إنشاء نماذج الإنسان من حاجز الدم في الدماغ (BBB) يمكن أن تستفيد من البحث في الظروف الدماغ المرتبطة فشل BBB. نحن هنا وصف تقنية محسنة لإعداد نموذج BBB الاتصال، والذي يسمح coculturing من الخلايا النجمية والخلايا البطانية الإنسان الدماغ على طرفي نقيض من غشاء يسهل اختراقها.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تحسين طريقة لإعداد القائم على الخليوي، الاتصال نموذج الإنسان من حاجز الدم في الدماغ
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وتضم حاجز الدم في الدماغ (BBB) الشعيرات الدموية في الدماغ ولكن غير منفذة للتكيف التي تتحكم بإحكام البيئة الدماغ. وقد ضمنا فشل BBB في مسببات العديد من الأمراض في الدماغ، وخلق الحاجة إلى تنمية الموارد البشرية في نماذج BBB المختبر للمساعدة في البحوث ذات الصلة سريريا. من بين العديد من النماذج BBB صفها حتى الآن، وهو ثابت (بدون تدفق)، اتصل BBB النموذج، حيث يتم cocultured الخلايا النجمية والخلايا البطانية الدماغ (BECS) على طرفي نقيض من غشاء يسهل اختراقها، برزت تبسيط النظام حتى الآن لمحاكاة أصيلة BBB مع قدرة إنتاجية عالية الفرز. مع ذلك الجيل من هذا القبيل نموذج تحديات التقنية قليلة. هنا، نحن تصف بروتوكول لإعداد BBB نموذج الاتصال البشري باستخدام تركيبة جديدة من BECS الإنسان الأولية والخلايا النجمية الإنسان خلد. على وجه التحديد، ونحن من التفصيل طريقة مبتكرة لخلية البذر على إدراج مقلوب وكذلك تحديد INSERتقنيات تلطيخ ر ومثالا كيف نستخدم نموذجنا للبحوث المتعلقة BBB-.
المقدمة
بي بي بي هي واجهة المتخصصة بين الدورة الدموية الطرفية والجهاز العصبي المركزي، والمسؤولة بشكل حاسم للحفاظ على الارقاء الدماغ. ويضم خلايا الدماغ متميزة البطانية الاوعية الدموية الدقيقة (BECS) والتي تتأثر وظيفيا من قبل عدد قليل من المكونات الخلوية وديكي (أدناه) لتشكيل بوابة ضيقة والحيوية في الدماغ. في ظل الظروف الفسيولوجية وBBB يقيد مرور خلايا الدم، مكونات البلازما والمواد الضارة، وكلها يمكن أن تكون أعصاب، إلى الدماغ. في موازاة ذلك، BBB يتبادل انتقائي الأيونات والمواد المغذية (الجلوكوز والأحماض الأمينية) الأساسية ومنتجات النفايات الأيضية بين الدماغ والدورة الدموية للحفاظ على البيئة بدقة 1،2 الدماغ. في السنوات الأخيرة هو....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. الثقافة الخلية (3-7 أيام قبل الجمعية BBB)
1.1. الأولية خلايا الدماغ البشري البطانية الاوعية الدموية الدقيقة (BECS)
تم الحصول عليها تجاريا BECS. تم إنتاج الخلايا عن طريق التفكك dispase من الأنسجة الطبيعية قشرة الدماغ البشري، وقدمت المجمدة في مرور 3 (<12 الأضعاف السكان).
- التحتية: السفن معطف الأنسجة الثقافة مع "عامل مرفق" وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
من أجل إنشاء الإنسان، نموذج الاتصال BBB كان علينا أن زراعة SVGs وBECS على الأغشية التي يسهل اختراقها مع 3 ميكرون مسام الحجم، كما هو موضح للسماح بمرور نجمية نهاية القدمين للاتصال مع الخلايا البطانية 14،15،27،28. ويتضح تمثيل التخطيطي للنموذج الاتصال كاملة في الشكل 1 (اليسار التوضيح). التحدي التقني الرئيسي الذي قدمه نظام الاتصال هو الحاجة إلى البذور النجمية ضد الجاذبية على سطح مجافي اللمعة من الغشاء. نجحنا في هذه المهمة من خلال خلق أساسا سيليكون قابلة للإز.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الأبحاث الطبية في أمراض الدماغ يعاني صعوبة كبيرة متعدية. في مجال السكتة الدماغية الحادة، على سبيل المثال، العديد من الأدوية التي أظهرت وعدا كبيرا في النماذج الحيوانية فشلت في العيادة 38،39. أسباب هذه النتائج المخيبة للآمال متنوعة وتشمل الخيانة من أنظمة الاختبار قبل السريرية لسيناريو السكتة الدماغية الإنسان والمبالغة في النتائج التي تم الحصول عليها من الدراسات على الحيوانات 21. استراتيجية واحدة لتحسين القيمة التنبؤية من النتائج قبل السريرية للمرحلة السريرية هو.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
وقد تم تمويل هذه الدراسة من المنح التي منحت لRLM من المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية في استراليا (منحة # 606658).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| شركة Cell Factor | Cell-Systems | Corporation 4Z0-210 | |
| الخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة في الدماغ (BECs) ، الابتدائية ، | شركة أنظمة الخلايا | ACBRI 376 | |
| شركة أنظمة الخلايا المتوسطة | الكاملة 4Z0-500 | مكملة ب CSC JetFuel | |
| كاملة خالية من المصل | متوسط Cell-Systems Corporation | SF-4Z0-500 | مكمل ب CSC RocketFue |
| DMEM / F-12 مع 15 ملي مولار HEPES | Life Technologies | 11330-032 | |
| مكمل نمو الخلايا البطانية (من أصل بقري) | Sigma-Aldrich | E2759-15MG | |
| أنابيب سيليكون خارجية | Watson-Marlow | 913.A080.016 | ماركة Pumpsil ، قطر داخلي 8 مم ، جدار 1.6 مم |
| مصل عجل الجنين | Lonza | 14-501F | |
| جنتاميسين كبريتات | الحياة تكنولوجيز | 15750-060 | |
| هيبارين الصوديوم | فايزر | 1,000 وحدة / مل | |
| هيكساميثيلديسيلازان (HMDS) | سيجما ألدريتش | H4875 | |
| الخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة في الدماغ البشري | شركة أنظمة الخلية | ACBRI 376 | |
| أنابيب السيليكون الداخلية | Watson-Marlow | 913.A032.016 | ماركة Pumpsil ، قطر داخلي 3.2 مم ، جدار 1.6 مم |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | |
| Mayer s محلول الهيماتوكسيلين | العنبر العلمي | MH | |
| الحد الأدنى من الوسط الأساسي مع إيرل s محلول ملح متوازن | مختبرات HyClone | SH30244.01 | |
| Penicillin / Streptomycin | Life Technologies | 15140 | |
| Rat collagen I | Trevigen | 3440-100-01 | Cultrex |
| brand Tissue Culture Inserts Corning | Life Sciences | 3472 | Transwell brand ، قطرها 6.5 مم ، مع غشاء مسامي بوليستر ، 3 & micro ؛ م حجم المسام |
المراجع
- Hawkins, B. T., Davis, T. P. The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease. Pharmacol. Rev. 57, 173-185 (2005).
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol. Dis. 3....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
