مقالة منهجية
هذا البروتوكول تفاصيل طريقة لعزل مستضد تقديم الخلايا من الغدة الصعترية البشرية عبر مختلف مراحل الهضم الأنزيمي من الأنسجة تليها الكثافة الطرد المركزي من تعليق خلية واحدة والفرز المغناطيسي و / أو نظام مراقبة الأصول الميدانية أخيرا من السكان خلية من الفائدة.
في هذا البروتوكول ونحن نقدم طريقة لعزل الخلايا الجذعية (DC) والخلايا الظهارية (TEC) من الغدة الصعترية الإنسان. DC وTEC هي الخلية الرئيسية مستضد تقديم (APC) أنواع وجدت في الغدة الصعترية العادي وثبت أيضا أنها تلعب أدوارا متميزة خلال اختيار الغدة الصعترية. يتم ترجمة هذه الخلايا في microenvironments متميزة في الغدة الصعترية، ولكل نوع APC تشكل سوى السكان ضئيلة من الخلايا. لمزيد من فهم بيولوجيا أنواع الخلايا هذه، وتوصيف هؤلاء السكان الخلية هو مرغوب فيه للغاية ولكن نظرا لانخفاض وتيرتها، والعزلة من أي من أنواع الخلايا هذه يتطلب إجراء فعالة وقابلة للتكرار. تفاصيل هذا البروتوكول طريقة للحصول على خلايا مناسبة لتوصيف الخصائص الخلوية المختلفة. تعطل الأنسجة الغدة الصعترية ميكانيكيا وبعد خطوات مختلفة من الهضم الأنزيمية، وأثرى تعليق الخلية الناتجة باستخدام خطوة الطرد المركزي كثافة Percoll. لعزل العاصمة النخاعي (CD11c و<سوب> +)، وimmunoselected الخلايا من جزء منخفض الكثافة (LDF) عن طريق الفرز الخلية المغناطيسي. ويتحقق إثراء السكان TEC (MTEC، CTEC) من خلال استنزاف المكونة للدم (CD45 مرحبا) الخلايا من منخفض الكثافة Percoll جزء الخلية السماح العزلة في وقت لاحق عن طريق تنشيط الخلايا مضان الفرز (FACS) باستخدام علامات معينة من الخلايا. عزل الخلايا يمكن استخدامها لتطبيقات المصب مختلفة.
الغدة الصعترية هو الجهاز الذي تحدث التنمية الخلايا التائية. حجمه النسبي والمطلق النقصان مع التقدم في العمر عندما يصبح استبداله تباعا بواسطة الدهون على الرغم من النشاط الغدة الصعترية لا يزال من الممكن الكشف عنها في سن الشيخوخة. وقد تجلى أهميته للاستجابة المناعية في 1960s في وقت مبكر 1.
تتشكل الخلية ذخيرة T من خلال التفاعل بين مستقبلات الخلايا التائية مع المجمعات الببتيد-MHC على أنواع مختلفة من الغدة الصعترية APC، والتي توفر البقاء على قيد الحياة أو الموت العظة لتطوير خلايا T، مما أدى إلى مرجع الخلية التائية وظيفية وإلى حد كبير متسامح النفس 2.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
1. إعداد أدوات، حلول الانزيم، والمخازن
نفذ الخطوات التالية التحضيرية قبل بداية البروتوكول.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
في بدء المواد في هذا البروتوكول نستخدم الأنسجة الغدة الصعترية إزالتها من الأطفال خضوعه لعملية جراحية تصحيحية القلب والأوعية الدموية (قسم أمراض الصدر وجراحة القلب والأوعية الدموية، جامعة توبنجن عيادة) تم الحصول عليها بعد الموافقة المسبقة وتحت المبادئ التوجيهية المؤسسية. هذه المواد يمكن التخلص منها تختلف اختلافا كبيرا في حجم 2-30 غرام أو أكثر. عدد حركة التغيير الديمقراطي ومجموعات فرعية TEC (CTEC وMTEC) التي يتم الحصول عليها يعتمد على حجم فضلا عن سن عينة أنسجة الغدة الصعترية تستخدم ل.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
بروتوكول الموصوفة هنا هو تعديل للبروتوكول الذي نشرته Gotter وآخرون 4. الخطوات الحاسمة في البروتوكول هي حالة والتحضير الأولي للأنسجة وكذلك فصل الكثافة Percoll. ونحن نوصي بشدة لمعالجة الأنسجة في أقرب وقت ممكن بعد جمع. من المهم أن تعمل بسرعة ولكن بدقة عند تنظيف وتقطيع الأنسجة. أثناء غسل خلية توتية هو موضح في الخطوة 2.3، فمن الأهمية بمكان أن تجد التوازن الصحيح عند تطبيق الضغط مع الجزء الخلفي من المكبس المحاقن على قطع الأنسجة كما ضغط قوية جدا وطويلة الأمد يمكن أن تت.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
أعلن أي تضارب في المصالح.
ونحن ممتنون للجراحين من وزارة الصدر والقلب والأوعية الدموية وجراحة، جامعة توبنجن عيادة لتزويدنا العينات الغدة الصعترية وبرونو Kyewski (DKFZ، هايدلبرغ، ألمانيا) لتوفير الأجسام المضادة CDR2. نود أيضا أن نشكر هانز يورغ Bühring وسابرينا جريم من مرفق الفرز (جامعة توبنجن). وأيد هذا العمل من قبل SFB 685 ومؤسسة هيرتي.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الكواشف والمواد< / strong> | |||
| RPMI 1640 | PAA | E15-842 | ؛ |
| برنامج Dulbecco's PBS | PAA | H15-002 | |
| مصل الأبقار الجنينية-الذهب | PAA | A15-151 | |
| ألبومين مصل الأبقار | PAA | K41-001 | |
| كولاجيناز أ | روش | 10 103 586 001 | |
| DNase I, الدرجة الثانية البنكرياس البقري | Roche | 10 104 159 001 | |
| Trypsin-EDTA 10x في مخزون PBS | PAA | L11-001 | conc. 20 مجم / مل |
| Alexa Fluor 488 مجموعة ملصقات البروتين | المجسات الجزيئية | A-10235 | ؛ |
| CDR2 المضاد للإنسان (منقى) برونو | كيوسكي ، DKFZ- هايدلبرغ ، ألمانيا | المسمى ب Alexa Fluor 488 | |
| CD45 المضاد للإنسان (Pacific Blue) | Biolegend | 304022 | ؛ |
| مكافحة الإنسان EpCAM (APC) | Miltenyi Biotec | 130-091-254 | |
| مكافحة الإنسان CD11c (PE) | Miltenyi Biotec | 130-092-411 | |
| الميكروبيدات المضادة لل PE | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | ؛ |
| الميكروبيدات المضادة ل CD45 ، | Miltenyi Biotec | البشري 130-045-801 | ؛ |
| أعمدة LS | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | لفصل الأنسجة |
| Percoll (الكثافة 1.130 جم / مل) GE | للرعاية الصحية ، علوم الحياة | 17-0891-01 | ؛ |
| ماء مقطر معقم (خال من DNAse / RNAse) | GIBCO | 10977-035 | |
| Gamunex 10٪ | Tajecris-Biotherapeutics | G120052 | 1:10 قبل التخفيف ، استخدم 20 مو ؛ L / 1 × 106< / sup>cells |
| 0.22 & mu ؛ مرشح m | Millex GS | SLGS033SS | Stericup مدفوعة بالحقنة |
| Millipore | SCGPU05RE | مضخة مدفوعة | |
| 50 مل أنابيب الطرد المركزي من خشب البلوط | Nalgene | 3118-0050 | 50 مل 50 |
| مل أنابيب مخروطية PP | Becton Dickinson | 352070 | ؛ |
| 12 مم × 75 مم 5 مل أنابيب اختبار | Becton Dickinson | 352058 | FACS |
| مصفاة خلية 70 مو ؛ م | بيكتون ديكنسون | 352350 | |
| INSTRUMENTS< / strong> | |||
| Flow Cytometer-Sorter (BD FACSAriaTMIIu) | Becton Dickinson | ؛ | |
| Sorvall Evolution R6 (الدوار) Kendro | |||
| دوار REAX 2 | هايدولف | ||
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093 235 | مفكك الأنسجة |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن