة منخفضة الحجم 384 بئرا 2 ميكرولتر. قم بإعداد فائض بنسبة 10-15٪ ، أو ما يقرب من 1 مل لكل طبق منخفض الحجم 384 بئر.
  5. قم بإعداد الرموز الشريطية لكل لوحة ميكروتيتر سوداء ، 384 بئرا ، منخفضة الحجم [لوحة فحص] وقم بلصق الملصق مباشرة على جانب اللوحة حيث يمكن لماسح الباركود قراءته ؛ تأكد من أن الملصق لا يمتد على جانب اللوحة ، أو قد يتداخل مع التعامل مع اللوحة وتكديسها. رص اللوحات بترتيب رقمي واتركها جانبا. قم بتغطية اللوحة العلوية. لاحظ أن هذه الخطوة اختيارية ، ولكنها تسهل تتبع النتائج إلى المركبات المقابلة عند استخدام لوحات متعددة.
    6. قم
  6. بالطرد المركزي لألواح مركب المخزون المذابة والمختومة عند 200 × جم لمدة 30 ثانية في RT. قم بإزالة ختم اللوحة بعناية ، وتأكد من إزالة أي مادة لاصقة متبقية ، وقم بتغطية اللوحة بغطاء بلاستيكي نظيف لمنع التبخر. لاحظ أنه في حالة وجود أي مادة لاصقة على سطح اللوحة ، فقد تتداخل مع النقل التلقائي للغطاء وتكديس اللوحة. ضع اللوحة المغطاة في فندق متصل بمعالج السوائل. لا تبقي الألواح مكشوفة وإلا سيحدث تبخر.
  7. قم بتكوين قارئ لوحة ميكروتيتر مضان مكدس لقراءة تألق كل لوحة فحص عند أطوال موجات الإثارة والانبعاث 490 نانومتر و 523 نانومتر ، على التوالي ، كل 30 دقيقة (الوضع الحركي) لمدة 3-6 دورات في RT.
< p class = "jove_title" >6. تحضير أداة الدبوس

  1. افحص بصريا أداة الدبوس ذات 384 رأسا بحثا عن أي تشوهات، بما في ذلك الالتواء أو التشقق أو الحطام الكبير.
  2. املأ ثلاث صواني منفصلة بحوالي 1 بوصة من الميثانول بنسبة 100٪ (درجة HPLC) ، و 100٪ من الأيزوبروبانول (درجة HPLC) ، ومحلول تنظيف أداة الدبوس المخفف في الماء فائق النقاء.
  3. املأ محطة التنظيف على معالج السوائل بنسبة DMSO بنسبة 100٪.
  4. قم بتكديس 2-3 قطع من ورق النشاف النظيف الجديد في صينية. من المهم معايرة الروبوت في المحور z بحيث تتلامس المسامير مع ورق النشاف ، ولكن لا تثقبه.
  5. قم بتأمين مرفق مروحة بمنطقة العمل لتجفيف المسامير بعد الغسيل.
  6. قم بتوصيل أداة الدبوس بالذراع الآلي لمعالج السوائل وقم بتنظيف المسامير مسبقا عن طريق الغمس في DMSO ، والتجفيف على ورق النشاف ، والنقع لمدة دقيقتين في محلول التنظيف ، والتجفيف على ورق النشاف ، والغمس في الأيزوبروبانول ، والتجفيف على ورق النشاف ، والغمس في الميثانول ، والتجفيف على ورق النشاف ، وأخيرا التجفيف فوق المروحة.
فئة

7. تحضير موزع سائل منخفض الحجم

  1. قم بتوصيل كاسيت منخفض الحجم (1-10 ميكرولتر) بموزع السوائل ، وقم بتوصيل خط النفايات بوعاء مناسب.
  2. افحص بصريا فوهات توزيع الكاسيت وتأكد من أنها ليست مشوهة أو ممزقة أو مسدودة. من المهم الحفاظ على نظافة القنوات والفوهات لأن هطول الأمطار أو الحطام سيؤثر على توزيع السوائل.
  3. قم بتجهيز القنوات عن طريق تشغيل 30 مل من الماء فائق النقاء ، و 30 مل من الإيثانول 70٪ ، ثم 30 مل من الماء عالي النقاء مرة أخرى مباشرة في وعاء النفايات.
  4. ضع لوحة فحص منخفضة الحجم 384 بئرا في موزع السائل وأضف حجما معروفا من الماء إلى كل بئر. افحص بصريا للتأكد من أن كل بئر يتلقى الحجم الصحيح ولا يوجد انسكاب أو محلول يتم توزيعه بين الآبار.
  5. قم بتجهيز الأنابيب بالهواء لمدة 5 ثوان تقريبا لإزالة الماء وتجفيف القنوات.
فئة

