يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

عزل الخلايا الجذعية متعلق بالنخاع الشوكي والخلايا الظهارية من الغدة الصعترية الإنسان

19.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/50951

⸱

سبتمبر 19, 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of General Neurology, Hertie Institute for Clinical Brain Research, 2Institute of Pharmacology, University of Bern, 3Department of Immunology, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, 4Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, University Clinic Tuebingen, 5Department of Neurology, University Hospital Erlangen

في هذه المقالة

ملخص

هذا البروتوكول تفاصيل طريقة لعزل مستضد تقديم الخلايا من الغدة الصعترية البشرية عبر مختلف مراحل الهضم الأنزيمي من الأنسجة تليها الكثافة الطرد المركزي من تعليق خلية واحدة والفرز المغناطيسي و / أو نظام مراقبة الأصول الميدانية أخيرا من السكان خلية من الفائدة.

الملخص

في هذا البروتوكول ونحن نقدم طريقة لعزل الخلايا الجذعية (DC) والخلايا الظهارية (TEC) من الغدة الصعترية الإنسان. DC وTEC هي الخلية الرئيسية مستضد تقديم (APC) أنواع وجدت في الغدة الصعترية العادي وثبت أيضا أنها تلعب أدوارا متميزة خلال اختيار الغدة الصعترية. يتم ترجمة هذه الخلايا في microenvironments متميزة في الغدة الصعترية، ولكل نوع APC تشكل سوى السكان ضئيلة من الخلايا. لمزيد من فهم بيولوجيا أنواع الخلايا هذه، وتوصيف هؤلاء السكان الخلية هو مرغوب فيه للغاية ولكن نظرا لانخفاض وتيرتها، والعزلة من أي من أنواع الخلايا هذه يتطلب إجراء فعالة وقابلة للتكرار. تفاصيل هذا البروتوكول طريقة للحصول على خلايا مناسبة لتوصيف الخصائص الخلوية المختلفة. تعطل الأنسجة الغدة الصعترية ميكانيكيا وبعد خطوات مختلفة من الهضم الأنزيمية، وأثرى تعليق الخلية الناتجة باستخدام خطوة الطرد المركزي كثافة Percoll. لعزل العاصمة النخاعي (CD11c و<سوب> +)، وimmunoselected الخلايا من جزء منخفض الكثافة (LDF) عن طريق الفرز الخلية المغناطيسي. ويتحقق إثراء السكان TEC (MTEC، CTEC) من خلال استنزاف المكونة للدم (CD45 مرحبا) الخلايا من منخفض الكثافة Percoll جزء الخلية السماح العزلة في وقت لاحق عن طريق تنشيط الخلايا مضان الفرز (FACS) باستخدام علامات معينة من الخلايا. عزل الخلايا يمكن استخدامها لتطبيقات المصب مختلفة.

المقدمة

الغدة الصعترية هو الجهاز الذي تحدث التنمية الخلايا التائية. حجمه النسبي والمطلق النقصان مع التقدم في العمر عندما يصبح استبداله تباعا بواسطة الدهون على الرغم من النشاط الغدة الصعترية لا يزال من الممكن الكشف عنها في سن الشيخوخة. وقد تجلى أهميته للاستجابة المناعية في 1960s في وقت مبكر 1.

تتشكل الخلية ذخيرة T من خلال التفاعل بين مستقبلات الخلايا التائية مع المجمعات الببتيد-MHC على أنواع مختلفة من الغدة الصعترية APC، والتي توفر البقاء على قيد الحياة أو الموت العظة لتطوير خلايا T، مما أدى إلى مرجع الخلية التائية وظيفية وإلى حد كبير متسامح النفس 2.

حوالي 98٪ من الخلايا في الغدة الصعترية الإنسان على تطوير خلايا T يشار إلى thymocytes. تتكون النسبة المتبقية 2٪ من عدد من أنواع مختلفة من الخلايا، بما في ذلك مجموعة متنوعة من TEC (القشرية، النخاع، تحت المحفظة)، والنخاعي بلازماوية العاصمة (حركة التغيير الديمقراطي، الحزب الديمقراطي المسيحي)، الضامة، والخلايا B والخلايا T-إعادة تعميم ناضجة، المحببة، وibroblasts، الخلايا البطانية وخلايا الظهارية نادرة جدا مع النمط الظاهري التعبير التي تشبه الخلايا من الأنسجة الأخرى مثل العضلات، والخلايا العصبية في الجهاز التنفسي وظهارة (الشكل 1). من هذه، وTEC العاصمة هي كبرى أنواع APC جدت في الغدة الصعترية العادية. في السنوات الأخيرة، اكتسبت تنقية هذه الأنواع APC للثقافة والتنميط الجزيئي المزيد والمزيد من الاهتمام. نظرا لانخفاض وتيرتها، والعزلة من أي من أنواع الخلايا هذه لتحليل مفصل يتطلب إجراء كفاءة واستنساخه وفعالة من حيث التكلفة. طريقة المقدمة هنا هو تعديل من الدراسات التي نشرت سابقا 3،4.

كما هو الحال مع أي نوع من الأنسجة الأخرى، واستخراج خلايا من الغدة الصعترية يمكن تحقيقه عن طريق تجزئة إنزيمي في خلية خلية وشبكات التفاعل خلية مصفوفة، من أجل الحصول على تعليق خلايا مفردة. هناك بعض المعلمات مثل كفاءة تفارق جيدة، والغلة الخلية، وبقاء الخلية والاحتفاظ خلية قعلامات urface التي تعتبر حاسمة وتحتاج إلى أن يكون الأمثل لعزل الناجح لهؤلاء السكان الخلية نادرة.

