السلسلة الخفيفة للسموم العصبية البوتولينوم من النوع A (BoNT / A LC) عبارة عن تياز معدني يدخل الخلايا العصبية الحركية ، ويشق ركيزته SNAP-25 ، ويعطل النقل العصبي ، مما يؤدي إلى شلل رخو. باستخدام اختبار قائم على FRET متوافق مع الإنتاجية العالية ، يمكن فحص المكتبات الكبيرة من الجزيئات الصغيرة بحثا عن تأثيرها على النشاط الأنزيمي BoNT / A LC.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
A منصة القائم على الحنق عالية الإنتاجية التي تتلاءم مع تحديد وتوصيف البوتولينوم السموم العصبية ضوء سلسلة المغيرون
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
Botulinum neurotoxin (BoNT) هو سم بكتيري قوي ومميت يرتبط بالخلايا العصبية الحركية المضيفة ، ويتم استيعابه في الخلية ، ويشق البروتينات داخل الخلايا الضرورية لإطلاق الناقل العصبي. يتكون BoNT من سلسلة ثقيلة (HC) ، والتي تتوسط ارتباط الخلية المضيفة واستيعابها ، وسلسلة خفيفة (LC) ، والتي تشق البروتينات المضيفة داخل الخلايا الضرورية لإطلاق الأسيتيل كولين. في حين أن العلاجات التي تمنع ربط / استيعاب السموم لها نافذة زمنية صغيرة للإعطاء ، فإن المركبات التي تستهدف نشاط LC داخل الخلايا لها نافذة زمنية أكبر بكثير من الإدارات ، خاصة ذات صلة بالنظر إلى عمر النصف الطويل للغاية للسام. في السنوات الأخيرة ، تم تحليل الجزيئات الصغيرة بشكل كبير كمثبطات LC محتملة بناء على نفاذيتها الخلوية المتزايدة بالنسبة للعلاجات الأكبر (الببتيدات ، الأبتامير ، إلخ). غالبا ما يتضمن تحديد الرصاص فحصا عالي الإنتاجية (HTS) ، حيث يتم فحص مكتبات كبيرة من الجزيئات الصغيرة بناء على قدرتها على تعديل الوظيفة العلاجية المستهدفة. نصف هنا مقايسة قائمة على FRET مع ركيزة BoNT / A LC تجارية و LC مؤتلف يمكن أتمتة HTS لمثبطات BoNT المحتملة. علاوة على ذلك ، نصف تقنية يدوية يمكن استخدامها لمتابعة الفحص الثانوي ، أو لمقارنة فاعلية العديد من المركبات المرشحة.
المقدمة
< p class = "jove_content" > Botulinum neurotoxin A (BoNT / A) ، أقوى سم معروف حاليا (LD50 ~ 1 نانوغرام / كجم) 1 ، هو سم عصبي قوي تنتجه بكتيريا المطثية البوتولينوم. داخل المضيف المصاب ، يعطل BoNT / A النقل العصبي عند التقاطع العصبي العضلي عن طريق ربط الخلايا العصبية الحركية ، واستيعابها في العصارة الخلوية ، وفي النهاية شق البروتينات العصبية الضرورية لإفراز الخلايا الأسيتيل كولين. بمجرد دخولها إلى الخلايا العصبية ، يمكن أن يستمر BoNT / A لمدة تصل إلى عدة أشهر2. تثبيط طويل الأمد لإطلاق الأسيتيل كولين يعيق تقلص العضلات الطبيعي ويؤدي إلى شلل رخو, الذي, في الحالات الشديدة, قد يؤدي إلى فشل القلب و / أو الجهاز التنفسي. نظرا لقوائها الشديدة وسهولة إنتاجها وت....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
فئة
الفحص اليدوي أو تحديد IC50
يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد الفاعلية النسبية للمركب (قيمة IC50) عن طريق تحضير سلسلة تخفيف للمركب ، أو للفحص يدويا لمثبطات الجزيئات الصغيرة بتركيز واحد.
1. تحضير المخازن المؤقتة والكواشف والأجهزة المطلوبة
- تحضير 50 مل من عازلة الفحص (40 ملي مولار HEPES ، درجة الحموضة 7.4 و 0.01٪ Tween-20) وتعقيم الترشيح. يمكن تخزين المخزن المؤقت في درجة حرارة الغرفة (RT) لعدة أشهر.
- قم بإعداد تخفيف عمل 70 نانومتر من السم العصبي المؤتلف / سلسلة خفيفة (LC / A (1-425)) 17 في مخزن مؤقت للفحص ، دوامة برفق ، وتخزينها على الثلج. ي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يمكن إجراء مقايسة BoNT/A LC القائمة على تقنية FRET يدويًا وبإنتاجية منخفضة لتوصيف المثبطات المعروفة أو فحص مكتبات صغيرة من المركبات؛ وبدلاً من ذلك، يمكن تصغير البروتوكول وأتمتته للفحص عالي الإنتاجية (HTS) باستخدام مكتبات كبيرة بهدف تحديد مثبطات جديدة لـ BoNT/A LC. وبغض النظر عن النهج المتبع، يجب ملاحظة زيادة في الفلورة بمرور الوقت عند تحضين BoNT/A LC مع الركيزة (يُظهر الشكل 1A مخططًا تمثيليًا للفلورة بمرور الوقت). وفي حال اختبار تخفيفات متسلسلة لمركب ما، غالبًا ما يتم الحصول على سلسلة من الخطوط ذات ميول .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يمثل اختبار BoNT / A LC القائم على FRET الموصوف هنا طريقة جذابة لتحديد وتوصيف الجزيئات الصغيرة التي تعدل نشاط BoNT / A LC. تجعل الطبيعة القائمة على الحلول للمقايسة هذا البروتوكول قابلا للفحص عالي الإنتاجية الموضح في قسم التشغيل الآلي في نص البروتوكول. غالبا ما يستخدم عامل Z لتحديد مدى ملاءمة الفحص لحملات HTS18. تم تحديده على أنه Z = 1 - 3 (σp + σn) / (μp - μn) ، عامل Z 1 مثالي ، بين 0.5-1 ممتاز ، وأقل من 0.5 هامشي. عامل Z لبروتوكول HTS كما هو موضح هنا هو 0.89 (الانحر.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل بمنحة من المعاهد الوطنية للصحة (AI082190 إلى TJD) ومعهد كاليفورنيا للطب التجديدي (TB1-01186 و CL1-00502).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| HEPES | Teknova | H1021 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| الميثانول (درجة HPLC) | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| Isopropanol (درجة HPLC) | Sigma-Aldrich | 650447 | |
| لوحة فحص سوداء 96 بئر | Costar | 3915 | |
| 384 بئر لوحة فحص سوداء منخفضة الحجم | Greiner | 788076 | |
| SNAPtide FITC / Dabcyl | قائمة الركيزة المختبرات البيولوجية | 521 | الدبوس الركيزة BoNT / A LC القائم على FRET |
| V & P Scientific | VP 110 | ||
| ورق نشاف خال من الوبر | V& P Scientific | VP 540DB | |
| Biomek ختم وعينة أغطية رقائق الألومنيوم | بيكمان كولتر | 538619 |
المراجع
- Schantz, E. J., Johnson, E. A. Properties and use of botulinum toxin and other microbial neurotoxins in medicine. Microbiol. Rev. 56, 80-99 (1992).
- Sloop, R. R., Cole, B. A., Escutin, R. O. Human response to botulinum toxin injection: type B compared with type A.....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
