مقالة منهجية

تحليل عيوب العضلات الهيكلية في يرقات أسماك الزرد عن طريق الانكسار الثنائي ومقايسات استجابة الهروب باللمس

7.8K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/50925

⸱

ديسمبر 13, 2013

 ,  , 
1Division of Genetics and Genomics, Manton Center for Orphan Disease Research, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School

في هذه المقالة

ملخص

< p class = "jove_content"> أصبحت سمكة الزرد الآن أداة راسخة وقوية لنمذجة الحثل العضلي والاعتلال العضلي الخلقي والأمراض العصبية العضلية ذات الصلة. الانكسار الثنائي وسلوك الهروب الذي يثير اللمس هما فحوصان شائعان غير جراحيان يستخدمان لتحديد درجة الفوضى العضلي وضعف القاطرة لأجنة أسماك الزرد أثناء التطور المبكر.

الملخص

أصبحت أسماك الزرد (Danio rerio) أداة فعالة بشكل خاص لنمذجة الأمراض البشرية التي تؤثر على عضلات الهيكل العظمي ، بما في ذلك ضمور العضلات1-3 ، والاعتلال العضلي الخلقي4،5 ، والاضطرابات في التجميع السارمي6،7 ، بسبب الحفظ الجيني والهيكلي العالي مع الثدييات8. يمكن تقييم الفوضى العضلية وضعف القاطرة بسرعة في أسماك الزرد خلال الأيام القليلة الأولى بعد الإخصاب. فحصان للمساعدة في توصيف عيوب العضلات الهيكلية في أسماك الزرد هما الانكسار الثنائي (الهيكلي) واستجابة الهروب التي تثيرها اللمس (سلوكية).

Birefringence هي خاصية فيزيائية يتم فيها تدوير الضوء أثناء مروره عبر المادة المرتبة ، مثل المصفوفة الزائفة البلورية من تسييم العضلات9. إنه نهج بسيط وغير جراحي لتقييم سلامة العضلات في يرقات سمك الزرد الشفافة في وقت مبكر من النمو. تبدو أسماك الزرد البرية ذات العضلات الهيكلية عالية التنظيم مشرقة جدا وسط خلفية مظلمة عند تصورها بين مرشحين ضوئيين مستقطبين ، في حين أن طفرات العضلات لها أنماط انكسار ثنائية خاصة بالاضطراب العضلي الأساسي الذي تصوغه. نمذجة ضمور العضلات ، وهي أمراض تتميز بتنكس الألياف العضلية متبوعة بجولات متكررة من التجديد ، تظهر بقعا داكنة تنكسية في عضلات الهيكل العظمي تحت الضوء المستقطب. لا ترتبط الاعتلالات العضلية غير الضمور بالنخر أو التغيرات التجديدية ، ولكنها تؤدي إلى ألياف عضلية غير منظمة وضعف عضلات الهيكل العظمي. عادة ما تظهر أسماك الزرد العضلية انخفاضا عاما في الانكسار الثنائي ، مما يعكس عدم تنظيم القشر العضلي.

يتضمن اختبار الهروب الذي يتم استحضاره باللمس مراقبة سلوك السباحة للجنين استجابة للتحفيز اللمسي10-12. بالمقارنة مع اليرقات البرية ، تظهر اليرقات الطافرة في كثير من الأحيان تقلصا ضعيفا في الهروب ، تليها السباحة البطيئة أو أي نوع آخر من الحركة الضعيفة التي تفشل في دفع اليرقات أكثر من مسافة قصيرة12. تتمثل ميزة هذه المقايسات في أنه يمكن مراقبة تطور المرض في نفس النوع من الأسماك في الجسم الحي لعدة أيام ، وأنه يمكن تحليل أعداد كبيرة من الأسماك في وقت قصير بالنسبة للفقاريات الأعلى.

