مقالة منهجية

التحليل الكمي وتوصيف آفات تصلب الشرايين في الجيوب الأنفية الأبهرية الفئرانية

DOI:

10.3791/50933

⸱

ديسمبر 7, 2013

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Biomedical Sciences, McMaster University, 2Thrombosis and Atherosclerosis Research Institute, McMaster University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نصف إجراءات تحديد وتوصيف آفات تصلب الشرايين في نماذج الفئران باستخدام التقسيم الدقيق للجيب الأبهري والشريان الأورطي الصاعد جنبا إلى جنب مع التحليل الكيميائي النسيجي والكيميائي المناعي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصلب الشرايين هو مرض يصيب الشرايين الكبيرة وسبب رئيسي أساسي لاحتشاء عضلة القلب والسكتة الدماغية. تم تطوير العديد من نماذج الفئران المختلفة لتسهيل دراسة الفيزيولوجيا المرضية الجزيئية والخلوية لهذا المرض. في هذه المخطوطة ، نصف تقنيات محددة لقياس وتوصيف آفات تصلب الشرايين في الجيوب الأنفية الأبهرية الفئرانية والشريان الأورطي الصاعد. تتمثل ميزة هذا الإجراء في أنه يوفر قياسا دقيقا لمساحة المقطع العرضي والحجم الكلي للآفة ، والذي يمكن استخدامه لمقارنة تطور تصلب الشرايين عبر مجموعات العلاج المختلفة. هذا ممكن من خلال استخدام وريقات الصمام كمعلم تشريحي ، جنبا إلى جنب مع الضبط الدقيق لزاوية التقسيم. نصف أيضا طرق التلوين الأساسية التي يمكن استخدامها للبدء في توصيف تطور تصلب الشرايين. يمكن تعديلها بشكل أكبر للتحقيق في المستضدات ذات الأهمية الخاصة للباحث. التقنيات الموصوفة قابلة للتطبيق بشكل عام على مجموعة متنوعة من النماذج الغذائية الحالية والمنشأة وراثيا لتكوين الشرايين.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في العقدين الماضيين ، أدى تطوير واستخدام نماذج الفئران المعرضة لتصلب الشرايين من خلال التلاعب الغذائي و / أو الجيني إلى زيادة فهمنا بشكل كبير للآليات الجزيئية والخلوية المشاركة في تطور آفة تصلب الشرايين1-3. يأتي قدر كبير من معرفتنا وفهمنا لتكوين الشرايين من الدراسات التي أجريت في صميم البروتين الشحمي (Apo) -E ناقص < span style = "حجم الخط: 12 بكسل ؛ ارتفاع الخط: 28 بكسل ؛ ">4 الفئران ، حيث تتطور آفات تصلب الشرايين تلقائيا ومستقبلات البروتين الدهني منخفض الكثافة (LDLR) - نقص5 الفئران ، حيث يتم تحفيز تصلب الشرايين على اتباع النظام الغذائي. من المزايا المهمة لهذه النماذج أنها تسمح بدراسة أعداد كبيرة نسبيا من المحددة وراثيا في ظل ظروف غذائية وبيئية خاضعة للرقابة. بالإضافة إلى ذلك ، يبدو أن آفات تصلب الشرايين المتقدمة التي تتطور في بعض سلالات الفئران هذه تشبه إلى حد بعيد تلك التي لوحظت في البشر ، حيث تحتوي على نوى نخرية مملوءة بالدهون وقبعات ليفية. يتطور تصلب الشرايين بسرعة في نماذج الفئران هذه مما يجعل من الممكن جدا دراسة تطور الآفة ، من الخط الدهني إلى البلاك المتقدم ، على مدى أسابيع. علاوة على ذلك ، ثبت أن عوامل الخطر المعروفة لأمراض القلب والأوعية الدموية لدى البشر ، بما في ذلك مرض السكري6 ، وعسر شحمياتالدم 7 ، والسمنة8 ، وارتفاع ضغط الدم9 ، ودخان السجائر10 ، والبيئة المستقرة11 ، تسرع تطور الآفة.

