تحديد البروتين البروتين التفاعل في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; رؤساء الكبار حسب جنبا الى جنب الانجذاب تنقية (وات)

Xiaolin Tian; Mingwei Zhu; Long Li; Chunlai Wu

doi:10.3791/50968

يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تحديد البروتين البروتين التفاعل في

13.4K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/50968

⸱

ديسمبر 5, 2013

Xiaolin Tian¹ , Mingwei Zhu¹ , Long Li¹ , Chunlai Wu¹

¹Neuroscience Center of Excellence, Louisiana State University Health Sciences Center

في هذه المقالة

ملخص

ذبابة الفاكهة تشتهر التلاعب وراثية قوية، ولكن ليس لمدى ملاءمتها من التحليل المتعمق البيوكيميائية. هنا نقدم الداخلي القائم على TAP لتحديد الشركاء التفاعل من أي بروتين من الفائدة من الدماغ الطاير. يمكن لهذا الإجراء أن تؤدي إلى طرق جديدة للبحث.

الملخص

جعلت شاشات الجينية التي أجريت باستخدام ذبابة الفاكهة السوداء البطن (ذبابة الفاكهة) العديد من الاكتشافات بارزة في تقدم العلوم البيولوجية. ومع ذلك، تم استكشاف استخدام شاشات البيوكيميائية التي تهدف إلى توسيع نطاق المعرفة المكتسبة من التحليل الجيني في الآونة الأخيرة فقط. نحن هنا تصف طريقة لتنقية معقدة البروتين الذي الزميلة مع أي بروتين من الفائدة من رؤساء ذبابة الكبار. هذا الأسلوب يستفيد من نظام ذبابة الفاكهة GAL4/UAS للتعبير عن البروتين الطعم تنصهر مع علامة جنبا الى جنب الانجذاب تنقية (وات) في الخلايا العصبية ذبابة في الجسم الحي، ومن ثم تطبق جولتين من تنقية باستخدام إجراء TAP مماثلة لتلك التي أنشئت أصلا في الخميرة ¹ لتنقية معقدة البروتين التفاعل. في نهاية هذا الإجراء، يتم الحصول على خليط من البروتين المجمعات متعددة الذي يمكن تحديده من خلال مطياف الكتلة الهويات الجزيئية. سوف المصادقة على البروتينات مرشح الاستفادة من صesource وسهولة أداء الخسارة من وظيفة الدراسات في الذباب. نهج مماثلة يمكن تطبيقها على الأنسجة ذبابة أخرى. ونحن نعتقد أن الجمع بين التلاعب الجيني وهذا النهج البروتين في النظام النموذجي ذبابة يحمل إمكانات هائلة لمعالجة المشاكل الأساسية في مجال بيولوجيا الأعصاب وخارجها.

المقدمة

تحديد المسارات الجزيئية أو الشبكات التي تتوسط عملية بيولوجية معينة هي واحدة من الأهداف النهائية للبحوث الطبية الحيوية. يطير علماء الوراثة قد تعتمد اعتمادا كبيرا على الوراثة إلى الأمام، وخاصة معدل شاشات الجينية (سواء محسن وشاشات القامع)، لتحديد العوامل التي تعمل معا، بالتوازي مع، أو المنبع أو المصب من الجينات في المصالح. ومع ذلك، وشاشات الوراثة إلى الأمام في كثير من الأحيان تفشل مرات لتحديد الجينات الأساسية التي، عندما تحور، يسبب الفتك في مراحل النمو المبكرة، أو الجينات مع التكرار وظيفية والتعويض الذي يسبب فقدان وظيفة العيوب الخفية التي هي سكنت الشباك فقط. طريقة واحدة للتغلب على هذه الصعوبة هو للكشف عن مباشرة تفاعلات البروتين البروتين. لأكثر من عقد من الزمن، قائمة متزايدة من أساليب الكيمياء الحيوية، بما في ذلك الخميرة اثنين الهجين، وعرض فج والكيميائية عبر ربط، المشارك IP، جنبا الى جنب الانجذاب تنقية (وات)، الخ. وقد استخدمت للتحقيق في البروتينتفاعلات البروتين. كل من هذه الأساليب لديها مجموعة من نقاط القوة والضعف في ما يخص الحساسية والنوعية. فيما بينها، ويسمح أسلوب TAP للكشف عن التفاعل المادي في ظل ظروف شبه الفسيولوجية، ويحافظ على خصوصية والاتساق ² ويشمل القدرة على تمتد إلى الإنتاجية العالية يحلل ^3،4.

طريقة TAP وضعت أصلا من قبل الزملاء في الخميرة Rigautand ^1. في هذه الطريقة، يتم التعبير عن بروتين في المصالح مع علامة TAP. علامة TAP تؤوي اثنين من المستقلين ملزم تقارب المجالات: بروتين A المجال الذي يربط مفتش ومجال كالمودولين ملزم. يتم فصل اثنين من المجالات من قبل TEV (التبغ إحفر الفيروسات) موقع الانقسام. مثل هذا الجمع يسمح للجولتين مستقلة عن التنقيات تقارب بما فيه الكفاية للحد من الارتباطات غير محددة وإثراء الارتباطات محددة ^1. لهذا المثال، الأسلوب TAP هو metho قوية جداد لتحديد التفاعلات في الجسم الحي من بروتين معين، على الرغم من overexpressing البروتين الخارجية قد جعلها أكثر عرضة للربط مع البروتينات التي تفعل عادة يست معقدة مع نظيرتها المحلية. منذ تطورها، وقد تم تطبيق الأسلوب TAP في العديد من الأنظمة الأخرى، بما في ذلك المستندة إلى خلية ثقافة النظم ^5،6 وغيرها من النظم في الجسم الحي نموذج ^6-9. نحن هنا وصف التكيف للأسلوب TAP في ذبابة الفاكهة. علينا أولا توليد pUAST-NTAP وpUAST-CTAP ناقلات لتسهيل الاستنساخ والانصهار للعلامة TAP إما إلى N-أو C-محطة من الجينات في المصالح. ثم يتم أعرب الموسومة TAP UAS التحوير في الجهاز العصبي تحت سيطرة السائق GAL4 العصبية ^10. المقبل، وسيتم جمع عدد كبير من رؤساء ذبابة الكبار، التي لديها نسبة عالية من الخلايا العصبية وسهلة لفصل من أجزاء أخرى من الجسم بعد تجميد بناء على حجم الخلافات. رؤساء الكبار هي المتجانس وتطهيرها بcentrifugations متتابعة ذ، وطاف يخضع لإجراء TAP هو موضح أدناه.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. توليد UAS-الموسومة TAP الذباب المعدلة وراثيا

توليد pUAST-الموسومة TAP بنيات الحمض النووي.
1. تقرر أي جانب (N-أو C-محطة) من البروتين الطعم يجب أن تنصهر العلامة TAP ل، على أساس هيكل / وظيفة البروتين. انظر المناقشة لمزيد من التفاصيل.
2. Subclone المنطقة الترميز كدنا] من الجين من الفائدة في مواقع الاستنساخ متعددة (MCS) من pUAST-NTAP أو pUAST-CTAP ناقلات لتوليد N-أو C-محطة الموسومة الجينات المحورة UAS-TAP، على التوالي. انظر الشكل 1 لخرائط مفصلة وقابلة للاستخدام مواقع التقييد وإطارات القراءة.
توليد UAS-الموسومة TAP الذباب المعدلة وراثيا.
1. تولد الذباب المعدلة وراثيا باستخدام البروتوكولات القياسية التالية ف بوساطة عنصر الإدراج ^11. تتوفر تجاريا عدد من الخدمات الحقن.
2. عبور العصبية السائق GAL4 (أي BG380-GAL4) إلى كل سطر المعدلة وراثيا الفردية وتحديد مستويات بروتين تعبيركل سطر من قبل لطخة غربية (مع البيروكسيداز مكافحة البيروكسيداز الضد) و / أو المناعية (مع مكافحة TAP الضد). بشكل عام، ينصح خط المعدلة وراثيا مع مستوى التعبير البروتين الذي هو على مقربة من البروتين الذاتية لإجراءات TAP. انظر المناقشة لمزيد من التفاصيل.
3. PerformGAL4/UAS-based تجارب الانقاذ لتأكيد وظيفة الجينات المحورة الموسومة TAP إذا كانت الخسارة من وظيفة المسوخ من الجينات ذات الاهتمام المتاحة. اختيار التحوير التي يمكن أن تنقذ كثيرا من الظواهر متحولة للتجارب TAP التالي.

2. تحضير العينات لإجراء TAP

توليد مخزون ذبابة الذي يحمل كلا من السائق GAL4 العصبية (مثل BG380-GAL4) واختار التحوير الموسومة TAP من أجل تخفيف توسع عينات الطاير. جمع السلالات F1 السائق GAL4 وعبر UAS التحوير في حالات نادرة عندما يتسبب مزيج أعلاه البقاء والنمو غير مؤات.
جمع العينات الصغيرة وتحسين حالة تحلل لsolubilizing البروتين الموسومة TAP.
1. جعل سلسلة من مخازن تحلل باستخدام مزيج من المنظفات غير أيوني NP-40 (0.1-1٪)، NaDOC (0.1-1٪) وتريتون X-100 (،05-،5٪). انظر الجدول رقم 1 والمناقشة لمزيد من المعلومات.
2. على رأس وسادة CO2، استخدام # 5 ملقط لتشريح 20 رؤساء الكبار من التحوير TAP معربا عن الذباب وجمعها في أنبوب 1.5 مل لاختبار كل حالة تحلل العازلة.
3. إضافة 100 UL العازلة اختبار تحلل إلى أنبوب والتجانس رؤساء بواسطة التمسيد صعودا وهبوطا مع مدقة البلاستيك، ثم يضاف اختبار عازلة آخر 100 UL.
4. تدور المحللة في الرأس 21،500 x ج لمدة 10 دقيقة (4 ° C)، وفصل طاف بيليه وبعد الطرد المركزي. إضافة 25 شباط 2X العازلة تحميل SDS لبيليه و10 ماي 4X العازلة تحميل SDS إلى 30 ماي من طاف على التوالي.
5. غلي العينتين لمدة 5 دقائق وتحليلها جنبامن جانب باستخدام SDS-PAGE واللاحقة البقعة الغربية مع الأجسام المضادة PAP. تحديد الذوبان من نسبة مستويات TAP-البروتين في طاف مقابل بيليه.
تحضير العينة في نطاق واسع
1. توسيع وجمع الذباب الكبار.
  1. توسيع المخزون neuronal-GAL4/UAS-TAP-transgene في زجاجات والوجه الزجاجات وتستخدم كل 3 أيام حتى التراكمي 250 زجاجات لجمع.
  2. الذباب الكبار جمع 1-3 أيام القديمة إلى 50 مل أنابيب مخروطية، ووضع أنبوب في النيتروجين السائل على الفور لتجميد عميق الذباب. تخزين الذباب في الفريزر -80 درجة مئوية. لاحظ أن حجم الذباب يجب أن لا تتجاوز 2/3 من أنبوب 50 مل.
2. جمع رؤساء ذبابة (تنفيذ هذه الخطوة على رأس الثلج الجاف المجفف).
  1. اخراج المناخل prechilled وهاون ومدقة من -80 درجة مئوية الفريزر ووضعها على الثلج الجاف، من الناحية المثالية داخل دلو الثلج الكبيرة. كومة اثنين من الولايات المتحدة الأمريكية مناخل الاختبار القياسية مع رقم 25 على الأعلى الإلكترونية ورقم 40 في الجزء السفلي.
  2. أخذ الذباب المجمدة خارج وإفلاتها في النيتروجين السائل والحفاظ على الذباب في هناك لمدة 10 دقيقة. دوامة أو تهزه بقوة أنابيب لكسر رؤساء والساقين، وأجنحة من الجثث.
  3. صب الخليط في منخل أعلى، ثم يهز المناخل بقوة حين عقد كل من المناخل معا. بعد غربلة، فإن الهيئات البقاء على المنخل العلوي، ويطير سيتم الاحتفاظ الرؤوس على غربال القاع، وسوف الساقين، وأجنحة، وغيرها من الحطام يسقط على الثلج الجاف. فصل اثنين من المناخل وبعناية نقل رؤساء يطير إلى هاون الباردة.
3. التجانس رؤساء ذبابة
  1. على قمة الثلج الجاف، طحن رؤساء مع هاون ومدقة لجزيئات مسحوق، ثم نقل إلى مسحوق الزجاج 15 مل Dounce الأنسجة المطحنة التي كانت prechilled على الجليد.
  2. قياس أوزان طاحونة قبل وبعد سكب العينة رئيس في ذلك، ومن ثم حساب مدى عصيدة رئيسلو يزن. وهناك ما مجموعه 6-15 غرام من رؤساء ذبابة تكون كافية لكل تجربة TAP تعديل وفقا لذلك إلى مستويات التعبير من البروتين. إضافة 15 مل من العازلة التجانس الجليد الباردة (تحلل العازلة الأمثل في الخطوة 2.2) إلى مسحوق ثم السكتة الدماغية مع مدقة تخليص كبير حتى أنه من السهل للمدقة للذهاب إلى أعلى وأسفل. الحفاظ على طاحونة الزجاج على الجليد في جميع الأوقات.
4. إعداد طاف لTAP
  1. نقل جناسة لأنبوب الطرد المركزي عالية السرعة وتدور لمدة 20 دقيقة في ~ 50،000 x ج (4 درجات مئوية). نقل طاف إلى عالية السرعة أنبوب الطرد المركزي الجديدة وتكرار الطرد المركزي مرة أخرى.
  2. نقل طاف إلى أنبوب نابذة فائقة السرعة وإجراء 40 دقيقة ~ 250،000 x ج تدور لمزيد من مسح طاف. طاف مستعدة للإجراءات تنقية تقارب جنبا إلى جنب بعد تنبيذ فائق.

3. TAP تنقية

وقد استمدت الأقسام التالية من المختبر TAP سيرافين protocol ¹² (http://web.as.uky.edu/Biology/faculty/rymond/BIO%20510/Bertran%20Seraphin%27s%20TAP%20page.pdf )

أداء مفتش حبة تنقية تقارب
1. إعداد مفتش sepharose و حبة في حين يتم طرد العينات. غسل 400 ميكرولتر 3X حبة مفتش في أنبوب فالكون 15 مل مع 10 مل الباردة مفتش غسل العازلة. لكل غسل، صخرة الأنبوب برفق لمدة 2 دقيقة، ثم تدور باستمرار حبات في 1،000 x ج لمدة 2 دقيقة أخرى. في نهاية غسل ثالث، وإزالة العازلة وترك فقط حبات في الأنبوب.
2. نقل بعناية طاف تطهيرها (~ 15 مل) في أنبوب 15 مل تحتوي على حبات مفتش. احتضان حبات ومزيج المحللة الدماغ في 4 º C على nutator لمدة 2 ساعة.
3. إعداد عمود الصغيرة نظيفة وفارغة مع حوالي 15 مل الحجم الإجمالي في غرفة باردة. تحميل الخليط حبة مفتش بصب المزيج بشكل مطرد في العمود؛ ليس محاولة لاعتراض أيفقاعات الهواء داخل العمود. السماح حبات لتسوية في العمود والمخزن المؤقت لاستنزاف ببطء عن طريق تدفق الجاذبية.
4. غسل العمود تماما مع 10 مل من البرد العازلة غسل مفتش بعد كل من المحللة الدماغ قد تدفقت من خلال العمود مفتش تسويتها. تكرار غسل 2X. ملاحظة: لا تدع حبة الجافة في الهواء.
أداء TEV انشقاق
1. بعد غسل الثالث، وغسل العمود مرة أخرى مع 10 مل TEV العازلة الانقسام. هذه الخطوة تعد حبة مفتش أن sequestrates مجمع الطعم لTEV انشقاق.
2. الحق قبل آخر قطرة من العازلة TEV على وشك الخروج بالتنقيط، ووضع غطاء على الجزء السفلي من العمود لمنع التدفق، إضافة 1.3 مل TEV العازلة التي تحتوي على 130 وحدة من إنزيم TEV إلى العمود، ثم سقف آمن أعلى العمود. تأكد من اغلاق العمود جيدا في كلا الجانبين.
3. تدوير العمود في 18 درجة مئوية لمدة 2 ساعة للسماح للانزيم TEV ليلتصق الببتيد في موقع TEV والافراج عن بروتين معقد مبادرة الخوذ البيضاءلو ترك وراء بروتين الببتيد نطاق منضمة إلى الخرز ومفتش sepharose و.
أداء كالمودولين حبة تنقية تقارب
1. إعداد حبات كالمودولين حين يتم تحضين حبات مفتش مع انزيم TEV. تغسل حبات 200 ميكرولتر كالمودولين في 15 مل فالكون 3X أنبوب، في كل مرة مع 10 مل من كالمودولين الباردة العازلة ملزمة. لكل غسل، صخرة بلطف الأنبوب لمدة 2 دقيقة على nutator، ثم تدور باستمرار حبات في 1،000 x ج لمدة 2 دقيقة. في نهاية غسل ثالث، واخراج كل المخزن المؤقت وترك فقط حبات في الأنبوب.
2. في نهاية الحضانة TEV (الخطوة 3.2.3)، والعودة العمود مفتش مرة أخرى إلى الغرفة الباردة وضعه بشكل مستقيم. اسمحوا حبات تسوية لمدة 10 دقيقة.
3. إزالة الغطاء العلوي ثم السفلي الغطاء، ثم جمع 1.3 مل TEV المنتج الانقسام في أنبوب فالكون 15 مل. السماح للاستنزاف عازلة تماما. إضافة مبلغ إضافي قدره 200 TEV العازلة ميكرولتر إلى العمود على طرد حجم القتلى من العمود، وجمع ومنخفض خارج في نفس الأنبوب.
4. إضافة 4.5 مل من كالمودولين العازلة و 4.5 ميكرولتر 1 M و CaCl ₂ ملزما للانشقاق المنتج 1.5 مل TEV جمعت أعلاه. وو CaCl ₂ يعمل على عاير على EDTA في المخزن المؤقت TEV. نقل 6 مل الخليط إلى أنبوب يحتوي على حبات كالمودولين وتدوير الأنبوب في 4 º C على nutator لمدة 1 ساعة.
5. إنشاء عمود الصغيرة نظيفة وفارغة أخرى مع حوالي 10 مل الحجم الكلي في غرفة باردة. تحميل الخليط حبة كالمودولين إلى العمود والسماح لها استنزاف بفعل الجاذبية.
6. عندما تدفقت كل حل من خلال العمود كالمودولين استقر، وغسل العمود مرتين، ولكل منها 10 مل من كالمودولين الباردة العازلة ملزمة. ملاحظة: تجنب إزعاج الخرز كالمودولين ومحاولة للحفاظ على السطح من الخرز شقة ممكن أثناء الغسيل.
أزل مجمع الطعم من العمود كالمودولين.
الحق بعد الغسيل، أزل العمود كالمودولين مع خمسة كسور 200 ميكرولتر Calmodu الباردةلين شطف العازلة. لكل جزء، إضافة بلطف 200 ميكرولتر من شطف العازلة إلى العمود وجمع شطافة مع علامة 1.5 مل أنبوب إيبندورف. كرر هذه 4X.
تحليل بروتين معقد بواسطة SDS-PAGE
1. اتخاذ قسامة صغيرة من كل من الكسور خمسة (حوالي 30 ميكرولتر) وإضافة SDS العازلة تحميل. تغلي العينات لمدة 5 دقائق وتحميل العينات جنبا إلى جنب مع الواسمات الجزيئية البروتين في الانحدار (4-15٪) هلام SDS-PAGE.
2. بعد عينات وحلها بالكامل في هلام، ووقف الكهربائي وصمة عار الجل مع أي حساسية الغروية إجراءات تلطيخ Coomassie مقرها G-250-مثل 'الفضة الأزرق' تلطيخ ^13. الفضة تلطيخ هو اختياري ولكن ليس الأفضل لأنها ليست متوافقة تماما مع لاحقة تحليل الطيف الكتلي. تخزين ما تبقى من شطافة في الفريزر -80 ° C لمزيد من التحليل مثل مطياف الكتلة للكشف عن هويات الجزيئي للبروتين معقد المنقى. حد ذاتهاالمناقشة الإلكترونية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

نحن هنا لشرح الجهود التي نبذلها في تحديد البروتينات موقع HighWire-التفاعل في الدماغ الطاير. موقع HighWire (HIW) والفقاريات واللافقاريات المتماثلات لها هي ligases اليوبيكويتين الضخمة التي تنظم تطوير وإصلاح الجهاز العصبي ^14. أنها تشترك في عدد من المجالات الوظيفية حفظا للغاية. ومع ذلك، أفعالهم الجزيئية ليست واضحة تماما. العمل المنجز في دودة، ويطير وأدى الماوس إلى نموذج العمل الحالي الذي يعمل بمثابة يغاز HIW E3 وكما بروتين السقالات لتسهيل تشكيل مجمع ubiquitination متعددة ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يقدم طريقة تنقية تقارب جنبا إلى جنب (وات) بروتوكول تنقية المزدوجة التي تسمح للعزلة وإثراء المجمعات البروتين من خلال خطوتين مستقلة تنقية تقارب. ولا يقتصر تصميم علامة TAP إلى ما يرد في هذا البروتوكول، والمجالات الأخرى ملزمة البروتين والزخارف تنطبق أيضا إذا تم تعديل شروط العازلة وفقا لذلك. وخير مثال على TAP به الآخر هو علامة GS-TAP، وهو مزيج من بروتين G وعزر ملزم streptavidin، الذي صممه مجموعة جوليو Superti-Furga الرامية إلى تنقية معقدة البروتين في خطوط خلايا الثدييات مثقف ^18.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