8. الاستغناء عن سلسلة BoNT / A الخفيفة في لوحة الفحص

  1. اغمر خط سحب موزع السائل في محلول عمل BoNT / A LC ، وقم بإزالة أي هواء ، وقم بتوزيع 8 ميكرولتر في كل بئر من لوحة فحص منخفضة الحجم 384 بئر. لاحظ أنه يمكن وضع الألواح يدويا على منطقة عمل معالج السوائل ، أو وضعها تلقائيا وإعادة تكديسها باستخدام فندق لوحة مرفق.
  2. قم بتغطية كل طبق بغطاء بلاستيكي نظيف وقم بتكديسه في عمود مختلف من فندق اللوحة المتصل بمعالج السوائل. لا تبقي الألواح غير محكمة الغلق وإلا سيحدث التبخر.
  3. نظف موزع السائل عن طريق تشغيل 30 مل من الماء عالي النقاء ، و 30 مل من الإيثانول 70٪ ، و 30 مل من الماء عالي النقاء مرة أخرى مباشرة في وعاء النفايات.
  4. قم بتجهيز الأنابيب بالهواء لمدة 5 ثوان تقريبا لتجفيف القنوات.
< p class = "jove_title" >9. ختم المركبات في لوحة الفحص

  1. قم بتعيين مناطق على منصة معالج السوائل للألواح المركبة وألواح الفحص والحاويات مع محاليل التنظيف.
  2. قم ببرمجة معالج السائل لوضع الألواح المركبة وألواح الفحص في المواضع المحددة وإزالة أغطية اللوحة قبل الختم.
    3. ختم
  3. 50 nl من المركب مباشرة في لوحة الفحص التي تحتوي على 8 ميكرولتر من BoNT / A LC. عند معايرة برنامج الختم ، تأكد من غمر المسامير ، لكن لا تخدش الجزء السفلي من لوحة الفحص. لاحظ أن إضافة المركبات في DMSO بنسبة 100٪ قد تخلق منطقة محلية من تمسخ الإنزيم أثناء تشتتها. لذلك يجب توخي الحذر لتقييم مستوى تمسخ الإنزيم من خلال مقارنة التحكم في DMSO فقط بالتحكم غير المعالج (أي الإنزيم دون إضافة DMSO).
  4. قم بتنظيف المسامير بعد كل طبق عن طريق الغمس في DMSO ، والتجفيف على ورق النشاف ، والغمس في الأيزوبروبانول ، والتجفيف على ورق النشاف ، والغمس في الميثانول ، والتجفيف على ورق النشاف ، وأخيرا التجفيف فوق المروحة.
  5. بعد ختم المركبات في لوحة الفحص باستخدام الإنزيم ، قم بتكديس ألواح مركب المخزون وألواح الفحص بشكل منفصل. قم بتغطية لوحة الفحص العلوية في المكدس لمنع التبخر واتركها جانبا. تأكد من احتضان LC بالمركبات لمدة 5 دقائق على الأقل في RT ؛ يمكن استخدام أوقات حضانة أطول عند ختم عدد كبير من اللوحات.
< p class = "jove_title" >10. الاستغناء عن الركيزة في لوحة الفحص

  1. اغمر خط السحب الخاص بمعالج السائل في محلول عمل الركيزة BoNT / A LC وقم بحمايتها من الضوء. افحص فوهات التوزيع للتأكد من أنها جافة وغير مسدودة. قم بتجهيز القنوات لإزالة جميع فقاعات الهواء.
  2. قم بفك تكديس ألواح الفحص وقم بتوزيع 2 ميكرولتر من تخفيف العمل للركيزة في كل بئر. تأكد من توزيع الركيزة مباشرة في كل بئر. قم بتكديس اللوحات وضع لوحة فحص فارغة واحدة أعلى اللوحة الأولى ولوحة فارغة واحدة أسفل اللوحة السفلية في المكدس لمنع التبخر أثناء القراءة وإعادة التكديس في قارئ اللوحة.
< p class = "jove_title" >11. قياسات التألق

  1. قم على الفور بتحميل كومة لوحات الفحص في قارئ لوحة الفلورة.
  2. ابدأ قياس التألق بالإعدادات المحددة مسبقا في الخطوة 5.7. يتم حساب معدل الفحص لكل مركب من رسم بياني لوحدة التألق النسبية (RFU) بمرور الوقت. لاحظ أنه من المهم تضمين التحكم السلبي (DMSO) للحصول على معدل غير مقيد ؛ يمكن أيضا إضافة تحكم إيجابي مع مثبط معروف إلى كل لوحة. يظهر إخراج تمثيلي من نقطة زمنية واحدة في الشكل 2.
< ص الفئة = "jove_title" >12. التنظيف

  1. أغلق كل لوحة مخزون مركبة بختم رقائق معدنية باستخدام أسطوانة ، واحفظها في درجة حرارة -80 درجة مئوية.
  2. بعد قراءة كل لوحة فحص ، تخلص من الألواح وأي LC / A متبقية أو تخفيفات ركيزة في النفايات البيولوجية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن إجراء مقايسة BoNT / A LC المستندة إلى FRET يدويا بطريقة منخفضة الإنتاجية لتوصيف المثبطات المعروفة أو فحص المكتبات الصغيرة ؛ بدلا من ذلك ، يمكن تقليص البروتوكول وأتمتته للفحص عالي الإنتاجية (HTS) مع مكتبات كبيرة بهدف تحديد مثبطات BoNT / A LC الجديدة. بغض النظر عن النهج المتبع ، يجب ملاحظة زيادة في التألق بمرور الوقت عندما يتم احتضان BoNT / A LC مع الركيزة (يوضح الشكل 1 أ مؤامرة تمثيلية للمضان بمرور الوقت). إذا تم اختبار التخفيفات التسلسلية للمركب ، فغالبا ما يتم الحصول على سلسلة من الخطوط ذات المنحدر...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمثل اختبار BoNT / A LC القائم على FRET الموصوف هنا طريقة جذابة لتحديد وتوصيف الجزيئات الصغيرة التي تعدل نشاط BoNT / A LC. تجعل الطبيعة القائمة على الحلول للمقايسة هذا البروتوكول قابلا للفحص عالي الإنتاجية الموضح في قسم التشغيل الآلي في نص البروتوكول. غالبا ما يستخدم عامل Z لتحديد مدى ملاءمة الفحص لحملات HTS18. تم تحديده على أنه Z = 1 - 3 (σp + σn) / (μp - μn) ، عامل Z 1 مثالي ، بين 0.5-1 ممتاز ، وأقل من 0.5 هامشي. عامل Z لبروتوكول HTS كما هو موضح هنا هو 0.89 (الانحر...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل بمنحة من المعاهد الوطنية للصحة (AI082190 إلى TJD) ومعهد كاليفورنيا للطب التجديدي (TB1-01186 و CL1-00502).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
HEPESTeknovaH1021
Tween-20Fisher ScientificBP337-100
الميثانول (درجة HPLC)Sigma-Aldrich34860
Isopropanol (درجة HPLC)Sigma-Aldrich650447
لوحة فحص سوداء 96 بئرCostar3915
384 بئر لوحة فحص سوداء منخفضة الحجمGreiner788076
SNAPtide FITC / Dabcylقائمة الركيزة المختبرات البيولوجية521الدبوس الركيزة BoNT / A LC القائم على FRET
V & P ScientificVP 110
ورق نشاف خال من الوبرV& P ScientificVP 540DB
Biomek ختم وعينة أغطية رقائق الألومنيومبيكمان كولتر538619
محلول تنظيف