في معظم نماذج الفئران المعرضة لتصلب الشرايين ، إن لم يكن جميعها ، يمكن اكتشاف تطور الآفة أولا في الجيوب الأبهري. يعتمد وقت البداية على سلالة الفأر والنظام الغذائي. مع زيادة حجم الآفات ، فإنها تميل إلى النمو في الشريان الأورطي الصاعد. في الفئران ApoE- /- و LDLR-/- ، يمكن الكشف عن تطور الآفة اللاحق في تشعبات الأبهر في قوس الأبهر ، في الشريان الأورطي الهابط وفي الشرايين الكبيرة الأخرى12-14. أنشأت الدكتورة بيفرلي بايجن وزملاؤها ، بالإضافة إلى تطوير بعض النماذج المبكرة لتصلب الشرايين الناجم عن النظام الغذائي ، اختبارا لقياس آفات تصلب الشرايين في الجيوب الأنفية الأبهرية التي أصبحت معيارا لقياس الآفة في نماذجالفئران 15. على مر السنين تم تحسين هذه التقنية ووصفها بالتفصيل16. نقدم هنا نسخة معدلة من "طريقة Paigen" لقياس وتوصيف آفات تصلب الشرايين في الفأر. يسهل تحليل المقاطع العرضية الأبهرية التسلسلية من منطقة وعائية معينة وفي اتجاه محدد وثابت جمع البيانات بدقة ويسمح بالكشف الدقيق عن الاختلافات في تطور الآفة في مجموعات العلاج المختلفة. تعتمد الأساليب المعروضة هنا على التقنيات السابقة. على وجه التحديد ، نصف كيف يمكن توصيف الآفة من حيث المساحة والحجم والمحتوى النخر والخلوي من خلال فحص الأقسام التسلسلية باستخدام مزيج من الكيمياء النسيجية والكيمياء المناعية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وافق مجلس أخلاقيات أبحاث بجامعة ماكماستر مسبقا على جميع الإجراءات الموضحة هنا.

< ص الفئة = "jove_title" >1. حصاد القلب والشريان الأورطي

  1. قم بتخدير الفأر وافتح تجويف الصدر بعناية للكشف عن القلب والشريان الأورطي القريب.
    1. استخرج الدم من الفأر عن طريق علامات الترقيم المباشرة للبطين الأيمن للقلب.
      ملاحظة: يمكن تخزين الدم واستخدامه لتحليل دهون البلازما والعوامل الأخرى المنقولة بالدم.
  2. القتل الرحيم للفأر عن طريق خلع عنق الرحم.
  3. اشطف الأوعية الدموية ب 5 مل من المحلول الملحي.
    ملاحظة: يتم تحقيق ذلك عن طريق التروية بالجاذبية من خلال ثقب إبرة في البطين الأيسر. للسماح بالتصريف ، يتم إجراء شق صغير في الأذين الأيمن. بعد شطف الأوعية الدموية ، يمكن جمع عينات من أنسجة الكبد والعضلات والأنسجة الدهنية ، وتجميدها في النيتروجين السائل ، وتخزينها في -80 درجة مئوية لتحليلها في المستقبل.
  4. يتم تثبيت الأوعية الدموية عن طريق نضح الجاذبية في البطين الأيسر مع 10٪ فورمالين محايد.
    ملاحظة: بمجرد بدء التروية ، يتم ضبط تدفق الفورمالين المحايد بنسبة 10٪ إلى تنقيط بطيء بحيث تستغرق العملية 1-2 دقيقة. يمكن استخدام الأعضاء والأنسجة التي تم إصلاح التروية لدراسة التعبير عن البروتين من خلال التألق المناعي أو الكيمياء النسيجية ، ولكن لا يمكن استخدامها بشكل عام كعينات للنشاف الغربي أو لدراسة التعبير الجيني.
  5. استخرج القلب بعناية وحوالي 2 مم من الشريان الأورطي القريب من الذبيحة. يمكن جمع الأنسجة الأخرى بما في ذلك الشريان الأورطي الهابط وتخزينها لتحليلها لاحقا.
    ملاحظة: يمكن أيضا استخدام الشريان الأورطي الهابط (إلى التشعب الحرقفي) لفحص تصلب الشرايين.
  6. قم بعمل قطع عرضي بمشرط على القلب الذي تمت إزالته بطريقة عمودية على الشريان الأورطي الصاعد.
    ملاحظة: يتم تسهيل ذلك من خلال استخدام مجهر تشريح ويمكن القيام به بشكل فعال عن طريق القطع على طول خط مستقيم يربط الأطراف السفلية للأذينين الأيمن والأيسر (الشكل 1).
  7. قم بتخزين الجزء القمي (العلوي) من القلب في شريط تضمين واغمره في الفورمالين المحايد المخزن المؤقت للمعالجة.
< p class = "jove_title" >2. تحضير الشريان الأورطي