في هذا البروتوكول، يتم تنفيذ عزل العاصمة ومجموعات فرعية TEC بجعل تعليق خلية واحدة من الأنسجة عن اضطراب الهضم الميكانيكية والأنزيمية. نستخدم كولاجيناز A من نسج كلوستريديوم، الذي يحتوي على نسبة متوازنة من الأنشطة الإنزيمية المختلفة، لتحطيم الكولاجين الأصلية التي تحمل الأنسجة معا. يتم تضمين الدناز أنا في حل انزيم للحد من تجميع الخلايا بسبب الحمض النووي خالية من الخلايا الميتة (thymocytes حساسة للغاية)، ونحن أيضا توفير نهج بديل لعملية الهضم الأنزيمي الأنسجة نموذجية تشمل العلاج الأنسجة الميكانيكية والأنزيمية يساعده dissociator الأنسجة. ثم يتعرض تعليق خلية واحدة إلى واحد Percoll كثافة الطرد المركزي لتخصيب منخفض الكثافة الكسر (LDF) من الخلايا. من هذا جزء من الخلايا، DC يمكن أن تكون معزولة عن طريق تلطيخ وأو علامات DC-السطح (أي CD11c و+) واستخدام الفصل المغناطيسي أو خلية مضان تنشيط الفرز (FACS). على عكس الخلايا اللمفاوية التي تضم الغالبية العظمى من الخلايا في الغدة الصعترية، TEC لا تعبر عن CD45 عند مستويات مرتفعة، ولكنها إيجابية للالتصاق الخلايا الظهارية جزيء EpCAM. CTEC يمكن تمييزها عن TEC النخاع عن طريق التعبير عن مستضد بعد غير معروف معترف بها من قبل مجلس الإنماء والإعمار-2 (القشرية شجيري الخلايا الشبكية-2) الأجسام المضادة 4،5 وأقل إلى حد ما EpCAM التعبير. والفرق المشاركة في التعبير عن EpCAM وCDR2 يسمح العزلة كفاءة هذه الخلايا عبر مجموعات فرعية TEC عالية السرعة الفرز 6.

هو الأمثل لبروتوكول المعروضة هنا لأنسجة الغدة الصعترية الإنسان. مدة الإجراء يعتمد على كمية الأنسجة وقدرة المجرب وكذلك سرعة فارز الخلية، إذا تم استخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز. عادة، وبروتوكول لعزل DC يمكن أن تكتمل في غضون 5ساعة -6 وللعزلة TEC في 8-10 ساعة. عزل العاصمة ومجموعات فرعية من أنسجة الغدة الصعترية TEC هو وقت حساس. وكلما زادت سرعة إجراء العزل، وأفضل حالة للخلايا. وأخيرا، فإن خلايا معزولة يمكن استخدامها لمزيد من التحقيقات مثل الدراسات المقارنة مرنا والتعبير البروتين، والتجارب PCR، والبروتين والعزلة، والتنميط الجزيئي (أي transcriptomics، وتحليل الحمض النووي الريبي الصغيرة)، وكذلك ثقافة الخلية 6.

بيان الأخلاق

من أجل أن تكون قادرة على العمل مع أنسجة الغدة الصعترية الإنسان يحتاج الباحث إلى الحصول على موافقة من لجنة الأخلاق المحلية أو السلطات المسؤولة، فضلا عن موافقة خطية علم المتبرع (أو عادة والديه، حيث عادة ما يتم الحصول على الأنسجة من دون السن القانونية الأطفال). علاوة على ذلك، ينبغي التعامل مع جميع أنسجة الإنسان بأنها ينبغي اتخاذ تدابير قد تكون معدية والمناسبة، مثل العمل مع القفازات، الخ.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد أدوات، حلول الانزيم، والمخازن

نفذ الخطوات التالية التحضيرية قبل بداية البروتوكول.

  1. أدوات
    نظيفة وجافة والأوتوكلاف الأدوات التالية والاحتفاظ بها في التعبئة و التغليف المعقم حتى الاستخدام.
    1. مقص حاد صغير مع نصائح إما منحنية أو مستقيمة لقطع الأنسجة الغدة الصعترية. ملقط المنحني الصغيرة مع نصائح مسننة للتعامل مع الأنسجة.
    2. 50 مل أوك ريدج أنابيب الطرد المركزي، وأجهزة الكمبيوتر، للخطوة الطرد المركزي Percoll الكثافة.
  2. حلول انزيم
    إعداد كولاجيناز / الدناز أنا انزيم مزيج (2 ملغ كولاجيناز / مل و 0.1 ملغ الدناز I / مل) على النحو التالي:
    1. حل 500 ملغ من مجفف بالتجميد كولاجيناز A (روش) في 250 مل من 1640 RPMI عادي (بدون FCS) للحصول على حل 2 ملغ / مل كولاجيناز. كولاجيناز من الصعب جدا حل، لذلك فمن المستحسن ترك الأمر بعض الوقت على شاكر الأسطوانة في RT.
    2. حل 100 ملغ الدناز الأول (روش) في10 مل من الماء المقطر العقيمة. ويمكن تخزين 2.5 مل aliquots في -20 درجة مئوية. إضافة 2.5 مل من 10 ملغ الدناز أنا الحل في الحل 2 ملغ كولاجيناز A.
    3. تصفية العقيمة مزيج كولاجيناز / الدناز باستخدام وحدة تصفية Stericup (0.22 ميكرون). متجر في 10-20 مل aliquots في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  3. مخازن وحلول
    1. 1.5 M كلوريد الصوديوم محلول المخزون: حل كلوريد الصوديوم في الماء المقطر المعقم إلى تركيز النهائي من 1.5 م تصفية الحل من خلال مرشح 0.22 ميكرون وتخزينها في RT.
    2. 10X MACS العازلة: برنامج تلفزيوني 1X (كا 2 + / 2 ملغ + خالية) تحتوي على 5٪ BSA و 20 ملي EDTA. تصفية العقيمة الحل مع مرشح 0.22 ميكرون وتخزينها في 4 درجات مئوية. قبل استخدام إعداد 1X الحل عن طريق تمييع المخزون 10X ل1x أخرى في برنامج تلفزيوني 1X الباردة العقيمة.
    3. FACS العازلة: برنامج تلفزيوني 1X (كا 2 + / 2 ملغ + خالية) يحتوي على 1٪ BSA و 0.02٪ نان 3.
    4. FACS العازلة للفرز الخلية: برنامج تلفزيوني 1X (كا 2 + / ملغ 2 مجانا +) التي تحتوي على 2٪ BSA. تعقيم باستخدام فلتر حقنة 0.22 ميكرون وتخزينها في 4 درجات مئوية.

2. إعداد الأنسجة

يجب أن يتم تنفيذ معالجة الأنسجة باستخدام الكواشف معقمة والعمل في مجلس الوزراء تدفق الصفحي. قبل أن يبدأ الإجراء، وإعداد الكواشف والمعدات التالية:

    1. تدفئة التالية لRT: المتوسط ​​1640 RPMI كاملة (RPMI 1640، 10٪ الجنين مصل العجل، 1٪ القلم / بكتيريا)، 1640 RPMI عادي، كا 2 + / 2 ملغ + خالية PBS و 2x كولاجيناز / الدناز الحل الانزيم.
    2. حاضنة الحرارية الدافئة مع وحدة التناوب إلى 37 درجة مئوية وباردة زاوية ثابتة الدوار الطرد المركزي إلى 4 درجات مئوية.
    3. إعداد مربع مع الثلج.

ملاحظة: مدة هذه الخطوة يعتمد على حالة وحجم الأنسجة. وزمنية معقولة حاجة حوالي 20-30 دقيقة للحصول على قطعة متوسطة الحجم من منظمة الشفافية الدوليةssue في حالة جيدة (~ 5 سم في العرض).

  1. وضع الأنسجة في طبق بتري تحتوي على برنامج تلفزيوني العقيمة وشطف أي الدم المتبقي.
    1. إضافة برنامج تلفزيوني جديد لمنع الأنسجة من التجفيف باستخدام ملقط ومقص وتنظيف الأنسجة من جلطات الدم، والنسيج الضام والدهون وأي الجزء الذي لا تبدو صحية.
    2. الحرص على إزالة الأنسجة نخرية التي من شأنها أن تزيد من كمية الحطام.
    3. بعد التنظيف، وتزن الأنسجة لتكون مرجعا.
    4. قطع الأنسجة في حوالي 1 سم 3 قطع / كتل. إضافة ما يكفي من برنامج تلفزيوني لتغطية الأنسجة.

ملاحظة: للحصول على استنساخ النتائج، ينبغي قطع الأنسجة إلى قطع من حجم موحد.

  1. استخدام الجزء الخلفي من حقنة معقمة (10-20 مل) الضغط (وليس قويا جدا أو لفترات طويلة) على قطعة نسيج الغدة الصعترية. وهذا الإجراء إزالة الجزء الأكبر من thymocytes، وبالتالي تقليل حجم الأنسجة ليتم هضمها في وقت لاحق. تنفيذ هذه الخطوة على الجليد والعمل بسرعة.
  2. فإن الحل يصبح غائما واضح كما يتم الافراج thymocytes. تحريك الطبق بلطف ثم بمساعدة ماصة 5 مل أو الشافطة الزجاج إزالة طاف تحتوي على thymocytes مع الحرص على عدم نضح بطريق الخطأ قطع الأنسجة.

نصيحة: A العقيمة خلية ثقافة مكشطة يمكن استخدامها لتركيز كل قطعة نسيج في جانب واحد من الطبق ثم إمالة طبق (بزاوية 45 درجة) ونضح طاف. استبدال برنامج تلفزيوني جديد، وتكرار هذا الإجراء حتى طاف هو شفاف نسبيا. أداء غسل الماضي مع RPMI عادي.

  1. تخطر على قطع الأنسجة باستخدام مقص حاد (كما ناعما قدر الإمكان، وينبغي أن تكون شظايا 2-4 مم على الأقل). يجب أن تكون شظايا صغيرة بما يكفي لإدخال ماصة 5 مل.

3. إعداد تعليق خلية واحدة من الغدة الصعترية الأنسجة

هنا،موصوفة اثنين النهج البديلة لهذه الخطوة. يصف النهج الأول الهضم الأنزيمية الأنسجة نموذجية (القسم 3.1) في حين أن الثاني يشمل العلاج الأنسجة الميكانيكية والأنزيمية يساعده dissociator الأنسجة (القسم 3.2).

هو الأمثل هذا البروتوكول لتجهيز عينات الأنسجة وزنها 5 غرام. لعينات الأنسجة أكبر أو أصغر، وضبط كميات انزيم فقا لذلك.

3.1 النموذجية الهضم الأنسجة الأنزيمية للحصول على تعليق خلية واحدة

  1. وضع الأنسجة المهروسة إلى 50 مل أنابيب مع حل 10 مل كولاجيناز / الدناز لكل 5 غرام من الأنسجة. إضافة RPMI عادي لإعطاء إجمالي حجم 20 مل.

ملاحظة: في أنبوب 50 مل هضم تصل إلى 10 غرام من الأنسجة. ضبط مستوى الصوت انزيم فقا لذلك.

  1. احتضان تعليق الأنسجة لمدة 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية تحت دوران بطيء في حاضنة الحرارية.

ملاحظة: الخطوات الحضانة لا يمكن أن يؤديها إما في حاضنة الحرارية مع وحدة التناوب، أو في حاضنة جرثومية 37 درجة مئوية مع شاكر.

  1. فإن الحل يصبح غائما انزيم كما يتم الافراج الخلايا فيه. في نهاية عملية الهضم، أنبوب الطرد المركزي في 110 x ج لمدة 2 دقيقة على الرواسب شظايا الأنسجة.
  2. جمع طاف من هذه الجولة الهضم. بيليه تعليق خلية لمدة 10 دقيقة في 400 ز س. طاف نضح والخلايا resuspend في 10-50 مل من RPMI كاملة اعتمادا على حجم بيليه الخلية.
  3. الحفاظ على تعليق خلية في الحاضنة 37 درجة مئوية مع غطاء فضفاض.
  4. إذا كنت تريد أرقام الخلية أكبر، وخطوة عملية الهضم ويمكن تكرار مع شظايا الأنسجة المتبقية والأولى والثانية هضم المجمعة. أيضا، إذا TEC يجب أن تكون معزولة، يجب أن يتم تنفيذ جولتين من الهضم.
  5. تمييع قسامة لتعليق الخلية باللون الأزرق التريبان (1:10-1:100) وعدد خلايا قابلة للحياة باستخدام عدادة الكريات.
  6. إبقاء الخلايا عند 37 درجة مئوية في الحاضنة حتى على استعداد للشروع في الكثافة Percoll الطرد المركزي (القسم 4). سيتم تنفيذ العزلة لاحقة من مجموعات فرعية العاصمة (القسم 5) من هذه الخلايا.

ملاحظة: يمكن أن أنسجة الغدة الصعترية تختلف في تكوينها، وخاصة مع التقدم في السن، مما يؤثر على كفاءة الهضم وتوليد تعليق خلية واحدة.

  1. لعزل اللاحقة من الخلايا الظهارية التوتة (TEC) مطلوب جولة ثالثة من الهضم الأنزيمية. بقايا الأنسجة resuspend في 10 مل من محلول كولاجيناز / الدناز الطازجة بالإضافة إلى 10 مل من RPMI سهل وإضافة التربسين / EDTA (01:50 الأسهم من 2.5٪) في الحل.
  2. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة مع التناوب لطيف. خلال مشاركة 10-15 دقيقة من الحضانة إضافة FCS (1:5) لتحييد نشاط التربسين.
  3. أجهزة الطرد المركزي في 110 x ج لمدة 2 دقيقة في RT لالرواسب شظايا الأنسجة.

ز> ملاحظة: الأنسجة قد لا يتم هضمها تماما بعد هذه الجولات الثلاث من الهضم. العمر والحالة العامة للنسيج هي معلمتين التي تؤثر على كفاءة تفكك الأنسجة الغدة الصعترية.

  1. جمع طاف الخلية وتجاهل شظايا الأنسجة الرسوبية.
  2. أجهزة الطرد المركزي لطاف الخلية في 400 x ج لمدة 10 دقيقة. طاف نضح و resuspend الخلية بيليه في RPMI كاملة.

نصيحة: الكريات المحمولة هي فضفاضة جدا، حتى تأخذ الحيطة والحذر عند رميه / الشفط طاف.

  1. عد خلايا قابلة للحياة باستخدام عدادة الكريات. وضع الخلايا في الحاضنة 37 درجة مئوية حتى الشروع في Percoll الفصل (القسم 4). سيتم تنفيذ اللاحقة قبل تخصيب الخلايا TEC بواسطة نضوب خلايا CD45 مرحبا من هذه الخلايا (القسم 6).

3.2 معالجة الأنسجة الميكانيكية والأنزيمية يساعده dissociator الأنسجة

الحمار = "jove_content"> استخدام الأنسجة dissociator الاقتراب يمكن تقليل الخطوات الهضم الأنسجة لنصف الوقت اللازم مع النهج المبين أعلاه (القسم 3.1). بروتوكول التالية هو نسخة معدلة من تلك المستخدمة لفصل الماوس الغدة الصعترية الأنسجة لعزل TEC 7،8.

  1. نقل 5 غرام من قطع الأنسجة المفروم (الخطوة 2.5) في أنبوب C تحتوي على 10 مل من محلول كولاجيناز / الدناز.
  2. التكيف مع أنبوب C على dissociator الأنسجة وm_spleen_02 برنامج تشغيل (10 ثانية). تكرار هذا البرنامج 4-5X (40-50 ثانية).
  3. احتضان مع التناوب لطيف لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  4. أجهزة الطرد المركزي في 110 x ج لمدة 2 دقيقة في RT.
  5. جمع طاف والمضي قدما كما في الخطوة 3.1.4. إضافة 10 مل من محلول كولاجيناز / الدناز الطازجة.
  6. التكيف مع أنبوب C على dissociator الأنسجة وm_spleen_01 برنامج تشغيل (56 ثانية).
  7. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة مع التناوب لطيف.
  8. أجهزة الطرد المركزي في 110 x ج لمدة 2 دقيقة في RT.
  9. جامعيطاف ر الخلية وبيليه تعليق خلية لمدة 10 دقيقة في 400 ز س. المضي قدما كما في الخطوة 3.1.4.
  10. كما هو موضح في 3.1.9 هناك حاجة إلى الجولة الثالثة من عملية الهضم لعزل اللاحقة من الخلايا الظهارية التوتة (TEC). لهذا، بقايا الأنسجة resuspend في 10 مل من محلول كولاجيناز / الدناز الطازجة بالإضافة إلى التربسين / EDTA (1:50 التخفيف من الأسهم 2.5٪)
  11. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة أخرى مع دوران طيف. إضافة FCS (1:5) واحتضان لمدة 10 دقيقة إضافية.

ملاحظة: باستخدام هذا النهج، بعد هذه الخطوة الهضم مشاركة وعادة ما يتم فصلها الأنسجة تماما ويلاحظ أي شظايا الأنسجة عسر الهضم.

  1. المضي قدما كما هو الحال في الخطوات 3.1.11-3.1.14.

4. إثراء LDF من الخلايا عن طريق الكثافة Percoll الفصل

بعد الهضم الأنزيمي من الأنسجة، ويتعرضون مجموع حيدة الخلية تعليق التوتة إلى واحد Percoll الكثافة centrifugatالخطوة أيون لإثراء للخلايا LDF. والتخصيب في LDF من الخلايا لAPC. تم الكشف عن كل من العاصمة وTEC في هذا جزء من الخلايا.

  1. استخدام تعليق خلية واحدة تم الحصول عليها من شارع 1 و 2 الثانية هضم لحركة التغيير الديمقراطي العزلة (خلايا المجمعة، راجع الخطوة 3.1.8) أو 3 الثالثة هضم (لTEC العزلة) (3.1.14). الطرد المركزي تعليق خلية واحدة تم الحصول عليها من كل خطوة في الهضم 400 x ج لمدة 10 دقيقة.
  2. يعد حل Percoll مع كثافة النهائي من 1.07 جم / مل خلال هذه الخطوة غسل (انظر المثال في الجدول أدناه).
    إعداد Percoll حل لكثافة النهائي من 1.07 جم / مل (ρ = 1.07)
    أنبوب رقم 1 2 3 4
    غير مخفف Percoll (ρ = 1.130) (مل) 2.96 5.92 8.88 11.84
    1.5 M كلوريد الصوديوم (مل) 0.6 1.20 1.8 2.4
    المقطر H 2 O (مل) 2.44 4.88 7.32 9.76
    حجم التخفيف العمل النهائية 6 مل 12 مل 18 مل 24 مل
  3. يعتمد عدد من الأنابيب Percoll على أرقام الخلية المحددة في خطوات 3.1.8 و / أو 3.1.14. الجمع بين الحلول العقيمة وتخلط جيدا. لعزل الأمثل، 0،6-1 × 10 9 خلايا يمكن تحميلها في أنبوب من Percoll. الجمع بين الحلول العقيمة وتخلط جيدا.

نصيحة: Percoll هو الحساسية للضوء وبالإضافة إلى ذلك ينبغي أن يوضع الباردة. إعداد أول الخليط الذي يحتوي على كلوريد الصوديوم وH 2 O (RT) وإضافة مخفف Percoll الماضي، قبل إعادة التعليق الخلايا في حل Percoll.

خيمة "> ملاحظة: قد تختلف الكثافة Percoll بين الموردين ودفعات مختلفة إذا كانت كثافة من الحل Percoll غير مخفف لا تساوي 1.130 غرام / مل، استخدم التعليمات المرفقة من قبل الشركة المصنعة لحساب كميات الدقيق Percoll وH 2 O المطلوبة للحصول على الكثافة النهائية من 1.07 جم / مل.

  1. في resuspend تصل إلى 1 × 10 9 خلايا في 6 مل من محلول Percoll إعداد (ρ = 1.07)، وخلط بما فيه الكفاية للحصول على تعليق متجانسة، ونقل إلى 50 مل أوك ريدج البولي غطاء المسمار أنبوب الطرد المركزي.
  2. طبقة بعناية 30 مل من RPMI كاملة في أنبوب مع ماصة على أعلى من التعليق الحل Percoll / خلية. تحميل المتوسطة ببطء، بحيث يظل على قمة التعليق والحرص على عدم تعكير صفو طبقة.
  3. وزن الأنابيب للتأكد من أن لديهم أوزان متساوية بحيث تكون متوازنة أثناء الطرد المركزي. إذا لم تكن كذلك، إضافة بعناية أكثر المتوسط ​​في أنبوب أخف وزنا (تحت الحادي وشروط erile).
  4. نقل بعناية الأنابيب إلى جهاز للطرد المركزي المبردة مسبقا مع الدوار زاوية ثابتة، وتدور في 3،500 x ج لمدة 35 دقيقة، في 4 درجات مئوية مع قبالة الفرامل. تأكد من أن درجة الحرارة في أجهزة الطرد المركزي في عدم أعلى من 4 درجات مئوية.
  5. إزالة أنابيب من أجهزة الطرد المركزي وبعناية جمع APC المخصب، وجدت في الطور البيني بين Percoll والمتوسطة (منخفض الكثافة جزء) من كل أنبوب باستخدام ماصة باستير العقيمة. نقل الخلايا في أنبوب 50 مل تحتوي على RPMI كاملة الباردة. ملء الأنبوب من أجل تمييع خارج Percoll المتبقية.
  6. الطرد المركزي تعليق خلية لمدة 10 دقيقة في 300 XG في 4 درجات مئوية. تجاهل طاف وتكرار الغسيل.
  7. resuspend الكرية خلية في المتوسط ​​وتحديد عدد الخلايا (باستخدام التريبان الأزرق وعدادة الكريات). في تجربتنا، فإن النسبة المئوية للخلايا LDF حوالي 2-20٪ من مجموع تعليق خلية واحدة تم الحصول عليها بعد عملية الهضم الانزيم. ذ نموذجيةدرع من خلايا المخصب المنخفض الكثافة (من الغدة الصعترية الشباب، مجموعة 1 يوم 2 عاما) 1X10 8 خلايا لكل 1 × 10 9، وهو ما يمثل 10٪ من مجموع خلايا تعليق خلية واحدة.

ملاحظة: في هذه المرحلة، قد لاحظت أن الخلايا مجمعة في التعليق (خاصة مع عينات من الأطفال في سن كبار السن). كتل الخلايا هي مؤشر على موت الخلايا ونتيجة من إطلاق الحمض النووي من الخلايا الميتة التي يمكن أن تلتصق الخلايا معا. في مثل هذه الحالة، إضافة الدناز أنا في العينة (50 ميكروغرام / مل)، واحتضان لمدة تصل إلى 20 دقيقة في RT (عكس بلطف كل 5 دقائق) لهضم جزيئات الحمض النووي الحرة.

5. عزل حركة التغيير الديمقراطي التوتة

بعد تخصيب APC (عبر Percoll الفصل)، حركة التغيير الديمقراطي يمكن أن تكون معزولة بكفاءة من LDF بعد الجولة الأولى والثانية من الهضم الأنزيمية. بروتوكول التالية هو نسخة معدلة من فصل الخلية المغناطيسي لعزل حركة التغيير الديمقراطي (CD11c و +).

  1. أجهزة الطرد المركزي التخصيب APC خلايا معزولة من تعليق خلية واحدة تم الحصول عليها من المجمعة الأولى والثانية الهضم الأنزيمي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية و resuspend الخلية بيليه في 100 ميكرولتر العازلة MACS في 10 7 الخلايا.
  2. إضافة 5 ميكرولتر من CD11c و-PE الأجسام المضادة في 10 7 الخلايا.

ملاحظة: ينصح تجارب المعايرة لأفضل النتائج.

  1. تخلط جيدا واحتضان لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية، محمية من الضوء.
  2. غسل الخلايا عن طريق إضافة 1-2 مل من العازلة MACS في 10 7 خلايا وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة.
  3. نضح طاف تماما و resuspend تصل إلى 10 7 خلايا في 80 ميكرولتر من العازلة MACS.
  4. إضافة 20 ميكرولتر بلي مكافحة PE في 10 7 الخلايا.
  5. تخلط جيدا (لا الدوامة)، واحتضان لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية محمية من الضوء.
  6. تكرار كما في الخطوة 5.4.
  7. في resuspend تصل إلى 10 8 الخلايا في 500 ميكرولتر من العازلة.
  8. إذا لزم الأمر، تعليق خلية تصفية باستخدام مصفاة الخلية 40 ميكرومتر لإزالة الأنقاض والركام الخلية التي قد تعيق تدفق العمود.
  9. استخدام عمود LS منذ تعليق خلية الغدة الصعترية تدفق أفضل من خلال الأعمدة LS. إعداد العمود LS التالية تعليمات الشركة الصانعة. تعليق خلية ماصة ببطء في العمود تجنب فقاعات توليد. استخدام عمود واحد لكل 1 × 10 8 خلايا.
  10. غسل العمود باتباع إرشادات الشركة المصنعة. إزالة عمود من المغناطيس ووضعه في العقيمة 12 مل أنبوب البولي بروبلين جولة القاع. إضافة 3 مل MACS العازلة على العمود وجمع الخلايا المسمى مغناطيسيا عن طريق إدراج ودفع بقوة المكبس في العمود.
  11. جمع جزء مزال تمثل CD11c و+ حركة التغيير الديمقراطي وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 6 دقائق.
  12. تحديد عدد الخلايا وتأكيد نقاء populati الخلية المحددةعلى طريق تحليل تدفق cytometric. وتشمل علامات اقترح CD45، CD11c و، وHLA-DR.

ملاحظة: CD11c و+ حركة التغيير الديمقراطي ويمكن أيضا أن تكون معزولة باستخدام فارز نظام مراقبة الأصول الميدانية.

6. إثراء خلايا CD45 الصغرى / NEG الفرز خلية من TEC

لعزل TEC، وخلايا يمكن قبل المخصب بنسبة نضوب خلايا CD45 CD45 مرحبا بلي استخدام، من أجل تسريع عزلتهم من خلال الفرز الخلية.

استخدام تعليق خلية واحدة تم الحصول عليها من الخطوة الثالثة الهضم 3 (3.1.14) وبعد ذلك مفصولة Percoll الطرد المركزي.

  1. تعليق خلية الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية و resuspend بيليه خلية في 80 ميكرولتر العازلة MACS في 10 7 الخلايا.
  2. استخدام بلي CD45 في 1/3 من الكمية الموصى بها (6.7 ميكرولتر) في 10 7 الخلايا.

ملاحظة: باستخدام كمية أقلمن بلي نحن قبل إثراء خلايا CD45 الصغرى على حد سواء والخلايا NEG CD45. ينصح المعايرة لأفضل النتائج.

  1. مزيج جيد من قبل عبها بلطف الأنبوب (لا الدوامة)، واحتضان لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  2. غسل بلي غير منضم بإضافة 10 مل من MACS العازلة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 300 XG في 4 درجات مئوية. نضح طاف تماما.
  3. في resuspend تصل إلى 10 8 الخلايا في 500 ميكرولتر من العازلة.
  4. إذا لزم الأمر، تعليق خلية تصفية باستخدام مصفاة الخلية 70 ميكرومتر لإزالة الأنقاض والركام الخلية التي قد تعيق تدفق العمود.
  5. استخدام عمود LS منذ تعليق خلية الغدة الصعترية تدفق أفضل من خلال الأعمدة LS. إعداد العمود LS التالية تعليمات الشركة الصانعة. تعليق خلية ماصة ببطء في العمود تجنب فقاعات توليد. استخدام عمود واحد لكل 10 8 خلايا.
  6. جمع الخلايا غير المسماة (التدفق من خلال ويغسل) التي تحتوي علىوCD45 الصغرى / NEG جزء الخلية ويغسل العمود التالي تعليمات الشركة الصانعة.
  7. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية و resuspend بيليه خلية في المخزن FACS العقيمة من أجل تحديد عدد الخلايا، والشروع في تلطيخ للفرز الخلية.

7. وصمة عار للخلايا الإسفار المنشط الفرز الخلية

  1. أداء FCR حجب قبل تلوين الخلية، من أجل الحد من الأجسام المضادة غير محددة ملزمة. احتضان تعليق خلية مجمعة مع المناعية الإنسان الحل لمدة 15 دقيقة في RT. تتوفر تجاريا (أي Gammunex حل 10٪) هذه الكواشف.
  2. غسل الخلايا بإضافة الباردة العازلة FACS العقيمة. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 6 دقائق في 4 درجات مئوية.
  3. تجاهل طاف والخلايا resuspend في البرد العازلة FACS العقيمة. 5 إعداد العينات وفقا للمثال التالي:
    عينة نوع العينة الجسم المضاد عدد الخلايا إجمالي حجم
    1. طاهر مراقبة 1 × 10 6 50 ميكرولتر
    2.scc * والمحيط الهادئ الأزرق مراقبة CD45 والمحيط الهادئ الأزرق 1 × 10 6 50 ميكرولتر
    3. SCC-APC مراقبة CD3-APC 1 × 10 6 50 ميكرولتر
    4.scc-اليكسا 488 مراقبة CD8-اليكسا 488 1 × 10 6 50 ميكرولتر
    5. الفرز الخلية الحليلة CD45 والمحيط الهادئ الأزرق
    EpCAM-APC
    CDR2-اليكسا 488     		10 × 10 6-50 × 10 6 500 ميكرولتر
    10 × 10 6 ميكرولتر cells/100

    * مجلس التنسيق الأعلى، ومراقبة لون واحد

  4. احتضان الخلايا مع أجسام مضادة لمدة 30 دقيقة، على الجليد في الظلام.
  5. يغسل مرتين مع العازلة FACS الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 6 دقائق في 4 درجات مئوية.
  6. ضبط تركيز خلية من العينة ليتم فرزها إلى 1 X10 7 خلية / مل (أو إلى تركيز أوصت به مرفق الفرز الخلية) باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية العقيمة العازلة للخلية الفرز (أي من دون نان 3).
  7. تمرير عينة الخلية من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر لإزالة أي كتل الخلايا التي قد تسد عداد الكريات أثناء الفرز.
  8. في resuspend العينات في السيطرة 200-400 ميكرولتر من العازلة. إبقاء الأنابيب على الجليد ومحمية من الضوء.
  9. إعداد أنابيب جمع مع المتوسط.

الملاحظات:

  • أداء المعايرة من الأجسام المضادة لتلطيخ الأمثل.
  • في عينة واحدة للفرز، وتصل إلى 50 × 10 6 خلايا يمكن أن تكون ملطخة في حجم رد الفعل الكلي لل500 ميكرولتر.
  • أداء تلطيخ من العينة ليتم فرزها في 5 مل فالكون البوليسترين أنابيب أسفل الجولة. الضوابط لون واحد يمكن أن تكون ملطخة في آبار منفصلة من لوحة 96 جيدا.
  • منذ TEC مجموعات فرعية هي نادرة السكان، فإنه من المستحسن استخدام علامة إيجابية أخرى (عالية التردد) لكل تألقي لتسهيل تحديد إعدادات نظام مراقبة الأصول الميدانية المناسبة، والتأكد من أن يكون لديك التعويض المناسب إذا كان اختيار fluorochromes يتطلب التعويض. يمكن أن تكون ملطخة الخلايا من الكسر CD45 + مع علامات مثل CD45، أو CD8 CD3 لfluorochromes مختلفة وغير ملوثين بعد تلطيخ CD45 + الخلايا يمكن أن تضاف إلى العينة.

8. عزل TEC بواسطة الإسفار المنشط الفرز الخلية

مجموعات فرعية TEC يمكن فرزها من CD45 الصغرى / NEG جزء كما EpCAM مرحبا CDR2 - (MTEC) أو EpCAM لو CDR2 + (CTEC).

  1. تشغيل العينة الطرافةح الخلايا غير ملوثين وضبط الأمام والجانب مبعثر من أجل وضع السكان من الاهتمام في الحجم. ضبط الجهد على كل كاشف بحيث الخلايا مرئية لكنها تقع في الجزء ناحية اليسار المتطرف من الرسم البياني.
  2. تشغيل كل عينة الملون واحدة وتعديل التعويض عن كل لون.
  3. بعد ضبط الجهد والتعويض عن الضوابط الملون غير ملوثين واحد تشغيل العينة ليتم فرزها وأدوات استخدام النابضة لتعريف السكان من الاهتمام. استخدام واسعة إلى الأمام والجانب مبعثر البوابة لضمان إدراج جميع الأحجام الخلية اللحمية، مع استبعاد الحطام الخلية.
  4. على مؤامرة نقطة مع الأزرق CD45 والمحيط الهادئ مقابل البوابة إلى الأمام مبعثر على خلايا CD45 CD45 NEG منخفضة و.
  5. تنطبق هذه البوابة إلى EpCAM مقابل CDR2 مؤامرة نقطة وتحديد ما النابضة السكان ليتم فرزها.
  6. مرة واحدة وقد تم تحديد البوابات، بوابات حدد تحتوي على السكان من الاهتمام وبدء الفرز.
    7. تم جمع الخلايا بمجرد فرزها، الطرد المركزي تعليق خلية، والخلايا resuspend في المتوسط ​​أو عازلة للاختيار حسب الطلب المصب المقصود.

ملاحظة: أثناء الفرز وذلك لمنع الخلايا من الالتصاق إلى جانبي أنبوب جمع، أنبوب يمكن قبل المغلفة عن طريق ملء هذا الامر مع 50٪ FCS في برنامج تلفزيوني وحضنت في RT لمدة 30 دقيقة. تجاهل الحل الطلاء قبل إضافة وسائل الاعلام المجموعة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في بدء المواد في هذا البروتوكول نستخدم الأنسجة الغدة الصعترية إزالتها من الأطفال خضوعه لعملية جراحية تصحيحية القلب والأوعية الدموية (قسم أمراض الصدر وجراحة القلب والأوعية الدموية، جامعة توبنجن عيادة) تم الحصول عليها بعد الموافقة المسبقة وتحت المبادئ التوجيهية المؤسسية. هذه المواد يمكن التخلص منها تختلف اختلافا كبيرا في حجم 2-30 غرام أو أكثر. عدد حركة التغيير الديمقراطي ومجموعات فرعية TEC (CTEC وMTEC) التي يتم الحصول عليها يعتمد على حجم فضلا عن سن عينة أنسجة الغدة الصعترية تستخدم ل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

بروتوكول الموصوفة هنا هو تعديل للبروتوكول الذي نشرته Gotter وآخرون 4. الخطوات الحاسمة في البروتوكول هي حالة والتحضير الأولي للأنسجة وكذلك فصل الكثافة Percoll. ونحن نوصي بشدة لمعالجة الأنسجة في أقرب وقت ممكن بعد جمع. من المهم أن تعمل بسرعة ولكن بدقة عند تنظيف وتقطيع الأنسجة. أثناء غسل خلية توتية هو موضح في الخطوة 2.3، فمن الأهمية بمكان أن تجد التوازن الصحيح عند تطبيق الضغط مع الجزء الخلفي من المكبس المحاقن على قطع الأنسجة كما ضغط قوية جدا وطويلة الأمد يمكن أن تت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

أعلن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

ونحن ممتنون للجراحين من وزارة الصدر والقلب والأوعية الدموية وجراحة، جامعة توبنجن عيادة لتزويدنا العينات الغدة الصعترية وبرونو Kyewski (DKFZ، هايدلبرغ، ألمانيا) لتوفير الأجسام المضادة CDR2. نود أيضا أن نشكر هانز يورغ Bühring وسابرينا جريم من مرفق الفرز (جامعة توبنجن). وأيد هذا العمل من قبل SFB 685 ومؤسسة هيرتي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الكواشف والمواد< / strong>
RPMI 1640PAAE15-842  ؛
برنامج Dulbecco's PBSPAAH15-002 
مصل الأبقار الجنينية-الذهبPAAA15-151 
ألبومين مصل الأبقارPAAK41-001 
كولاجيناز أروش10 103 586 001 
DNase I, الدرجة الثانية البنكرياس البقريRoche10 104 159 001 
Trypsin-EDTA 10x في مخزون PBSPAAL11-001conc. 20 مجم / مل
Alexa Fluor 488 مجموعة ملصقات البروتينالمجسات الجزيئيةA-10235  ؛
CDR2 المضاد للإنسان (منقى) برونوكيوسكي ، DKFZ- هايدلبرغ ، ألمانياالمسمى ب Alexa Fluor 488
CD45 المضاد للإنسان (Pacific Blue)Biolegend304022  ؛
مكافحة الإنسان EpCAM (APC)Miltenyi Biotec130-091-254 
مكافحة الإنسان CD11c (PE)Miltenyi Biotec130-092-411 
الميكروبيدات المضادة لل PEMiltenyi Biotec130-048-801  ؛
الميكروبيدات المضادة ل CD45 ،Miltenyi Biotecالبشري 130-045-801  ؛
أعمدة LSMiltenyi Biotec130-042-401 
gentleMACS C TubesMiltenyi Biotec130-093-237لفصل الأنسجة
Percoll (الكثافة 1.130 جم / مل) GEللرعاية الصحية ، علوم الحياة17-0891-01  ؛
ماء مقطر معقم (خال من DNAse / RNAse)GIBCO10977-035 
Gamunex 10٪Tajecris-BiotherapeuticsG1200521:10 قبل التخفيف ، استخدم 20 مو ؛ L / 1 × 106< / sup>cells
0.22 & mu ؛ مرشح mMillex GSSLGS033SSStericup مدفوعة بالحقنة
MilliporeSCGPU05REمضخة مدفوعة
50 مل أنابيب الطرد المركزي من خشب البلوطNalgene3118-005050 مل 50
مل أنابيب مخروطية PPBecton Dickinson352070  ؛
12 مم × 75 مم 5 مل أنابيب اختبارBecton Dickinson352058FACS
مصفاة خلية 70 مو ؛ مبيكتون ديكنسون352350 
INSTRUMENTS< / strong>
Flow Cytometer-Sorter (BD FACSAriaTMIIu)Becton Dickinson  ؛
Sorvall Evolution R6 (الدوار) Kendro 
دوار REAX 2هايدولف 
gentleMACS DissociatorMiltenyi Biotec130-093 235مفكك الأنسجة
وحدة تصفية

المراجع

  1. Miller, J. F. A. P. The discovery of thymus function and of thymus-derived lymphocytes. Immunological Reviews. 185, 7-14 (2002).
  2. Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction. Nat Rev Immunol. 9, 833-844 (2009).
  3. Vandenabeele, S., Hochrein, H., Mavaddat, N., Winkel, K., Shortman, K. Human thymus contains 2 distinct dendritic cell populations. Blood. 97, 1733-1741 (2001).
  4. Gotter, J., Brors, B., Hergenhahn, M., Kyewski, B. Medullary Epithelial Cells of the Human Thymus Express a Highly Diverse Selection of Tissue-specific Genes Colocalized in Chromosomal Clusters. The Journal of Experimental Medicine. 199, 155-166 (2004).
  5. Rouse, R. V., Bolin, L. M., Bender, J. R., Kyewski, B. A. Monoclonal antibodies reactive with subsets of mouse and human thymic epithelial cells. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 36, 1511-1517 (1988).
  6. Stoeckle, C., et al. Cathepsin S dominates autoantigen processing in human thymic dendritic cells. Journal of Autoimmunity. 38, 332-343 (2012).
  7. Woods Ignatoski, K. M., Bingham, E. L., Frome, L. K., Doherty, G. M. Directed trans-differentiation of thymus cells into parathyroid-like cells without genetic manipulation. Tissue Eng Part C Methods. 17, 1051-1059 (2011).
  8. Williams, K. M., et al. Single Cell Analysis of Complex Thymus Stromal Cell Populations: Rapid Thymic Epithelia Preparation Characterizes Radiation Injury. Clinical and Translational Science. 2, 279-285 (2009).
  9. Bendriss-Vermare, N., et al. Human thymus contains IFN-α-producing CD11c-, myeloid CD11c+, and mature interdigitating dendritic cells. The Journal of Clinical Investigation. 107, 835-844 (2001).
  10. Schmitt, N., et al. Ex vivo characterization of human thymic dendritic cell subsets. Immunobiology. 212, 167-177 (2007).
  11. Dzionek, A., et al. BDCA-4: Three Markers for Distinct Subsets of Dendritic Cells in Human Peripheral Blood. The Journal of Immunology. 165, 6037-6046 (2000).
  12. Wu, L., Shortman, K. Heterogeneity of thymic dendritic cells. Seminars in Immunology. 17, 304-312 (2005).
  13. Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. Journal of Immunological Methods. 385, 23-34 (2012).
  14. Adamopoulou, E., Tenzer, S., Hillen, N., Klug, P., Rota, I. A., Tietz, S., Gebhardt, M., Stevanovic, S., Schild, H., et al. Exploring the MHC-peptide matrix of central tolerance in the human thymus. Nature Communications. , (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

عزل الخلاياالهضم الإنزيميالطرد المركزي بكثافة بيركولفرز الخلايا المغناطيسيفرز الخلايا المنشط بالفلورةكسر منخفض الكثافةإثراء الخلايا
عزل الخلايا الجذعية متعلق بالنخاع الشوكي والخلايا الظهارية من الغدة الصعترية الإنسان
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.