البروتوكول

فئة

1. تحليل في الجسم الحي لبنية العضلات الهيكلية عن طريق الانكسار الثنائي

  1. قم بإعداد أقفاص التزاوج التي تفصل الذكور (الذكور) عن الإناث من خط (خطوط) سمكة الزرد المرغوبة في وقت متأخر من بعد الظهر بعد الرضاعة.
    1. يميز الإناث من خلال بطنهن الأكبر ولونهن الأزرق / الأبيض الطفيف ، والذكور من خلال شكل أجسامهم النحيف وألوانها الوردية / الصفراء.
      2. قد
    2. يكون النجاح مع الصلبان الزوجية (ذكر وأنثى واحدة) حوالي 50٪ فقط. للحصول على معدل نجاح أعلى ، قم بتزاوج ذكر واحد مع 2-3 إناث.
  2. قم بإزالة فواصل الأقفاص في صباح اليوم التالي بعد وقت قصير من بداية الضوء والسماح للأسماك بالتكاثر دون إزعاج.
  3. اجمع البيض باستخدام مصفاة عند وضع أعداد كافية من البيض المخصب في قاع الخزان.
  4. انقل الأجنة إلى طبق بتري عميق عن طريق شطف المصفاة بماء السمك وأعد الأسماك الأم إلى أحواض اليهود. ضع أطباق الأجنة في حاضنة 28.5 درجة مئوية.
  5. نظف البيض والحطام الذي لا يحيا في وقت لاحق من ذلك اليوم أو في صباح اليوم التالي ، وأعد الأجنة إلى الحاضنة لمزيد من النمو.
  6. تصل الأجنة / اليرقات إلى العمر المناسب لمراقبة الانكسار الثنائي في 3-7 أيام بعد الإخصاب (dpf) ، حيث من المحتمل أن تعاني النتائج قبل 3 dpf من تباين محدود. تفقس الأجنة البرية من مشيماتها بين 48-60 ساعة بعد الإخصاب (HPF) ، متبوعة باستقامة محور الجسم. قد تتطلب الأجنة البرية أو الطافرة المتأخرة الفقس إزالة التآكل اليدوي.
    1. قم بتمزق المشيمة برفق باستخدام ملقط حاد واقلبها رأسا على عقب حتى يسقط الجنين.
    2. اسمح للأجنة المتكللة بالاستقامة قبل بدء الفحص.
    3. تخدير الأجنة (الأجنة) بطبقة التريكيين (0.04٪ في ماء السمك) للمساعدة في وضعها الصحيح.
  7. قم بتركيب مجهر تشريح بعدسة مستقطبة يمكن تدويرها لضبط زاوية الضوء المستقطب (الشكل 1 أ).
  8. ضع الأجنة (الأجنة) المخدرة والمخدرة مباشرة فوق عدسة مستقطبة ثانية على طول المحور الجانبي للجسم. يجب وضع العدسة الثانية أسفل العدسة العلوية ، على مرحلة المجهر (الشكل 1 ب). لا تستخدم أطباق بتري البلاستيكية في أي وقت أثناء فحص الانكسار الثنائي ، لأن البلاستيك ليس وسيلة مناسبة لنقل الضوء المنكسر.
  9. قم بتدوير العدسة العلوية مع عرض الجنين محل الاهتمام حتى يتم توجيه محاور الاستقطاب للعدستين بزاوية 90 درجة من بعضها البعض وتصبح الخلفية مظلمة تماما.
  10. يعتمد الناتج الأمثل للفحص على اتجاه الأسماك بين عدستين مستقطبين. حرك السمكة للتأكد من أنها مستلقية بشكل مسطح قدر الإمكان.
    1. إذا كانت السمكة منحنية ، فإن الأجزاء ذات الاتجاه المسطح فقط هي التي ستمر بالضوء المستقطب وتظهر انكسارا. في مثل هذه الحالات ، قم بقياس الانكسار المزدوج في المناطق المسطحة وسجل الانكسار المزدوج للمنطقة المقابلة في الأسماك البرية (على سبيل المثال ، الجسيدات 1-10 في كل من الأسماك البرية والأسماك الطافرة).
  11. راقب النمط الظاهري ثنائي الانكسار للأسماك.
      تظهر
    1. الأسماك البرية ذات العضلات الهيكلية عالية التنظيم انكسادا ثنائيا ساطعا ، حيث أن معامل الانكسار للضوء الموازي للخيوط العضلية أعلى من الضوء المستقطب العمودي على هذه الهياكل.
      2. عادة
    2. ما تظهر الأسماك ذات العضلات الهيكلية غير المنظمة التي توحي باعتلال عضلي غير تنكسي أو عيب في النمو انخفاضا عاما في الانكسار الثنائي.
      3. عادة
    3. ما تظهر الأسماك ذات العضلات الهيكلية غير المنظمة المميزة للحثل العضلي نمطا يشبه الرقعة من الانكسار الثنائي ، حيث تمثل المناطق المظلمة تنكس العضلات بين المناطق المشرقة لبنية العضلات الطبيعية.
  12. حدد الانسدادات الثنائية عن طريق التقاط صور للأسماك البرية والمتحولة تحت الضوء المستقطب في نفس إعدادات التعريض الضوئي والتكبير. احفظ الصور كملفات .tiff.
    1. افتح صور الانكسار المزدوج في برنامج ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/).
    2. لكل صورة ، حدد منطقة عضلة الزرد عن طريق رسم خط حول الجسم باستخدام خيار "اختيارات المضلع" من شريط الأدوات.
    3. استخدم "تعيين القياسات" ضمن القائمة المنسدلة "تحليل" لتحديد الإحصائيات المطلوبة للصورة.
      1. يتطلب الحد الأدنى للتحديد تحديد مربعات "المنطقة" و"متوسط القيمة الرمادية" و"الحد الأدنى والحد الأقصى للقيمة الرمادية".
      2. ستشير القيمة الرمادية القصوى البالغة >255 إلى تشبع البكسل. لذلك، استخدم الصور ذات القيم الرمادية القصوى الأقل من 255.
    4. قم بتطبيع متوسط الشدة مع المنطقة المحددة وكرر إجراء القياس الكمي نفسه لكل صورة انكسار مزدوج.

2. فحص سلوك الهروب الذي يستثاره باللمس

  1. قم بإعداد أزواج تزاوج من خط (خطوط) سمك الزرد المناسب وجمع الأجنة كما هو موضح أعلاه في الخطوات 1.1-1.5.
  2. بعد 2-7 أيام من الإخصاب ، ضع الأجنة / اليرقات منزوعة الغضب بشكل فردي في طبق بتري عميق أو غرف الألواح متعددة الآبار.
  3. من خلال العمل مع جنين واحد فقط في كل مرة، قم بتوسيط الجنين في مجال رؤية مجهر مجسم SMZ1500 من نيكون باستخدام نظام الكاميرا الرقمية SPOT RT3 أو ما شابه ذلك، وابدأ التصوير المتسلسل.
    1. يجب استخدام نفس تردد التصوير لكل من الأسماك البرية والأسماك الطافرة. يوصى بمعدلات الإطارات > 30 هرتز ، حيث لن تكون المعدلات الأبطأ كافية عادة لالتقاط السباحة السريعة للأسماك البرية.
  4. توصيل المحفزات الحسية الميكانيكية للجنين عن طريق لمس الذيل بدبوس حشرة.
  5. توقف عن التصوير عندما يتوقف الجنين عن السباحة أو يسبح خارج مجال الرؤية.
  6. قم بتحويل الصور المتسلسلة إلى ملف فيديو ، أو قم بتحليل الإطارات الفردية للصور ذات اللقطات المتتابعة دون اتصال بالإنترنت ، باستخدام برنامج SPOT 5.1 المتقدم. تتضمن حزم البرامج المماثلة Open Lab أو NIS Elements أو ImageJ المتاحة مجانا (http://rsbweb.nih.gov/ij/).
  7. قم بتحديد سلوك السباحة عن طريق أداء الاستجابة التي يتم استثارتها باللمس في أجنة متعددة.
    1. يمكن تحقيق ذلك عن طريق حساب متوسط المسافة التي تستطيع الأجنة السباحة فيها خلال فترة زمنية محددة باستخدام برنامج أو مسطرة مترية لتحديد نقطتي البداية والنهاية لمباراة السباحة.
    2. تجنب اعتياد الأجنة على محفز اللمس بمرور الوقت عن طريق إجراء الفحص مع جنين جديد لكل تكرار تجريبي. تميل السلوكيات في النماذج الطافرة البرية والموثوقة إلى أن تكون قابلة للتكرار بدرجة كبيرة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يمكن استخدام الانكسار المزدوج كاختبار فعال وغير جراحي لتسليط الضوء على حالة التنظيم الليفي العضلي في أجنة سمك الزيبرفيش الحية. يتم عرض أمثلة على سمك الزيبرفيش من النوع البري، وكذلك أسماك زيبرفيش ذات تعبير جيني منخفض للجينات الضرورية لتطور العضلات الهيكلية ووظائفها. تُظهر أسماك الزيبرفيش من النوع البري عند عمر 5 dpf عضلات هيكلية ذات انكسار مزدوج عالٍ تحت الضوء المستقطب بسبب المصفوفة المنظمة للخيوط العضلية (Figures 2A-B). وفي المقابل، يُظهر جنين من نفس العمر متماثل الزيجوت لطفرة ممرضة في جين الدستروغليكان ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تصنف الاضطرابات العصبية العضلية الأولية تقليديا على أنها عمليات ضمور أو غير ضمورية. يتميز الحثل العضلي بتنكس الألياف العضلية متبوعا بجولات متكررة من التجديد ، مما يؤدي في النهاية إلى عملية المرحلة النهائية التي تجسدها التليف واستبدالها بالأنسجة الدهنية14. على النقيض من ذلك ، لا ترتبط الاعتلالات العضلية غير الضمورية بالنخر أو التغيرات المتجددة ، ولكنها تؤدي إلى الألياف العضلية غير المنظمة وضعف عضلات الهيكل العظمي بشكل عام.