  1. ضع الكاسيت مع الأنسجة المقطوعة في معالج الأنسجة.
  2. عينات الأنسجة المعالجة.
    ملاحظة: بشكل عام ، تتم برمجة معالجات الأنسجة للعمل بين عشية وضحاها بسبب طول العملية والحلول التي تنطوي عليها هذه العملية. تتم معالجة العينات وفقا لبروتوكول معمول به:
    1. 10٪ فورمالين محايد مخزن لمدة 1 ساعة عند 42 درجة مئوية.
    2. 10٪ فورمالين محايد مخزن لمدة 1 ساعة عند 42 درجة مئوية.
    3. 70٪ إيثانول لمدة 30 دقيقة عند 40 درجة مئوية.
    4. 85٪ إيثانول لمدة 30 دقيقة عند 40 درجة مئوية.
    5. 100٪ إيثانول لمدة 45 دقيقة عند 40 درجة مئوية.
    6. 100٪ إيثانول لمدة 45 دقيقة عند 40 درجة مئوية.
    7. 100٪ إيثانول لمدة 45 دقيقة عند 40 درجة مئوية.
    8. الزيلين لمدة 1 ساعة عند 40 درجة مئوية.
    9. الزيلين لمدة 1 ساعة عند 40 درجة مئوية.
    10. الزيلين لمدة 1 ساعة عند 40 درجة مئوية.
    11. شمع البارافين لمدة 45 دقيقة عند 63 درجة مئوية.
    12. شمع البارافين لمدة 45 دقيقة عند 63 درجة مئوية.
    13. شمع البارافين لمدة 45 دقيقة عند 63 درجة مئوية.
    14. شمع البارافين لمدة 45 دقيقة عند 63 درجة مئوية.
  3. قم بإذابة شمع البارافين طوال الليل عند 62 درجة مئوية (الأشكال 1D-E). قم بتقدير الكمية الإجمالية لشمع البارافين المراد استخدامه على أساس جرامات شمع البارافين اللازمة لملء قالب الأنسجة وعدد الكتل المراد تحضيرها.
    ملاحظة: يفضل استخدام قالب الأنسجة العميق على القالب الضحل لأنه يوفر زاوية دوران محتملة أوسع عند التقسيم. يتطلب قالب الأنسجة العميق الواحد 11 جم من شمع البارافين.
  4. ضع كل نسيج معالج في قالب نسيجي عميق ثم اسكب شمع البارافين المذاب لملء القالب بالكامل (الشكل 1F). قم بتغطية القالب بشريط بلاستيكي مكتوب عليه (الشكل 1G).
  5. قم بتبريد القالب المملوء على الجليد ، أو على سطح بارد (الشكل 1H) ، من أجل إنشاء الكتلة الصلبة وفصل الكتلة عن القالب (الأشكال 1I-J).
    ملاحظة: عند وضع القلب المقطوع في القالب ، تأكد من أن الوجه الداخلي للقلب يلامس قاعدة القالب ، ثم تابع ملء الكتلة بالبارافين المذاب. يغطي الكاسيت البلاستيكي المسمى القالب قبل أن يتجمد من أجل توفير قاعدة للتعامل مع الكتلة. بمجرد أن يبرد ، تتم إزالة القالب ويمكن تخزين كتل البارافين إلى أجل غير مسمى في درجة حرارة الغرفة.

3. تقسيم الشريان الأورطي

  1. ضع الكتلة مع القلب في حامل عينة الميكروتوم بحيث يمكن تقسيمها من الداخل باتجاه الجزء العلوي من القلب (الشكل 2)
  2. اضبط الميكروتوم لقطع سمك قسم يبلغ 10 ميكرومتر وانتقل إلى قسم القلب.
  3. اجمع الأقسام على شريحة زجاجية وفحصها تحت المجهر الضوئي لتحديد الموضع والاتجاه.
  4. عندما يصبح 1 أو 2 صمامات من الجيوب الأنفية الأبهرية واضحة ، اضبط زاوية الكتلة حسب الضرورة (الشكل 3 أ).
    ملاحظة: يجب أن يظهر الجيوب الأنفية على شكل ثلاث قواعد صمام ثنائية الأجزاء مع وريقات متصلة. إذا لوحظت نشرة صمام واحدة أو اثنتين فقط ، فيجب تعديل زاوية القطع وفقا لذلك.
  5. اضبط الميكروتوم للقطع عند 4-5 ميكرومتر واجمع الأقسام على شرائح زجاجية مطلية.
    ملاحظة: على الرغم من أن الإجراء يمكن أن يكون متنوعا ، يوصى باتباع نهج منهجي ، يتم من خلاله جمع الأقسام العشرة الأولى ، من الجيوب الأبهرية التي تتقدم إلى أعلى الشريان الأورطي الصاعد ، على الجزء العلوي من الشرائح الزجاجية المسماة (الشرائح المسماة 1-10). يتم جمع الأقسام اللاحقة باتباع نفس النمط: # 11-20 ، # 21-30 ، # 31-40 حتى يتم ملاحظة آفات تصلب الشرايين (الشكل 3 ب). بهذه الطريقة يمكن فحص آفات تصلب الشرايين وتمييزها في مواقع محددة على طول الشريان الأورطي الصاعد. على سبيل المثال، تحتوي الشريحة 1 على الأقسام 1 و11 و21 و31 و41 و51، والتي تمثل آفات تصلب الشرايين من الجيوب الأبهرية إلى أعلى الشريان الأورطي الصاعد. يمكن تضمين شرائح إضافية ، تحمل علامة 11-20 ، إذا كانت الآفة كبيرة ، لجمع المزيد من الأقسام البعيدة التي تتبع نفس النمط.
  6. استمر في جمع الأقسام حتى لا تلاحظ آفة تصلب الشرايين.
    ملاحظة: يمكن تخزين الشرائح في درجة حرارة الغرفة لعدة أشهر ، قبل إجراء مزيد من التحليل.
< p class = "jove_title" >4. تلطيخ وقياس آفات تصلب الشرايين

يمكن تحليل آفات تصلب الشرايين بعدة طرق مختلفة باستخدام مجموعة متنوعة من التقنيات. يتضمن التحليل الأساسي تحديد مساحة المقطع العرضي للآفة. من أجل مقارنة منطقة الآفة بدقة ، من المهم أن تكون نقطة البداية لقياس الآفة متسقة من عينة إلى أخرى. يتم تسهيل ذلك باستخدام وريقات الصمام للتوجيه. لتسهيل التحديد الدقيق وتحديد منطقة الآفة ، يتم تلطيخ المقاطع العرضية المختارة بالهيماتوكسيلين واليوزين. يتضمن ذلك غمر الشرائح في سلسلة من الحلول لأوقات محددة ، والتي ستؤدي إلى إزالة / تلطيخ الأنسجة.

بروتوكول تلطيخ الهيماتوكسيلين واليوزين:

  1. ضع الشرائح في مجفف الهواء لمدة 8 دقائق ثم قم بإزالة الأجزاء عن طريق غسل 4× في الزيلين لمدة 3 دقائق لكل غسلة.
  2. اغسل الشرائح في 100٪ إيثانول 3× لمدة 3 دقائق لكل منها.
  3. اغسل 3× في 70٪ إيثانول لمدة 3 دقائق لكل منها ثم 2× في 50٪ إيثانول لمدة 3 دقائق لكل منهما.
  4. اشطفها بالماء المقطر ثم اغمرها في هيماتوكسيلين ماير لمدة 15 دقيقة.
  5. اغسلها بماء الصنبور الجاري لمدة 5 دقائق ثم اغسلها بالماء المقطر لمدة 5 دقائق.
  6. انغمس في Eosin Y لمدة 1-5 دقائق.
  7. يغسل في الماء المقطر 3× لمدة 5 دقائق لكل منهما ، ويغسل في 50٪ إيثانول 2× لمدة دقيقتين لكل منهما ، ثم 70٪ إيثانول 3× لمدة دقيقتين لكل منهما.
  8. اغسل في 100٪ إيثانول 3× لمدة دقيقتين لكل منهما ثم اغسلها في الزيلين 4× لمدة دقيقتين لكل منهما.
  9. قم بتركيب الأقسام باستخدام وسيط التثبيت القائم على الزيلين والتقط الصور باستخدام كاميرا رقمية مثبتة على مجهر ضوئي.
  10. تحديد منطقة الآفة وتحديدها باستخدام برنامج التصوير.
    ملاحظة: يمكن تحديد منطقة الآفة على مسافات محددة من الجيوب الأنفية الأبهرية على فترات 40-50 ميكرومتر (حسب سمك كل قسم). تعطي مخططة لقياسات المنطقة هذه مقابل المسافة لمحة عن آفة تصلب الشرايين (الشكل 4). تمثل المنطقة الموجودة أسفل المنحنى تقديرا للحجم الكلي لآفة تصلب الشرايين. يمكن أن يشمل التوصيف الإضافي للآفة تحديد المنطقة النخرية. يتكون اللب النخر (nc) لآفة متقدمة من خلايا رغوية موت المبرمج. مع الممارسة ، يمكن تحديد ذلك من خلال فحص المناطق اللاخلوية في الأقسام الملطخة بالهيماتوكسيلين واليوزين (الشكل 4 أ). تميل الآفات المبكرة إلى أن يكون لها نخر قليل جدا بينما تزيد الآفات الأكثر تقدما من المناطق النخرية التي قد تساهم في عدم استقرار البلاك. يجب فحص المقاطع التسلسلية لنفس الشريان الأورطي لتأكيد وجود منطقة نخرية
< p class = "jove_title" >5. مزيد من التوصيف لآفة تصلب الشرايين

يمكن تحديد التفاصيل المحددة المتعلقة بمرحلة تطور تصلب الشرايين عن طريق تلطيخ الأجسام المضادة الموجهة ضد أنواع أو علامات معينة من الخلايا. الكيمياء النسيجية المناعية على أقسام البارافين هي تقنية قياسية تستخدم لتحديد أنواع أو علامات معينة من الخلايا في سياق الأنسجة المحيطة غير الملطخة. يتم الكشف عن المستضد بشكل عام باستخدام ركيزة بيروكسيداز الفجل.

يتضمن تلوين التألق المناعي استخدام الأجسام المضادة المترافقة بالفلوروفور ويتطلب مجهرا مضنوعا ومرشحات مناسبة للكشف. تسمح هذه التقنية بالتلوين المتزامن لمستضدين (أو أكثر).

< p class = "jove_step" > البروتوكول العام للتلوين الكيميائي المناعي:

  1. ضع الشرائح في مجفف الهواء لمدة 8 دقائق.
  2. قم بإزالة الأقسام في 4 تغييرات من الزيلين ، 3 دقائق لكل منهما.
  3. يغسل في 100٪ إيثانول 3× لمدة 3 دقائق لكل منهما لإزالة الزيلين.
  4. اغسل 3× في 70٪ إيثانول لمدة 3 دقائق لكل منها ، ثم 2× في 50٪ إيثانول لمدة 3 دقائق لكل منهما.
  5. يغسل في الماء المقطر لمدة 5 دقائق لكل منهما ثم يغسل 3× في PBS لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  6. إجراء استرجاع المستضد. يمكن تحقيق ذلك باستخدام طريقة استرجاع الحاتمة المستحثة بالحرارة (HIER) في قدر ضغط الميكروويف ومحلول استرجاع المستضد (10 ملي مولار عازلة سترات ، درجة الحموضة 6.0).
    ملاحظة: قد تخفي عملية تثبيت الفورمالين المستضدات ذات الأهمية. من واقع خبرتنا ، يحسن HIER أداء بعض الأجسام المضادة بشكل كبير ، ولكنه ليس مطلوبا للآخرين. بالإضافة إلى ذلك ، هناك بدائل أخرى متاحة لطريقة HIER لاسترجاع المستضد.
  7. عندما يبرد قدر الضغط ، ضع الشرائح في PBS لمدة 15 دقيقة.
  8. احتضان الأقسام في المصل العادي (من نفس النوع الذي اشتق منه الجسم المضاد الثانوي) لمدة 30 دقيقة.
  9. احتضان بالجسم المضاد الأولي المخفف في مصل الحجب العادي لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  10. يغسل باستخدام PBS 3× لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  11. احتضان الأقسام بالجسم المضاد الثانوي البيوتينيل الذي تم تخفيفه في PBS لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
  12. احتضن الشرائح بالفجل الحار بيروكسيداز ستربتافيدين لمدة 30 دقيقة ثم اغسلها باستخدام PBS 3× لمدة 5 دقائق لكل منها.
  13. تفاعل كروموجينيك- احتضان الشرائح في DAB الطازج (3،3'-diaminobenzidine) لمدة 5-30 دقيقة. يجب مراقبة هذا التفاعل باستخدام المجهر. أوقف رد الفعل عن طريق غسل الشرائح في ماء الصنبور.
  14. مضاد للبقع باستخدام الهيماتوكسيلين لمدة 1 دقيقة ، يغسل بماء الصنبور لمدة 5 دقائق ثم يغسل بالماء المقطر 3× لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  15. كرر الخطوات 4.7-4.9 لتركيب الشرائح.
< p class = "jove_title" >6. البروتوكول العام لتلوين التألق المناعي

يمكن اتباع بروتوكول مماثل ، مع تغييرات طفيفة ، لتلوين التألق المناعي.

  1. ضع الشرائح في مجفف الهواء لمدة 8 دقائق ثم قم بإزالة الأقسام في 4 تغييرات من الزيلين ، 3 دقائق لكل منها.
  2. يغسل في 100٪ إيثانول 3× لمدة 3 دقائق لكل منهما لإزالة الزيلين.
  3. اغسل 3× في 70٪ إيثانول لمدة 3 دقائق لكل منها ، ثم 2× في 50٪ إيثانول لمدة 3 دقائق لكل منهما.
  4. يغسل في الماء المقطر لمدة 5 دقائق لكل منهما ثم يغسل في PBS 3× لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  5. إجراء استرجاع المستضد. يمكن تحقيق ذلك باستخدام طريقة استرجاع الحاتمة المستحثة بالحرارة (HIER) في قدر ضغط الميكروويف ومحلول استرجاع المستضد (10 ملي مولار عازلة سترات ، درجة الحموضة 6.0).
    ملاحظة: قد تخفي عملية تثبيت الفورمالين المستضدات ذات الأهمية. من واقع خبرتنا ، يحسن HIER أداء بعض الأجسام المضادة بشكل كبير ، ولكنه ليس مطلوبا للآخرين. بالإضافة إلى ذلك ، هناك بدائل أخرى متاحة لطريقة HIER لاسترجاع المستضد.
  6. عندما يبرد قدر الضغط ، ضع الشرائح في PBS لمدة 15 دقيقة.
  7. احتضان الأقسام في المصل العادي (من نفس النوع الذي اشتق منه الجسم المضاد الثانوي) لمدة 30 دقيقة.
  8. احتضان بالجسم المضاد الأولي المخفف في مصل الحجب العادي لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  9. يغسل باستخدام PBS 3× لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  10. أضف الجسم المضاد الثانوي المترافق بالفلوروفور المخفف في مصل الحجب العادي (أو PBS). احتضن لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  11. يغسل باستخدام PBS 3× لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  12. وصمة عار مضادة مع DAPI.
  13. يغسل في PBS 3× لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  14. ضع غطاء باستخدام وسائط التثبيت المضادة للبهتان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content" > تم تغذية الفئران LDLR البالغة من العمر خمسة أسابيع بنظام غذائي قياسي أو نظام غذائي غني بالدهون لمدة عشرة أسابيع. تم التضحية بالفئران وتزيينها بالفورمالين كما هو موضح أعلاه. تم تحضير المقاطع العرضية للجيوب الأبهرية وتلطيخها بالهيماتوكسيلين واليوزين لتحديد مساحة الآفة وحجمها (الشكل 4). عندما تتغذى الفئران على نظام غذائي قياسي ، يكون تطور تصلب الشرايين محدودا للغاية وقد لا يمكن اكتشافه في عمر 15 أسبوعا. يعمل النظام الغذائي عالي الدهون على تسريع تكوين الشرايين بشكل كبير في هذا النموذج ويحفز تكوين آ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصلب الشرايين هو مرض مزمن معقد يصيب الشرايين العضلية الكبيرة وهو سبب رئيسي لاحتشاء عضلة القلب والسكتة الدماغية. يتضمن تطور المرض تفاعل العديد من أنواع الخلايا المختلفة داخل جدار الشريان ، مع خلايا الدم المنتشرة وجزيئات البروتين الدهني والعوامل الأخرى المنقولة بالدم والتي بدأنا للتو في فهمها. جاء الكثير من معرفتنا الحالية فيما يتعلق بتطور وتطور تصلب الشرايين من الدراسات التي أجريت في أنظمة نماذج الفئران المعرضة لتصلب الشرايين المصممة خصيصا.

من المهم أن تتذكر أن نماذج الفئران لتصلب الشرايين لها ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذا البحث من خلال منحة تشغيلية من المعاهد الكندية للعلوم الصحية والجمعية الكندية للسكري. يتم دعم DEV من خلال منحة دراسية من اللجنة الوطنية للأبحاث العلمية والتقنية (CONICYT ، تشيلي).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الفئران التي تعاني من نقص LDLR ( D2.129S7 (B6) -Ldlrtm1Her / J)مخزون مختبر جاكسون# 002207
قوالب الأنسجة FormalinSigma-AldrichHT5011
Ted Pella Inc27195
ParaffinParamat19286-10
الشرائح المطليةفيشر12-550-15
حاويات المذيباتTissue Tek II4457
MicrotomeLeicaRM22S5
حمام مائيVWR80086-982
مجهرأوليمبوسBX41TF
كاميراأوليمبوسDP72
ImageJالمعاهد الوطنية للصحةwww.rsbweb.nih.gov/ij/
معالجساكورا فينيتيكVIP6-A1
أشرطة المعالجةVWR18000-134
Preassure طباخNordic Ware
CoverslipFisher12-545-M
PBSSigma-AldrichP3813
Microtomeشفرة Thermo Scientific30-518-35
مضاد للتلاشي تصاعد متوسطSigma-AldrichF-4680
تركيب الزيلين متوسط سيجما ألدريتش44581
التركيب المائي متوسطسيجما ألدريتشI1161
Mac-3 والجسمBD Pharmingen553322
DAPIسيجما ألدريتشD9542
F4 / 80 الجسم المضادAbcamAb6640
ألفا أكتين الأجسام المضادةسانتا كروز التكنولوجيا الحيويةSC-32251
ماير’ s هيماتوكسيلينسيجما ألدريتشE4382
إيوسين Yسيجما ألدريتشMHS16
DAB (3،3 '-ديامينوبنزيدين)داكوK3468