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schantz, E. J., Johnson, E. A. Properties and use of botulinum toxin and other microbial neurotoxins in medicine. Microbiol. Rev. 56, 80-99 (1992).
  2. Sloop, R. R., Cole, B. A., Escutin, R. O. Human response to botulinum toxin injection: type B compared with type A. Neurology. 49, 189-194 (1997).
  3. Willis, B., Eubanks, L. M., Dickerson, T. J., Janda, K. D. The strange case of the botulinum neurotoxin: using chemistry and biology to modulate the most deadly poison. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 47, 8360-8379 (2008).
  4. Tacket, C. O., Shandera, W. X., Mann, J. M., Hargrett, N. T., Blake, P. A. Equine antitoxin use and other factors that predict outcome in type A foodborne botulism. Am. J. Med. 76, 794-798 (1984).
  5. Capek, P., et al. Enhancing the Pharmacokinetic Properties of Botulinum Neurotoxin Serotype A Protease Inhibitors Through Rational Design. ACS Chem. Neurosci. 2, 288-293 (2011).
  6. Schmidt, J. J., Bostian, K. A. Proteolysis of synthetic peptides by type A botulinum neurotoxin. J. Protein Chem. 14, 703-708 (1995).
  7. Schmidt, J. J., Bostian, K. A. Endoproteinase activity of type A botulinum neurotoxin: substrate requirements and activation by serum albumin. J. Protein Chem. 16, 19-26 (1997).
  8. Schmidt, J. J., Stafford, R. G., Bostian, K. A. Type A botulinum neurotoxin proteolytic activity: development of competitive inhibitors and implications for substrate specificity at the S1' binding subsite. FEBS Lett. 435, 61-64 (1998).
  9. Schmidt, J. J., Stafford, R. G., Millard, C. B. High-throughput assays for botulinum neurotoxin proteolytic activity: serotypes A, B, D, and F. Anal. Biochem.. 296, 130-137 (2001).
  10. Schmidt, J. J., Stafford, R. G. Fluorigenic substrates for the protease activities of botulinum neurotoxins serotypes A, B, and F. Appl. Environ. Microbiol. 69, 297-303 (2003).
  11. Pellett, S. Progress in cell based assays for botulinum neurotoxin detection. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 364, 257-285 (2013).
  12. Boldt, G. E., et al. Synthesis, characterization and development of a high-throughput methodology for the discovery of botulinum neurotoxin a inhibitors. J. Comb. Chem. 8, 513-521 (2006).
  13. Henkel, J. S., et al. Catalytic properties of botulinum neurotoxin subtypes A3 and A4. Biochemistry. 48, 2522-2528 (2009).
  14. Joshi, S. G. Detection of biologically active botulinum neurotoxin--A in serum using high-throughput FRET-assay. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 65, 8-12 (2012).
  15. Smith, G. R., et al. Reexamining hydroxamate inhibitors of botulinum neurotoxin serotype A: extending towards the beta-exosite. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22, 3754-3757 (2012).
  16. Eubanks, L. M., et al. An in vitro and in vivo disconnect uncovered through high-throughput identification of botulinum neurotoxin A antagonists. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 2602-2607 (2007).
  17. Baldwin, M. R., Bradshaw, M., Johnson, E. A., Barbieri, J. T. The C-terminus of botulinum neurotoxin type A light chain contributes to solubility, catalysis, and stability. Protein Expr. Purif. 37, 187-195 (2004).
  18. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
  19. Capkova, K., Hixon, M. S., McAllister, L. A., Janda, K. D. Toward the discovery of potent inhibitors of botulinum neurotoxin A: development of a robust LC MS based assay operational from low to subnanomolar enzyme concentrations. Chem. Commun. , 3525-3527 (2008).
  20. Pires-Alves, M., Ho, M., Aberle, K. K., Janda, K. D., Wilson, B. A. Tandem fluorescent proteins as enhanced FRET-based substrates for botulinum neurotoxin activity. Toxicon. 53, 392-399 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Botulinum Neurotoxin Light ChainFRET based AssayHigh throughput ScreeningCompound Dilution SeriesFluorescence Plate ReaderEnzyme Inhibition KineticsIC50 DeterminationAutomated Liquid HandlingSubstrate Hydrolysis MeasurementInhibitor Potency Comparison

Related Articles