نشكر EUROSARF لإرسال لنا الخميرة TAP البلازميدات التعبير. ونحن ممتنون أيضا للحصول على مساعدة من التحرير ريان Labadens. وأيد هذا العمل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة / NINDS (R01NS070962) لCW

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي
غربال الاختبار القياسي للولايات المتحدة الأمريكية رقم 25	فيشر سيانتيفيك	04-881-18
غربال الاختبار القياسي للولايات المتحدة الأمريكية رقم 40	فيشر ساينتفوليك	04-881-21
؛ مطاحن مناديل كونتس داونتس 15 مل	كيمبل تشيس	885300-0015
حبات سيفاروز IgG	فارماسيا	17-0969-01
عمود اقتصادي 0.7 سم × 20 سم	Bio-Rad	737-4721
عمود اقتصادي 0.5 سم × 15 سم	Bio-Rad	737-4716
حبات كالمودولين	ستراتاجين	214303
كورس هاون ومدقة	CoorsTek	60311
AcTEV Protease	Invitrogen	12575-015
مثبط		Roche 11836153001
مثبط البروتياز Mix	Sigma	P8340

كوكتيل البروتياز

المراجع

Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat. Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
Collins, S. R., et al. Toward a comprehensive atlas of the physical interactome of Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Proteomics. 6, 439-450 (1074).
Gavin, A. C., et al. Proteome survey reveals modularity of the yeast cell machinery. Nature. 440, 631-636 (2006).
Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
Forler, D., et al. An efficient protein complex purification method for functional proteomics in higher eukaryotes. Nat. Biotechnol. 21, 89-92 (2003).
Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry. Dev. Dyn. 232, 827-834 (2005).
Li, Y. The tandem affinity purification technology: an overview. Biotechnol. Lett. 33, 1487-1499 (2011).
Volkel, P., Le Faou, P., Angrand, P. O. Interaction proteomics: characterization of protein complexes using tandem affinity purification-mass spectrometry. Biochem. Soc. Trans. 38, 883-887 (2010).
Xu, X., et al. The tandem affinity purification method: an efficient system for protein complex purification and protein interaction identification. Protein Expr. Purif. 72, 149-156 (2010).
Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
Bachmann, A., Knust, E. The use of P-element transposons to generate transgenic flies. Methods Mol. Biol. 420, 61-77 (2008).
Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
Candiano, G., et al. Blue silver: a very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).
Tian, X., Wu, C. The role of ubiquitin-mediated pathways in regulating synaptic development, axonal degeneration and regeneration: insights from fly and worm. J. Physiol. , (2013).
Wu, C., Wairkar, Y. P., Collins, C. A., DiAntonio, A. Highwire function at the Drosophila neuromuscular junction: spatial, structural, and temporal requirements. J. Neurosci. 25, 9557-9566 (2005).
Wu, C., Daniels, R. W., DiAntonio, A. DFsn collaborates with Highwire to down-regulate the Wallenda/DLK kinase and restrain synaptic terminal growth. Neural Dev. 2, 16(2007).
Tian, X., Li, J., Valakh, V., DiAntonio, A., Wu, C. Drosophila Rae1 controls the abundance of the ubiquitin ligase Highwire in post-mitotic neurons. Nat. Neurosci. 14, 1267-1275 (2011).
Burckstummer, T., et al. An efficient tandem affinity purification procedure for interaction proteomics in mammalian cells. Nat. Methods. 3, 1013-1019 (2006).
Kyriakakis, P., Tipping, M., Abed, L., Veraksa, A. Tandem affinity purification in Drosophila: the advantages of the GS-TAP system. Fly. 2, 229-235 (2008).
Bailey, D., Urena, L., Thorne, L., Goodfellow, I. Identification of protein interacting partners using tandem affinity purification. J. Vis. Exp. (60), e3643(2012).
Wu, Y., et al. A Drosophila model for Angelman syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 12399-12404 (2008).
Liao, L., McClatchy, D. B., Yates, J. R. Shotgun proteomics in neuroscience. Neuron. 63, 12-26 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

نظام GAL4/UAS تنقية الغلوبولين المناعي G قطع TEV تنقية الكالمودولين مطيافية الكتلة محلل رأس الذبابة الطرد المركزي الفائق