يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تصور هيولي باطني شبكية النطاقات الفرعية في الخلايا المستزرعة

13.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/50985

⸱

فبراير 18, 2014

 ,  ,  , 
1Fondazione Filarete, 2Department of Biotechnology and Translational Medicine, University of Milan, 3Neuroscience Institute, National Research Council (CNR), 4Department of Health Science, "Magna Graecia" University of Catanzaro

في هذه المقالة

ملخص

نحن تصف النهج التصوير التي نستخدمها لتحقيق توزيع والتنقل من البروتينات الفلورية transfected المقيمين في الشبكة الإندوبلازمية (ER) عن طريق التصوير متحد البؤر الخلايا الحية. نحن أيضا تحليل ultrastructurally تأثير التعبير عنها على بنية هذا الحيز التحت خلوية.

الملخص

الدهون والبروتينات في الخلايا حقيقية النواة يتم تبادل مستمر بين المقصورات الخلية، على الرغم من أن هذه تحتفظ تكوينها مميزة وظائف على الرغم من مرور interorganelle الجزيئية مكثفة. التقنيات الموضحة في هذه الورقة هي وسيلة قوية لدراسة البروتين والدهون التنقل والاتجار في الجسم الحي في بيئتهم والفسيولوجية. مضان الانتعاش بعد photobleaching من (FRAP) وخسارة في مضان photobleaching من (FLIP) وتستخدم على نطاق واسع تقنيات التصوير الخلية الحية لدراسة الاتجار داخل الخلايا عن طريق إكسو التقامي المسار، والاستمرارية بين العضيات أو subcompartments، وتشكيل مجمعات البروتين، والبروتين التعريب في microdomains الدهون، والتي يمكن ملاحظتها في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية. القيود المفروضة على هذه المناهج هي أساسا نتيجة لاستخدام البروتينات الانصهار الفلورسنت، وتشمل سلبياتها المحتملة مصطنعة الإفراط في التعبير عنايون في الخلايا وإمكانية الاختلافات في للطي والتعريب من البروتينات الموسومة والأم. أخيرا، وكما الحد من قرار المجهر الضوئي (حوالي 200 نانومتر) لا يسمح التحقيق في هيكل غرامة من ER أو subcompartments المحددة التي يمكن أن تنشأ في الخلايا تحت الضغط (أي نقص الأكسجة، وإدارة المخدرات، والإفراط في التعبير من عبر الغشاء البروتينات ER المقيم) أو في ظل ظروف مرضية، ونحن الجمع بين التصوير الخلية الحية من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل مثقف مع التركيبية يحلل على أساس نقل الإلكترون المجهري.

المقدمة

اكتشاف بروتين الفلورية الخضراء (GFP) ومشتقاته الطيفية، وتطور مواز من مضان المجهري، وفتحت آفاقا جديدة تماما للتحقيق في سلوك البروتين في الخلايا. تقنيات مثل الانتعاش بعد مضان photobleaching من (FRAP) وخسارة في مضان photobleaching من (FLIP)، والتي هي ممكنة بسبب القدرة الذاتية للfluorophores لإطفاء مضان بهم تحت إضاءة مكثفة، تقوم على مبائر التصوير الخلية الحية واستخدام transfected البروتينات الفلورية الانصهار 1-3. وتستخدم على نطاق واسع لتقييم ليس فقط توطين البروتينات، ولكن أيضا قدرتهم على التنقل والنقل الحويصلي، والتي يمكن أن تكشف عن أدلة مهمة بشأن وظيفتها 4.