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zadelaar, S., Kleemann, R., et al. Mouse models for atherosclerosis and pharmaceutical modifiers. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 27 (8), 1706-1721 (2007).
  2. Daugherty, A., Rateri, D. L. Development of experimental designs for atherosclerosis studies in mice. Methods. 36, 129-138 (2005).
  3. Getz, G. S., Reardon, C. A. Diet and murine atherosclerosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 26 (2), 242-249 (2006).
  4. Zhang, S. H., Reddick, R. L., et al. Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E. Science. 258 (5081), 468-471 (1992).
  5. Ishibashi, S., Goldstein, J. L., et al. Massive xanthomatosis and atherosclerosis in cholesterol-fed low density lipoprotein receptor-negative mice. J. Clin. Invest. 93 (5), 1885-1893 (1994).
  6. Kunjathoor, V. V., Wilson, D. L., LeBoeuf, R. C. Increased atherosclerosis in streptozotocin-induced diabetic mice. J. Clin. Invest. 97 (7), 1767-1773 (1996).
  7. Hartvigsen, K., Binder, C. J., et al. A diet-induced hypercholesterolemic murine model to study atherogenesis without obesity and metabolic syndrome. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 27 (4), 878-885 (2007).
  8. King, V. L., Hatch, N. W., et al. A murine model of obesity with accelerated atherosclerosis. Obesity. 18 (1), 35-41 (2004).
  9. Taylor Weiss, D. &, R, W. Deoxycorticosterone acetate salt hypertension in apolipoprotein E-/- mice results in accelerated atherosclerosis: the role of angiotensin II. Hypertension. 51 (2), 218-224 (2008).
  10. Gairola, C. G., Drawdy, M. L., et al. Sidestream cigarette smoke accelerates atherogenesis in apolipoprotein E-/- mice. Atherosclerosis. 156 (1), 49-55 (2001).
  11. Pynn, M., Schäfer, K., et al. Exercise training reduces neointimal growth and stabilizes vascular lesions developing after injury in apolipoprotein e-deficient mice. Circulation. 109 (3), 386-392 (2004).
  12. Nakashima, Y., Plump, A. S., et al. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arterioscler. Thromb. 14 (1), 133-140 (1994).
  13. Reddick, R. L., Zhang, S. H., Maeda, N. Atherosclerosis in mice lacking apo E. Evaluation of lesional development and progression. Arterioscler. Thromb. 14 (1), 141-147 (1994).
  14. Tangirala, R. K., Rubin, E. M., Palinski, W. Quantitation of atherosclerosis in murine models: correlation between lesions in the aortic origin and in the entire aorta, and differences in the extent of lesions between sexes in LDL receptor-deficient and apolipoprotein E-deficient mice. J. Lipid Res. 36 (11), 2320-2328 (1995).
  15. Paigen, B., Morrow, A., et al. Quantitative assessment of atherosclerotic lesions in mice. Atherosclerosis. 68 (3), 231-240 (1987).
  16. Baglione, J., Smith, J. D. Quantitative Assay for Mouse Atherosclerosis in the Aortic Root. Methods in Molecular Medicine. 129, (2006).
  17. Lee, T. Y., Muschal, S., et al. Angiostatin regulates the expression of antiangiogenic and proapoptotic pathways via targeted inhibition of mitochondrial proteins. Blood. 114 (9), 1987-1998 (2009).
  18. Ballon, G., Chen, K., et al. Kaposi sarcoma herpesvirus (KSHV) vFLIP oncoprotein induces B cell transdifferentiation and tumorigenesis in mice. J. Clin. Invest. 121 (3), 1141-1153 (2011).
  19. Khallou-Laschet, J., Varthaman, A., et al. Macrophage plasticity in experimental atherosclerosis. PLoS One. 5 (1), e8852(2010).
  20. Rotzius, P., Thams, S., et al. Distinct infiltration of neutrophils in lesion shoulders in ApoE-/- mice. Am. J. Pathol. 177 (1), 493-500 (2010).
  21. Kanellakis, P., Agrotis, A., et al. High-mobility group box protein 1 neutralization reduces development of diet-induced atherosclerosis in apolipoprotein e-deficient mice. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31 (2), 313-319 (2011).
  22. Schwartz, C. J., Mitchell, J. R. Observations on localization of arterial plaques. Circ. Res. 11, 63-73 (1962).
  23. Won, D., Zhu, S. N., Chen, M., et al. Relative reduction of endothelial nitric-oxide synthase expression and transcription in atherosclerosis-prone regions of the mouse aorta and in an in vitro model of disturbed flow. Am. J. Pathol. 171 (5), 1691-1704 (2007).
  24. Rosenfeld, M. E., Polinsky, P., et al. Advanced atherosclerotic lesions in the innominate artery of the ApoE knockout mouse. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 20 (12), 2587-2592 (2000).
  25. McAteer, M. A., Schneider, J. E., et al. Quantification and 3Dreconstruction of atherosclerotic plaque components in apolipoprotein E knockout mice using ex vivo high-resolution MRI. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24 (12), 2384-2390 (2004).
  26. Martinez, H. G., Prajapati, S. I., et al. Images in cardiovascular medicine: Microscopiccomputedtomography-based virtual histology for visualization and morphometry of atherosclerosis in diabetic apolipoprotein e mutant mice. Circulation. 120 (9), 821-822 (2009).
  27. Kirkby, N. S., Low, L., et al. Quantitative 3-dimensional imaging of murine neointimal and atherosclerotic lesions by optical projection tomography. PLoS One. 6 (2), e16906(2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

LDLR

مقالات ذات صلة