ظهرت نماذج أسماك الزرد في السنوات الأخيرة كمورد ذو قيمة هائلة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لم يتم الإعلان عن تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

نشكر بهزاد مقدم زاده على مساعدته الرائعة في القياس الكمي للصور الانكسارية. تم تمويل هذا العمل من قبل جمعية الحثل العضلي بالولايات المتحدة الأمريكية (MDA201302) والمعهد الوطني لالتهاب المفاصل وأمراض العضلات والعظام والجلد (R01 AR044345) ، بالإضافة إلى دعم سخي من A Foundation Building Strength و Cure CMD ومؤسسة AUism الخيرية. يتم دعم VAG من قبل K01 AR062601 من المعهد الوطني لالتهاب المفاصل وأمراض العضلات والعظام والجلد ، ويتم دعم LLS بواسطة F31 NS081928 من المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أطباق Tricaine SigmaA5040
PetriFischer Scientific0875711Z
ملقطFischer Scientific100189-588
دبوس حشراتفيشر ScientificS67375
عدسات مستقطبةكاميرا ريتزQuantaray Tristar Optics C-PL 72mm
حاضنةفيشر حاضنة Isotemp العلميةموديل 630D
مجهرنيكون إنسترومنتس: Inc.SMZ 1500
Diagnostic Instruments Inc.التصوير SPOT RT3
Diagnostic Instruments Inc.SPOT 5.1 متقدم
Camera برنامج

المراجع

  1. Bassett, D. I., Bryson-Richardson, R. J., Daggett, D. F., Gautier, P., Keenan, D. G., Currie, P. D. Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo. Development. 130, 5851-5860 (2003).
  2. Gupta, V., et al. The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies. Hum. Mol. Genet. 20 (9), 1712-1725 (2011).
  3. Hall, T. E., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin α2-deficient congenital muscular dystrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (17), 7092-7097 (2007).
  4. Dowling, J. J., et al. Loss of myotubularin function results in T-tubule disorganization in zebrafish and human myotubular myopathy. PLoS Genet. 5 (2), e1000372(2009).
  5. Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. Neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation. Dis. Model Mech. 5 (3), 389-396 (2012).
  6. Ferrante, M. I., Kiff, R. M., Goulding, D. A., Stemple, D. L. Troponin T is essential for sarcomere assembly in zebrafish skeletal muscle. J. Cell Sci. 124 (4), 565-577 (2011).
  7. Hawkins, T. A., et al. The ATPase-dependent chaperoning activity of Hsp90a regulates thick filament formation and integration during skeletal muscle myofibrillogenesis. Development. 135 (6), 1147-1156 (2008).
  8. Barbazuk, W. B., et al. The syntenic relationship of the zebrafish and human genomes. Genome Res. 10 (9), 1351-1358 (2000).
  9. Schapira, G., Dreyfus, J. C., Joly, M. Changes in the flow birefringence of myosin as a result of muscular atrophy. Nature. 170 (4325), 494-495 (1952).
  10. Kimmel, C. B., Patterson, J., Kimmel, R. O. The development and behavioral characteristics of the startle response in zebrafish. Dev. Psychobiol. 7, 47-60 (1974).
  11. Eaton, R. C., Bombardieri, R. A., Meyer, D. L. The Mauthner-initiated startle response in teleost fish. J. Exp. Biol. 66, 65-81 (1977).
  12. Saint-Amant, L., Drapeau, P. Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo. J. Neurobiol. 37 (4), 622-632 (1998).
  13. Hirata, H., et al. Zebrafish relatively relaxed mutants have a ryanodine receptor defect, show slow swimming and provide a model of multi-minicore disease. Development. 134 (15), 2771-2781 (2007).
  14. Wallace, G. Q., McNally, E. M. Mechanisms of muscle degeneration, regeneration, and repair in the muscular dystrophies. Annu. Rev. Physiol. 71, 37-57 (2009).
  15. Granato, M., et al. Genes controlling and mediating locomotion behavior of the zebrafish embryo and larva. Development. 123, 399-413 (1996).
  16. Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish. Biochem. Biophys. Res. Commun. 423 (4), 785-788 (2012).
  17. Low, S. E., et al. TRPM7 is required within zebrafish sensory neurons for the activation of touch-evoked escape behaviors. J. Neurosci. 31 (32), 11633-11644 (2011).
  18. Liu, D. W., Westerfield, M. Function of identified motoneurones and co-ordination of primary and secondary motor systems during zebrafish swimming. J. Physiol. 403, 73-89 (1988).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة