مقالة منهجية

نخاع العظام المستمدة من بلعم الإنتاج

DOI:

10.3791/50966

⸱

نوفمبر 22, 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1CNRS UMR 7278, IRD198, INSERM U1095, Aix-Marseille Université, 2Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples "Federico II"

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

منذ فترة طويلة معترف بها الضامة بوصفها عنصرا حيويا من الاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية. الانفجار الأخير من المعرفة المتعلقة بالجوانب التطورية والجينية والبيوكيميائية والتفاعل بين الميكروبات الضامة وجددت الاهتمام العلمي لالضامة. توضح هذه المقالة طريقة للتمييز الضامة الماوس من نخاع العظام.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الضامة هي عناصر حاسمة من الاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية، وأنها هي خط الدفاع الأول ضد الغزاة الأجانب بسبب أنشطة ميكروبات قوية بهم. وتوزع على نطاق واسع في جميع أنحاء الضامة في الجسم وموجودة في الأجهزة اللمفاوية والكبد والرئتين والجهاز الهضمي والجهاز العصبي المركزي، والعظام، والجلد. بسبب إعادة تقسيم، فإنها تشارك في مجموعة واسعة من العمليات الفسيولوجية والمرضية. الضامة هي خلايا تنوعا للغاية التي هي قادرة على الاعتراف التعديلات microenvironmental والحفاظ على توازن الأنسجة. وقد تطورت العديد من مسببات الأمراض آليات لاستخدام الضامة كما أحصنة طروادة من أجل البقاء، في تكرار، وتصيب كل من البشر والحيوانات وتنتشر في جميع أنحاء الجسم. الانفجار الأخير من الاهتمام في الجوانب التطورية والجينية والبيوكيميائية والتفاعلات المضيف الممرض جددت الاهتمام العلمي فيما يتعلق الضامة. هنا، نحن تصفالإجراء لعزل وزراعة نخاع العظم الضامة من الفئران من شأنها أن توفر أعداد كبيرة من الضامة لدراسة التفاعلات المضيف الممرض وكذلك العمليات الأخرى.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وهناك جانب كبير من وظيفة البلاعم هو دورها في المناعة الفطرية والتكيفية. بسبب قدرتها على يبلعم الجسيمات الخاملة، والبكتيريا أو الطفيليات، الضامة هي خط الدفاع الأول ضد الغزاة الأجانب. مرة واحدة المنضوية، وتدهورت الميكروبات داخل phagolysosomes. الضامة أيضا إرسال إشارات لتجنيد ومستضدات موجودة على الخلايا المناعية الأخرى مثل الخلايا اللمفية تي. وتستمد من وحيدات الضامة. حيدات تنشأ في نخاع العظم من الخلايا الجذعية النخاعي والهجرة إلى الدم الطرفية والأنسجة المختلفة حيث تفرق في الضامة. يقدر أن الفأر البالغين الأصحاء يحتوي على حوالي 10 8 الضامة التي يتم توزيعها في جميع أنحاء الجسم في مختلف الأجهزة والأنسجة (الجدول 1) 1،2. عرض الضامة المظهري كبيرة والتنوع الوظيفي بسبب قدرتها على التكيف مع 3،4 المكروية بهم. وmacrop أهمالملكية الحاج هو النشاط ميكروبات، والتي تم تعريفها بواسطة قدرتها على يبلعم الميكروبات وتدميرها. يتم تعريف استجابة أكلة من خلال تفعيل الشبكات الإشارات المعقدة التي تحفزها الاتصال الميكروبية، وبالتالي، الضامة تعدل التعبير الجيني بشكل مناسب في استجابة للمؤثرات متنوعة. بعد البلعمة، يتم القضاء على الميكروبات في بنية تسمى يحلول يبلوعي، ومع ذلك، وضعت العديد من الميكروبات المسببة للأمراض استراتيجيات لتخريب وظيفة ميكروبات الضامة 5. تنوع آليات التخريب التي يتم استخدامها من قبل الأنواع الميكروبية المختلفة هو دليل على تعقيد عملية البلعمة 6 و يحلول يبلوعي نشوء حيوي. الأمراض المعدية هي المشاكل الرئيسية صحة الإنسان، والعديد من الآليات والجزيئات المشاركة في الأنشطة المضادة للميكروبات البلاعم. وعلاوة على ذلك، فإن الأهداف من الخصائص ميكروبات التي يتم اختطافها من قبل الميكروبات لا تزال مجهولة، وبالتالي، هناك هxplosion من الاهتمام في الجوانب التطورية والجينية والبيوكيميائية والتفاعلات المضيف الممرض الذي تجدد الاهتمام العلمي فيما يتعلق الضامة. حاليا، يتم الغالبية العظمى من البحوث في هذا المجال على خطوط الخلايا الضامة، والتي تختلف من الضامة الأساسي في النشاط أكلة، وإنتاج السيتوكينات وتنظيم انفجار التأكسدي. بالإضافة إلى ذلك، فهي أقل ملاءمة للفحص المجهري. للتحقيق في التفاعل الضامة، مسببات الأمراض فمن المستحسن استخدام الضامة الأولية، مثل نخاع العظم الضامة المشتقة (BMDMs)، والتي تظهر المزيد من الميزات الفسيولوجية. وعلاوة على ذلك، فمن الممكن أن يعمل على BMDMs المعدلة وراثيا، وذلك لأن هذه الضامة قد تكون معزولة مباشرة من الفئران المعدلة وراثيا و، مع توافر تقنيات جديدة مثل ترنسفكأيشن lentiviral، ملفهم الشخصي التعبير الجيني يمكن تعديلها من قبل من overexpression الجينات أو تدخل الحمض النووي الريبي. هنا، نحن تصف الإجراء لتمييز العظام الفئران مسهم في الضامة التي من شأنها توفير أعداد كبيرة من الضامة في 7 أيام وظيفية لمختلف التحاليل مثل البروتينات 7، 8 transcriptomics، يدرس الاتجار داخل الخلايا 9، ودراسات ديناميكية 10، وشاشات جينية (رني) وفحص المخدرات 11.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بيان الأخلاق

تمت الموافقة على بروتوكول للتعامل مع الحيوانات التي لدينا لجنة الأخلاقيات المؤسسية الحيوان "CONSEIL العلمي دو مركز التدريب وآخرون للبحوث الطبية التجريبية-Chirurgical" (CFREMC، تصريح المشروع 10-300٬122٬013 لاريك غيغو) من جامعة إيكس مرسيليا في الاتفاق مع قواعد من Décret رقم 87-848 من 1987/10/19. وأجريت التجارب في Faculté دي الدواء دي لا تيمون (تصريح التجريب رقم 13.385 لاريك غيغو).

1. المادية والثقافة إعداد وسائل الإعلام

  1. تعقيم الملقط اثنين، واثنين من مقص، واثنين من ريش الجراحية وقذيفة هاون ومدقة.
  2. الحصول DMEM كاملة تحتوي على 10٪ مصل العجل الجنين (FCS)، 2 مم الجلوتامين، و 100 U / البنسلين مل و 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين.
  3. تمييع 10X PBS في المياه المقطرة العقيمة للحصول على برنامج تلفزيوني 1X.
  4. الحصول على الجليد الباردة برنامج تلفزيوني 1X، DMEM كاملة الجليد الباردة، واستكمال وا DMEMrmed من إلى 37 درجة مئوية.

2. إعداد L929 Supernatants الخليوي

  1. تنمو الخلايا لنقطة التقاء L929 (عشرون 175 سم 2 قوارير) في DMEM كاملة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2.

ملاحظة: مطلوب-الكريات بلعم مستعمرة عامل تحفيز (GM-CSF) للحث على تمايز الخلايا المكونة للدم في الضامة 12. L929 الخلايا تنتج GM-CSF.

  1. في التقاء، واستبدال سائل الإعلام والثقافة مع DMEM كاملة جديدة. نقل القوارير إلى 32 درجة مئوية، 5٪ CO 2 لمدة 10 يوما.
  2. جمع وحوض سباحة وأجهزة الطرد المركزي في supernatants في 750 x ج لمدة 10 دقيقة. تجاهل الكريات الخلية.
  3. متجر supernatants في 15 مل أنابيب وتخزينها في -20 درجة مئوية.

3. نخاع العظام المستمدة من البلاعم (BMDM) إعداد

  1. 1 التضحية الماوس عن طريق خلع عنق الرحم.
    1. استخدام شفرات جراحية معقمة في كافة مراحل التجربة. تطهير الجلد مع 70٪ اليكوالحول. إجراء شق في الجزء العلوي من كل الساق الخلفية وسحب الجلد إلى أسفل نحو القدم لفضح العضلات.
    2. قطع رجليه الخلفيتين، وإزالة الجلد مع مقص العقيمة وملقط معقم. وضع الساقين داخل طبق بتري معقمة (35/10 مم) التي تحتوي على العقيمة، الجليد الباردة برنامج تلفزيوني 1X (5 مل).
    3. إزالة اللحم والعضلات التي يتم التمسك العظام مع مقص العقيمة وملقط.
  2. نقل العظام إلى، طبق بتري معقمة جديدة (35/10 مم) التي تحتوي على الجليد الباردة، العقيمة برنامج تلفزيوني 1X (5 مل). تغسل العظام مرتين مع 5 مل من الجليد الباردة، العقيمة برنامج تلفزيوني 1X.
  3. نقل العظام إلى هاون العقيمة التي تحتوي على 5 مل من الجليد الباردة، العقيمة برنامج تلفزيوني 1X.
  4. قطع الساق من عظم الفخذ في مفصل مع مقص العقيمة. سحق العظام برفق في بمدافع الهاون العقيمة التي تحتوي على 5 مل من الجليد الباردة، العقيمة برنامج تلفزيوني 1X باستخدام مدقة.
  5. جمع طاف في 15 مل أنابيب الجليد الباردة. كرر هذه الخطوة 3X.
  6. تصفية من خلال 70 ميكرومتر الخلية نايلون ستراINER لإزالة الشظايا الصلبة. أجهزة الطرد المركزي الراشح في 450 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  7. تجاهل بلطف طاف. فصل بيليه في 10 مل الدم الحمراء العازلة تحلل الخلية لمدة 30 ثانية. إضافة 20 مل من الجليد الباردة، DMEM كاملة.

ملاحظة: الهدف من هذه الخطوة هو إزالة تلويث خلايا الدم الحمراء، وبالتالي، يجب أن يتم تنفيذ هذه الخطوة في غضون 2 دقيقة لتجنب تغيير الخلية المكونة للدم من الدم الحمراء العازلة تحلل الخلية.

  1. أجهزة الطرد المركزي في 450 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. تجاهل بلطف طاف. فصل بيليه في 20 مل DMEM كاملة التي تم تحسنت إلى 37 درجة مئوية.
  2. نقل الخلايا إلى فصلها 2 أطباق بتري (100/20 مم). احتضان لهم لمدة 4 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  3. جمع supernatants في 50 مل أنابيب في درجة حرارة الغرفة. تجاهل الأطباق التي تحتوي على الضامة المقيمين.

ملاحظة: الهدف من هذه الخطوة هو القضاء على نخاع العظام المقيمينالضامة ث من خلال قدرتها على التمسك البلاستيك المعالجة الثقافة. ويمكن استخدام هذه الضامة المقيم في تجارب أخرى.

  1. أجهزة الطرد المركزي في supernatants جمعها في 450 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. تجاهل طاف.
  2. فصل بلطف بيليه في 10 مل DMEM كاملة تحتوي على 15٪ L929 خلية طاف. تحديد الخلايا خلال 40 ميكرومتر الخلية النايلون مصفاة.
  3. استرداد الترشيح. إضافة الترشيح جمعت (10 مل) إلى 140 مل DMEM كاملة التي تم تستكمل مع 15٪ L929 سائل الاعلام الخلية.
  4. توزيع 10 مل من تعليق خلية في طبق بتري (15 أطباق بتري، 100/20 ملم). احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2.
  5. تنمو الخلايا لمدة 3 أيام
  6. إضافة 10 مل DMEM كاملة التي تم تستكمل مع 15٪ L929. احتضان الخلايا لمدة 4 أيام إضافية.

ملاحظة: مراقبة نمو الخلايا بشكل دوري مع مجهر مقلوب (الخطوات 3،14-3،16). وسوف تكون ملتصقة الضامةلوحظ بعد 3 أيام من الثقافة.

4. BMDMs الحصاد

  1. إزالة طاف. غسل BMDMs 2 مرات مع DMEM كاملة
  2. إضافة 5 مل DMEM كاملة التي تم تحسنت إلى 37 درجة مئوية. فصل BMDMs عن طريق كشط بلطف مع شرطي المطاط.
  3. جمع BMDMs في 50 مل أنابيب الطرد المركزي في 450 وx ج لمدة 10 دقيقة. فصل بلطف الكريات خلية في 20 مل DMEM كاملة.
  4. عد BMDMs بحضور الأزرق التريبان (ينبغي مراعاة أي وفيات أكثر من 10٪).

ملاحظة: بشكل عام، ويتم الحصول على حوالي 6-7.5 × 10 7 الضامة من 15 أطباق بتري (100/20 مم) الضامة. هناك ما يقرب من 4-5 × 10 6 الضامة / طبق بتري (100/20 مم).

  1. إعداد BMDMs كما هو مطلوب للتجربة. بعد 16 ساعة في وسائل الإعلام كاملة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2، وسوف تلتزم الضامة مرة أخرى إلى الدعم.

5. تخزين BMDMs

  1. جمع BMDMs معزولة (الخطوة 4.3). أجهزة الطرد المركزي في 450 x ج لمدة 10 دقيقة. ملاحظة: قد يتم تجميد BMDMs في النيتروجين السائل.
  2. كريات الخلية resuspend في تجميد وسائل الإعلام التي تتكون من 10٪ DMSO و 90٪ FCS في تركيز النهائي من 4 × 10 6 خلية / مل وماصة 1 مل في كل أمبولة.
  3. تجميد الخلايا بمعدل التبريد من 1 درجة مئوية / دقيقة. بعد 24 ساعة، ونقل أمبولة إلى حاوية النيتروجين السائل لتخزين على المدى الطويل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كان الهدف من هذه الطريقة للحصول بسهولة أعداد كبيرة من الضامة في الأيام القليلة القادمة. ويتضح إعداد خلية نخاع العظم في الشكل 1. تم جمع العظام من الساق الخلفية وحطموا في بمدافع الهاون. مرة واحدة تم إزالة الضامة المقيمين من إعداد خلية نخاع العظم، وحضنت خلايا نخاع العظام مع GM-CSF (يوم 0). بعد 3 أيام، والخلايا، والتي كانت مستديرة وغير ملتصق قبل الثقافة، وتبدأ في التمايز إلى الضامة والالتزام (الشكل 1A). تحليل الخلوي باستخدام F4/80 وكشف علامات HLA-DR أ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بروتوكول الموصوفة هنا تفاصيل طريقة لانتاج أعداد كبيرة من BMDMs. BMDM هي الخلايا الأولية ولها وظيفة بيولوجية وخصائص متباينة من الضامة وحيدات لأن هناك نضجا، على النقيض من خطوط الخلايا بلعم، والتي هي غير ناضجة. BMDMs يمكن استخدامها لفحص الجيني (رني)، وفحص المخدرات، والدراسات الفنية ودراسات التفاعل المضيف الممرض والعديد من المجالات الأخرى من التحقيق.

الإجراء الواردة في هذه الوثيقة هي بسيطة جدا ولا تتطلب أي معدات متخص...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا توجد صراعات أعلن في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل من قبل CNRS (PICS 2012-2014 لEG) وعن طريق منحة من REGIONE كامبانيا (LR N.5، 2002/03/28 إلى جيوفانا موتولا). فيليبو كونتي هو زميل في مؤسسة التعاون'' Infectiopole سود العلمي.'' نيكولا Boucherit هو زميل وزارة الفرنسي للأبحاث والتكنولوجيا. وكانت مصادر التمويل أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليل البيانات، وقرار نشر أو إعداد المخطوطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
DMEMGibco Life Technologies21969-035
مصل عجل الجنينGibco Life Technologies10270
البنسلين / الستربتومايسينجيبكو لايف تكنولوجيز15070
الجلوتامينجيبكو لايف تكنولوجيز25030-024
PBS (10x)LonzaBEM515F
تحلل خلايا الدم الحمراء عازلةSigmaR7757
مصفاة خلية 70 مو ؛ م نايلونBD Falcon352350
مصفاة خلية 40 مو ؛ م نايلونBD Falcon352340
50 مل أنابيبأي موردغير / أ
أنابيب 15 ملأي موردغير / أطباق
بتري (100/20 مم)أي موردغيرمعالجة ثقافة
(35/10 مم)أي موردغير
متاح صحن بتري متاح

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rutherford, M. S., Witsell, A., Schook, L. B. Mechanisms generating functionally heterogeneous macrophages: chaos revisited. J. Leukocyte Biol. 53, 602-618 (1993).
  2. Van Furth, R. Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates. Gallin, J. I., Goldstein, I. M., Snyderman, R. 112, Raven Press. 325-336 (1992).
  3. Adams, D., Halmiton, T. Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates. Gallin, J. I., Goldstein, I. M., Snyderman, R. 112, Raven Press. 325-336 (1992).
  4. Morris, L., Graham, C. F., Gordon, S. Macrophages in haemopoietic and other tissues of the developing mouse detected by the monoclonal antibody F4/80. Development. 112, 517-526 (1991).
  5. Haas, A. The phagosome: compartment with a license to kill. Traffic. 8, 311-330 (2007).
  6. Underhill, D. M., Ozinsky, A. Phagocytosis of microbes: complexity in action. Annu. Rev. Immunol. 20, 825-852 (2002).
  7. Castagna, A., Polati, R., Bossi, A. M., Girelli, D. Monocyte/macrophage proteomics: recent findings and biomedical applications. Expert Rev. Proteomics. 9, 201-215 (2012).
  8. Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. L. Macrophage polarization in bacterial infections. J. Immunol. 181, 3733-3739 (2008).
  9. Barry, A. O., et al. Impaired stimulation of p38alpha-MAPK/Vps41-HOPS by LPS from pathogenic Coxiella burnetii prevents trafficking to microbicidal phagolysosomes. Cell Host Microbe. 12, 751-763 (2012).
  10. Henry, R. M., Hoppe, A. D., Joshi, N., Swanson, J. A. The uniformity of phagosome maturation in macrophages. J. Cell Biol. 164, 185-194 (2004).
  11. Sundaramurthy, V., et al. Integration of Chemical and RNAi Multiparametric Profiles Identifies Triggers of Intracellular Mycobacterial Killing. Cell Host Microbe. 13, 129-142 (2013).
  12. Boltz-Nitulescu, G., et al. Differentiation of rat bone marrow cells into macrophages under the influence of mouse L929 cell supernatant. J. Leukocyte Biol. 41, 83-91 (1987).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

LPS

مقالات ذات صلة