خلال السنوات الأخيرة، وقد استخدمت المقايسات القائم على الخلية الحية بنجاح للكشف عن الأجسام المضادة ضد المستضدات السطحية ومتعلق بتكوين جزئي. هنا، نحن تصف طريقة استخدام تدفق عالية الإنتاجية الخلوي تمكن من تحليل الأفواج الكبيرة من المرضى. وكشف عن الأجسام المضادة رواية تحسين تشخيص وعلاج اضطرابات مناعية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الإنتاجية العالية التدفق الخلوي القائم على الفحص لكشف خلية أضداد N-ميثيل مد اسبارتاتي مستقبلات الدوبامين-2 أو مستقبلات في مصل الإنسان
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
على مدى السنوات الأخيرة، تم الكشف عن الأجسام المضادة ضد سطح والبروتينات بتكوين تشارك في النقل العصبي في الجهاز العصبي المركزي أمراض المناعة الذاتية لدى الأطفال والبالغين. وقد استخدمت هذه الأجسام المضادة لتوجيه التشخيص والعلاج. المقايسات خلية مقرها تحسنت كشف عن الأجسام المضادة في مصل المريض. لأنها تستند إلى التعبير مستضدات سطح الدماغ على خلايا حقيقية النواة، والتي يتم بعد ذلك حضنت مع المريض الأمصال المخفف تليها الأجسام المضادة الثانوية تألقي مترافق. بعد الغسيل، الأجسام المضادة الثانوية ملزمة ثم يتم تحليلها من قبل التدفق الخلوي. وقد وضعت مجموعتنا تدفق عالية الإنتاجية الخلوي الحية فحص خلية مقرها لكشف موثوق أجسام مضادة ضد مستقبلات الناقل العصبي محددة. هذا الأسلوب التدفق الخلوي هو مستقيم إلى الأمام، الكمي وفعالة، واستخدام نظام العينات عالية الإنتاجية يسمح للأفواج كبيرة المريض أن يعاير بسهولة في فترة قصيرة من الزمن. بالإضافة إلى ذلك، استنادا الخلية هذا النحويقول يمكن تكييفها بسهولة للكشف عن الأجسام المضادة لكثير من الأهداف المستضدية مختلفة، سواء من الجهاز العصبي المركزي والمحيط. واكتشاف المؤشرات الحيوية إضافية رواية الضد تمكين تشخيص سريعة ودقيقة وتحسين علاج اضطرابات مناعية.
المقدمة
خلال السنوات الأخيرة، تم تحديد أشكال المناعة الذاتية من الجهاز العصبي المركزي (CNS) الأمراض. وقد تبين أن هذه الأمراض ترتبط ويعرف عن وجود الأجسام المضادة. هذه الأجسام المضادة لمستقبلات الخلايا العصبية ربط أو البروتينات متشابك المشاركة في العصبي 1،2. تم الكشف عن مستضدات مختلفة، مثل مستقبلات N-ميثيل مد اسبارتاتي (NMDAR) 3-5، γ-B حمض الغاما مستقبلات (GABA B) مستقبلات 6، α-أمينو 3 هيدروكسي-5-الميثيل-4- حمض isoxazolepropionic (أمبا) مستقبلات 7، الجهد بوابات قنوات البوتاسيوم (VGKC) المرتبطة البروتينات: يسين الغنية تنشيط دبقي 1 البروتين (LGL-1) ويرتبط البروتين contactin 2 (capsr2) ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. Subcloning استراتيجية لبناء pIRES2-EGFP ناقلات ترميز D2R أو NMDAR
- الحصول على كامل طول استنساخ [كدنا] من D2R الإنسان أو NMDAR الوحيدات 1 (NR1).
- اختيار ناقلات التعبير، مثل pIRES2-EGFP، الذي هو مناسبة للتعبير عن البروتينات عبر الغشاء مع تعزيز البروتين الفلوري الأخضر (GFP) تحت سيطرة مراسل موقع الريبوسوم دخول الداخلي (IRES)، مما يمكن كلا المستضدات وGFP أن coexpressed في الخلايا بشكل منفصل.
- Subclone كدنا] الإنسان داخل pIRES2-EGFP ناقلات.....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم الحصول على الخلايا الحية HEK293 D2R + وHEK293 CTL في تدفق عداد الكريات باستخدام عينات عالية الإنتاجية. خلال التحليل، وبوابات الخلايا استنادا مبعثر إلى الأمام (حجم) ومبعثر الجانب (تحبب) المعلمات (أرقام 1A و1D). أعرب خلايا HEK293 Transfected جزيء مراسل GFP، في السيتوبلازم، واستبعدت من التحليل خلايا untransfected (أرقام 1B و1E). داخل GFP + البوابة، تم قياس مؤسسات التمويل الأصغر المرتبطة AF647 مترافق المضادة للمفتش .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وتصف هذه الورقة تطبيق الرواية من التدفق الخلوي الحية فحص خلية مقرها لكشف الأجسام المضادة التي تستهدف بروتينات معينة سطح الخلية العصبية باستخدام عينات عالية الإنتاجية. باستخدام هذه التقنية، ونحن التقرير أن مجموعة فرعية من المرضى المصابين يعانون من أمراض المناعة الذاتية الجهاز العصبي المركزي لديهم الأجسام المضادة في الدم إلى السطح NMDAR أو تطفو على السطح D2R.
خطوات أساسية للكشف عن الأجسام المضادة الأمثل باستخدام هذ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
تضارب المصالح: قد قدم براءة الاختراع عن طريق الفيس بوك والتجمع الدستوري الديمقراطي (جامعة سيدني) مدعيا D2R كهدف للالأجسام المضادة.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل من قبل المجلس الأسترالي الوطني للصحة والبحوث الطبية، ومؤسسة ستار العلمية (أستراليا)، جمعية متلازمة توريت (الولايات المتحدة الأمريكية)، والتصلب المتعدد تريش مؤسسة البحوث والتصلب المتعدد البحوث أستراليا، ومؤسسة بيتري (أستراليا)، وريبيكا L. مؤسسة كوبر البحوث الطبية (استراليا). نشكر جميع المرضى وأفراد الأسرة الذين قدموا عينات لدراستنا.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| ناقلات pIRES2-EGFP | Clontech | 6029-1 | |
| مستقبلات HA-Dopamine-2 البشرية (D2R) (cDNA | ميسوري S & مركز موارد T cDNA | DRD020TN00 | |
| الوحدة الفرعية البشرية 1 من NMDAR (NR1) هدية cDNA | من البروفيسور A. Vincent ؛ (أكسفورد ، المملكة المتحدة) | ||
| الفأر المنقى أحادي النسيلة المضاد للإنسان NR1 (استنساخ: 54.1) | BD Pharmingen | 556308 | |
| الماوس أحادي النسيلة المنقى المضاد ل DRD2 IgG (الاستنساخ: 1B11) | Sigma-Aldrich | WH0001813M1-50UG | |
| Alexa Fluor 647 الحمار المضاد للفأر IgG (H + L) | Invitrogen | A31571 | |
| Alexa Fluor 647 الماعز المضاد للإنسان IgG (H + L) | Invitrogen | A21445 | |
| دولبيكو s النسر المعدل المتوسط (1x) 4.5 جم / لتر D-glucose و L-Glutamine و 110 مجم / لتر بيروفات الصوديوم | Invitrogen | 11995-065 | |
| مصل الأبقار الجنيني | Invitrogen | 10099-141 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15710-072 | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-061 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Geneticin | Invitrogen | 10131-035 | |
| ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (1x) (-Ca2 + < / sup> / - Mg2 + < / sup>) | Invitrogen | 14190-144 | |
| TrypLE Express (1x) مع الفينول الأحمر | Invitrogen | 12605-028 | |
| 0.9٪ كلوريد الصوديوم | باكستر | AHF7975 | |
| Polyethylenimine | Polysciences Inc | 9002-98-6 | |
| Versene | Invitrogen | 15040-066 | |
| XhoI | Roche | 10899194001 | |
| NheI | Roche | 10885843001 | |
| PureLink PCR Purification Kit | Invitrogen | K3100-01 | |
| JetQuick Gel Extraction Spin Kit | Genomed | 420050 | |
| T4 DNA Ligase | Roche | 10481220001 | |
| Plasmid زائد Maxi Kit | Qiagen | 12963 | |
| اسم المعدات / البرمجيات | رقم الكتالوج الشركة | الموديل / الإصدار | |
| مقياس التدفق الخلوي مع نظام أخذ العينات عالي الإنتاجية | BD Biosciences | BDLSRII مع | |
| مجهر HTS المقلوب | أوليمبوس | CKX41 (مع مصباح زئبق ومصدر طاقة U-RFLT50) | |
| ماصة إلكترونية متعددة القنوات (15-300 مو ؛ ل) | Eppendorf | 613-2240P | 12-channel Xplorer Plus |
| Excel Microsoft | 2010 | ||
| Prism GraphPad Software، Inc. | v4 | ||
| FlowJo | Treestar | v7.5 | |
| 50 مل أنابيب مخروطية من مادة البولي بروبلين BD | Biosciences | 352070 | |
| 6 آبار صفيحة | BD Biosciences | 353046 | |
| قارورة زراعة الأنسجة (T75) | BD Biosciences | 353136 | |
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | PM-992 | |
| V-bottom 96-well لوحة | كورنينج | 651180 | |
المراجع
- Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Dalmau, J. Encephalitis and antibodies to synaptic and neuronal cell surface proteins. Neurol. 77, 179-189 (2011).
- Vincent, A., Bien, C. G., Irani, S. R., Waters, P. Autoantibodies associated with diseases of the CNS:....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