ميزة فريدة من الخلايا حقيقية النواة هو وجود حجرات داخل الخلايا التي تحتوي على الدهون والبروتين التراكيب محددة. على الرغم من العضيات هي isolat جسدياإد، فإنها تحتاج إلى التواصل مع بعضهم البعض وتبادل المكونات الجزيئية من أجل الحفاظ على التوازن الخلوية. تضمن مسار إفرازية أن البروتينات والدهون توليفها في ER وصول إلى الوجهة النهائية الصحيحة التي تمارس وظيفتها. يمكن أيضا أن تكون متصلا عضيات داخل الخلايا عن طريق مواقع الاتصال الديناميكية التي تسمح الجزيئات (الدهون) التي يتم تبادلها مباشرة بين المقصورات. علاوة على ذلك، العديد من البروتينات قد لتجميعها في مجمعات مغايرة التغصن كبيرة أو المرتبطة بالأنواع الدهون محددة (الطوافات الدهنية / microdomains) لكى تصبح نشطة وظيفيا أو ليتم نقلها إلى وجهتها النهائية. كل هذه الجوانب البيولوجية تؤثر بشكل كبير على الخصائص الحركية للبروتينات، وبالتالي يمكن أن يتم التحقيق بشكل مناسب عن طريق التقنيات الموضحة أدناه.

وقد استخدمت على نطاق واسع مجموعتنا FRAP والوجه جنبا إلى جنب مع المجهر الإلكتروني من أجل دراسة الهندسة المعمارية لائحة وشبه المختلفةالمجالات. لائحة هي المحطة الأولى من مسار إفرازية، ويلعب دورا رئيسيا في البروتين والدهون الفرز 5. بل هو عضية ديناميكية للغاية التي تعكس وظائف عديدة ومختلفة (أي البروتين والدهون والاتجار الحيوي والبروتين للطي، كا 2 + تخزين والإفراج عنهم، والتمثيل الغذائي أجنبي بيولوجيا) نطاقات فرعية متميزة. ومع ذلك، على الرغم من أنها شكليا، مكانيا، ومتميزة وظيفيا، وهذه المجالات هي مستمرة مع بعضها البعض، ويمكن تعديل الوفرة النسبية في الخلايا تحت الظروف الفسيولوجية والمرضية. أشهرها والمجالات عادة منفصلة مكانيا من ER هي المغلف النووية، وER ناعمة وخشنة، ولكن نحن وآخرون أظهرت أن هناك هياكل ER مع بنية أكثر تفصيلا وتنظيم ثلاثية الأبعاد في مختلف أنواع الخلايا و الأنسجة تحت الظروف الفسيولوجية التي يمكن أيضا أن يتسبب من خلال محفزات المجهدة مثل نقص الأكسجة، المخدراتالإدارة، أو الإفراط في التعبير عن-ER المقيمين البروتينات عبر الغشاء 2،6 (والمراجع فيه).

كما أننا أظهرنا مؤخرا وجود مثل هذه الهياكل في نماذج خلية من الأمراض التي تصيب الإنسان 1،7. تنشأ من صهاريج مكدسة من ER على نحو سلس، قدمت لهم اسم الجماعية من الشبكة الإندوبلازمية الملساء تنظيم (OSER) في عام 2003 6، على الرغم من أنها معروفة أيضا باسم karmellae، صفاحات، وبلوراني ER على أساس الهندسة المعمارية الخاصة بهم والتي، مثل بهم الحجم، ويمكن أن تختلف. بعد و transfected الخلايا مع GFP تنصهر إلى المنطقة عصاري خلوي من (TA) البروتينات-ER المقيمين (د EGFP-ER) رست الذيل، والميل dimerizing ضعيفة من GFP في العابرة يغير بشكل كبير من تنظيم وهيكل ER. وأظهرت التجارب FRAP وFLIP أن د EGFP-ER هو حر لنشر ضمن OSERs، وحقيقة أنه ينتقل من لائحة شبكي لOSER والعكس بالعكس <م /> يشير إلى أن المجاميع مستمرة مع شبكي ER المحيطة بها. وقد سمح لنا التحليل التركيبية لربط البيانات مضان مع وصفا مفصلا لOSER العمارة وتنظيم على مستوى النانو: تصنع دائما OSERs تتكون من أكوام من صهاريج تقرن من ER نحو سلس ولكن قد يكون لها أشكال مختلفة من التنظيم المكاني، مثل ترتيب بانتظام الجيبية صفائف أو جدلات، أو سداسية "بلوراني" صفائف أنبوبي. هذه تؤدي إلى إعادة ترتيب الأشكال التضاريسية مكعب 8 الذي، كما تم العثور في الخلايا تحت الظروف الفسيولوجية 9 والضغوط التالية مثل نقص الأكسجة 10، 11 العلاج من تعاطي المخدرات، والسرطان 9، قد تنطوي على إمكانات كبيرة كعلامات التركيبية.

بعد هذه المظاهرة الأولى باستخدام GFP البروتينات الانصهار، استخدمنا تجارب التصوير لتحليل انتشار المجالات ER استجابة للعلاجات الدوائية 12، ASSESS ميل البروتينات الفلورية لoligomerise 13 في الخلايا، والتحقيق في دور متحولة، ALS المرتبطة البروتين TA في تشكيل المجاميع داخل الخلايا ER المنشأ التي قد تكون ذات صلة 1،8 المرضية لها. فقد قيل أن تشكيل المجاميع داخل الخلايا (والذي يحدث في كثير من الأمراض العصبية 14) قد تكون آلية وقائية تهدف إلى منع التفاعلات بين البروتينات متحولة السامة ومكونات الخلية المحيطة 15.

ما يلي هو وصف لمجموعة من الأساليب المجهر الضوئي والإلكترون عن التحقيق الذي يبني-C محطة تندس المجالات مسعور في غشاء من لائحة، وتحليل سلوكهم دينامية وآثار على مدى تعبير على نطاق ER الهندسة المعمارية في الخلايا المستزرعة (انظر الشكل 1 لمخطط انسيابي للبروتوكول التجريبية).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. البلازميد، زراعة الخلايا، وترنسفكأيشن مع ER نيون البروتينات

  1. البلازميد المستخدمة في هذه الدراسة يتكون من نسخة محسنة من GFP تنصهر في دورته C-محطة للمنطقة الذيل من الإسوي ER من الفئران السيتوكروم ب (5) (مختصر هنا ب (5)) عبر تسلسل رابط. يحتوي على منطقة الذيل تسلسل كامل (Pro94-Asp134) الذي لا يزال الغشاء المرتبطة بعد انشقاق التربسين من الأم ب (5)، بما في ذلك انظمة الدفاع الصاروخى التكتيكى 17 بقايا (المجال عبر الغشاء)، ويحيط بها سلاسل القطبية المنبع والمصب (يو بي اس وDPS) . يتكون رابط من حاتمة MYC تليها [(الغليسين) 4 سر] 3، ويتم إدراج [كدنا بأكمله في مواقع Hind3-Xba1 من الثدييات ناقلات التعبير pCDNA3. وقد وصفت تفاصيل بناء هذا البلازميد في منشور السابقة التي يشار إليها باسم GFP-ER 16.
  2. تنمو الخلايا COS-7 في Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ فيتامصل ل البقري، 2 مم L-الجلوتامين، 1٪ البنسلين / الستربتوميسين في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 10٪ CO 2.
  3. ترنسفكأيشن. لوحة 3 × 10 5 الخلايا على ساترة الزجاج جولة في لوحة 6 جيدا و، في اليوم التالي، بالنقل مع نظام JetPEI كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة. نلاحظ أن نسبة JetPEI / DNA الأمثل وقد تم اختبار من أجل تحديد الحد الأقصى لكفاءة ترنسفكأيشن اعتمادا على البلازميد وخط الخلية المستخدمة: في حالتنا، وJetPEI: نسبة الحمض النووي 2:1 يؤدي إلى 70-80٪ كفاءة ترنسفكأيشن.

2. يعيش الإسفار متحد البؤر المجهري الضوئي

  1. التصوير الخلية الحية. وضع ساترة التي كانت المصنفة على الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل إلى غرفة خلية ثقافة الصلب لمدة 24 ملم coverslips مليئة DMEM ث / س الفينول الأحمر، على أن تستكمل مع FBS 10٪، 2 مم L-الجلوتامين، 1٪ القلم / بكتيريا، 25 ملي HEPES ، 50 ميكروغرام / مل سيكلوهيكسيميد و1:100 OxyFluor لمنع عينات من photobleaching من. وmicroscop SP5 مبائريستخدم البريد مجهزة CO 2 الحاضنة التي تسيطر عليها درجة الحرارة (37 درجة مئوية و 5٪ CO 2) لتجارب التصوير الخلية الحية، مع د GFP-ER يجري تصور باستخدام الليزر 488 نانومتر، ومرشح 525/50 تمريرة الفرقة الانبعاثات.
  2. مضان الانتعاش بعد photobleaching من (FRAP). رسم المنطقة ذات الاهتمام (ROI)، المقابلة لبنية OSER، والتبييض باستخدام التكرارات و20 مجموعة من 488 نانومتر (100٪ من ليزر الأرجون 30 ميغاواط، أي ما يعادل 5.5-6 μW في العينة) و 405 نانومتر (60٪ من 30 ميغاواط ديود ليزر 405، المقابلة ل11.6 μW في العينة) الليزر الذي يؤدي في تجربتنا لphotobleaching من كفاءة وسرعة.
  3. تسجيل انتعاش مضان في رويس ابيض من خلال اتخاذ إطار واحد كل 10 ثانية لمدة 10 دقيقة (بالتوقيت بكسل = 1.61 μsec / مقصف).
  4. فقدان مضان في photobleaching من (FLIP). رسم ROI المقابلة لبنية OSER، والتبييض كما هو موضح أعلاه. يتم تكرار تبيض كل 30 ثانية،وتسجل الصور آخر التبييض كل 10 ثانية لمدة 30 دقيقة (بالتوقيت بكسل = 1.61 μsec / مقصف).
  5. FRAP FLIP وتحليل. ويتم تحليل كافة الصور باستخدام برنامج ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html ). في التجارب FRAP، يتم قياس الانتعاش مضان من العائد على الاستثمار ابيض مع مرور الوقت وتطبيع مضان مجموعه خلية ابيض، والتي يتم التحقق دائما أن تكون ثابتة على مر الزمن.
  6. للتجارب FLIP، رسم العائد على الاستثمار خارج OSER ابيض وتغطي الخلية بأكملها. قياس كثافة مضان بمرور الوقت وتطبيع إلى مستويات مضان من العائد على الاستثمار مرسومة على خلية غير مقصور من أجل تصحيح أي انخفاض في مضان الناجمة عن التصوير نفسها.
  7. في جميع التجارب، تطرح إشارة الخلفية (تحديد في منطقة خارج الخلايا) من شدة الفلورسنت من رويس. أخيرا، رسم النتائج باستخدام غرامaphPad بريزم البرمجيات.

3. تحليل التركيبية بواسطة وسائل نقل المجهر الإلكتروني

نظرا لسمية كثير من الكواشف، وجميع الإجراءات ينبغي أن يتم ارتداء مختبر المناسبة. معطف وقفازات تحت غطاء الدخان.

  1. بعد إزالة ساترة من طبق بيتري، وإصلاح الخلايا المتبقية نمت على الجزء السفلي من الطبق كما أحادي الطبقة باستخدام تصفيتها 2٪ في غلوتارالدهيد 0.1 M العازلة كاكوديلات، ودرجة الحموضة 7.4، لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  2. تتخلص من الخلايا باستخدام مكشطة تفلون ونقلها إلى 1.5 مل أنابيب إيبندورف. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 9000 ز لمدة 10 دقيقة. إزالة طاف، إضافة تثبيتي الطازجة، وترك بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  3. غسل الكريات مع المخزن المؤقت، ثم إصلاح آخر مع محلول 1٪ رباعي أكسيد الأوزميوم في المخزن كاكوديلات لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  4. شطف مع المياه MilliQ، وككل وصمة عار مع1٪ خلات اليورانيل في الماء المقطر لمدة تتراوح بين 20-60 دقيقة.
  5. يذوى العينات في زيادة سلسلة الايثانول (70٪، 80٪، 90٪، 100٪، و 100٪ لمدة 10 دقيقة لكل منهما)، ويغسل مرتين لفترة وجيزة في أكسيد البروبيلين (15 دقيقة لكل منهما).
  6. التسلل العينات في خليط من أكسيد البروبيلين + EPON (1:1) (من 2 ساعة ليلة وضحاها).
  7. تغرس في EPON راتنجات الايبوكسي الشفاء عند 60 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 24 ساعة.
  8. القسم الكتل الراتنج قلص يدويا باستخدام مشراح مستدق LEICA UC6 مجهزة 45 درجة الماس سكين للحصول على أقسام مع سمك 60-70 نانومتر. جمع المقاطع على شبكات النحاس 300 شبكة.
  9. وصمة عار المقاطع على الشبكة مع محلول مشبع من خلات اليورانيل (20 دقيقة) وتؤدي سترات (7 دقائق)، ويغسل جيدا للشبكات عن طريق غمر في الماء المقطر تصفيتها ثنائية، والسماح لهم لتجف في درجة حرارة الغرفة.
  10. ويلاحظ شبكات الملون باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ TECNAI G2، ويتم التقاط الصور باستخدام بوتام محمولة على كاميرا CCD في تكبير النهائية مختلفة (تتراوح عادة من 6،000-39،000 X).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ويبين الشكل 2 دراسة FRAP سبيل المثال التنقل البروتين. ويتجلى تنقل د البروتين EGFP-ER من الانتعاش السريع بعد مضان photobleaching من OSERs في المبيض. للتحليل الكمي، وقد استمدت النصف الساعة وجزء المحمول من البيانات المقاسة معمليا عن طريق تركيب المعادلة monoexponential التالية:

F (ر) = F + آخر (آخر جمعة تفصيل-F) (ر 1 ه / τ)

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وقد استخدمت البروتوكولات والنهج التصوير وصفها في هذه الورقة للتحقيق في التوزيع والتنقل من transfected TA البروتينات الفلورية المقيمين في لائحة من الخلايا الحية. قمنا بتحليل أيضا تأثير الإفراط في التعبير من هذه البروتينات على بنية هذا الحيز التحت خلوية من خلال التحليلات التركيبية.

الجمع بين الخلية الحية التصوير متحد البؤر المجهر الإلكتروني ويمثل هو وسيلة قوية جدا من التحقيق في الخصائص الحيوية للبروتينات، ويمكن أن ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

المؤلفون ممتنون لFONDAZIONE Filarete على مساعدتها ودعمها في نشر هذا المقال. نود أيضا أن نشكر سنترو دي EUROPEO Nanomedicina لاستخدام TECNAI G2 المجهر الإلكتروني النافذ.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
دولبيكو s النسر المعدل المتوسط (DMEM)Invitrogen41966029
Dulbecco' s النسر المعدل المتوسط (DMEM) بدون الفينول الأحمرInvitrogen31053028
مصل الأبقار الجنينية (FBS)Invitrogen10270106
القلم / البكتيريا العقديةInvitrogen15140-122
L-Glutamine 200 mM محلولInvitrogen25030-024
jetPEIPolyplus TransfectionPP10110
OxyFluorOxyrase شركه.OF-0005
جلوتارالديهايد من الدرجة الأولىسيجما ألدريتشG5882
كاكوديلات الصوديوم ثلاثي هيدراتسيجما ألدريتشC0250
أوزميوم رباعي أكسيد 4٪ محلولعلم المجهر الإلكتروني19150
أسيتات يورانيل ثنائي هيدراتسيجما ألدريتش73943
أكسيد البروبيلينقليلا سيجما ألدريتش82320
EPON تضمين مجموعة متوسطةSigma-Aldrich45359-1EA-F
سترات الرصاص علم المجهرالإلكتروني 17800
جهاز طرد مركزي أعلىمقاعد البدلاء Eppendorf5415 D
المجهر الطيفي متحد البؤر Leica MicrosystemsTCS SP5
CO2< / sub> نظام حضانة قفص المجهر OkoLab
Ultramicrotome Leica MicrosystemsUC6
سكين الماس DiatomeUltra 45 & deg;
مجهر إلكتروني ناقل FEITecnai G2
GraphPad Prism SoftwareGraphPad Software، Inc
غرفة خلية ثقافة فولاذية لأدواتالعلوم الحيويةCSC-25
شبكات المجهر الإلكترونيعلم المجهرG300Cu
المشع الحركة مقاس 24 مم الإلكتروني

المراجع

  1. Fasana, E., et al. A VAPB mutant linked to amyotrophic lateral sclerosis generates a novel form of organized smooth endoplasmic reticulum. FASEB J. 24, 1419-1430 (2010).
  2. Borgese, N., Francolini, M., Snapp, E. Endoplasmic reticulum architecture: structures in flux. Curr. Opin. Cell Biol. 18, 358-364 (2006).
  3. Ronchi, P., Colombo, S., Francolini, M., Borgese, N. Transmembrane domain-dependent partitioning of membrane proteins within the endoplasmic reticulum. J. Cell Biol. 181, 105-118 (2008).
  4. Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. Studying protein dynamics in living cells. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 444-456 (2001).
  5. Lee, M. C., Miller, E. A., Goldberg, J., Orci, L., Schekman, R. Bi-directional protein transport between the ER and. 20, 87-123 (2004).
  6. Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. J. Cell Biol. 163, 257-269 (2003).
  7. Papiani, G., et al. Restructured endoplasmic reticulum generated by mutant amyotrophic lateral sclerosis-linked VAPB is cleared by the proteasome. J. Cell Sci. 125, 3601-3611 (2012).
  8. Almsherqi, Z. A., Kohlwein, S. D., Deng, Y. Cubic membranes: a legend beyond the Flatland* of cell membrane organization. J. Cell Biol. 173, 839-844 (2006).
  9. Federovitch, C. M., Ron, D., Hampton, R. Y. The dynamic ER: experimental approaches and current questions. Curr. Opin. Cell Biol. 17, 409-414 (2005).
  10. Takei, K., Mignery, G. A., Mugnaini, E., Sudhof, T. C., De Camilli, P. Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor causes formation of ER cisternal stacks in transfected fibroblasts and in cerebellar Purkinje cells. Neuron. 12, 327-342 (1994).
  11. Feldman, D., Swarm, R. L., Becker, J. Ultrastructural study of rat liver and liver neoplasms after long-term treatment with phenobarbital. Cancer Res. 41, 2151-2162 (1981).
  12. Sprocati, T., Ronchi, P., Raimondi, A., Francolini, M., Borgese, N. Dynamic and reversible restructuring of the endoplasmic reticulum induced by PDMP in cultured cells. J. Cell Sci. 119, 3249-3260 (2006).
  13. Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions. Traffic. 13, 643-649 (2012).
  14. Pyszniak, A. M., Welder, C. A., Takei, F. Cell surface distribution of high-avidity LFA-1 detected by soluble ICAM-1-coated microspheres. J. Immunol. 152, 5241-5249 (1994).
  15. Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. Toxic proteins in neurodegenerative disease. Science. 296, 1991-1995 (2002).
  16. Winklhofer, K. F., Tatzelt, J., Haass, C. The two faces of protein misfolding: gain- and loss-of-function in neurodegenerative diseases. EMBO J. 27, 336-349 (2008).
  17. Borgese, N., Gazzoni, I., Barberi, M., Colombo, S., Pedrazzini, E. Targeting of a tail-anchored protein to endoplasmic reticulum and mitochondrial outer membrane by independent but competing pathways. Mol. Biol. Cell. 12, 2482-2496 (2001).
  18. Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiol Rev. 90, 1103-1163 (2010).
  19. Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP. Cold Spring Harb. Protoc. 2010, (2010).
  20. Michida, T., et al. Role of endothelin 1 in hemorrhagic shock-induced gastric mucosal injury in rats. Gastroenterology. 106, 988-993 (1994).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

استعادة الفلورة بعد التبييض الضوئيفقدان الفلورة بالتبييض الضوئيتصوير الخلايا الحيةالمجهر الإلكتروني النافذالمجهر البؤريالبروتينات الموسومة بـ GFPنقل البروتينات والدهونالحجرات الفرعية للعضياتالتحليل البنيوي الدقيق
تصور هيولي باطني شبكية النطاقات الفرعية في الخلايا المستزرعة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.