نحن تصف النهج التصوير التي نستخدمها لتحقيق توزيع والتنقل من البروتينات الفلورية transfected المقيمين في الشبكة الإندوبلازمية (ER) عن طريق التصوير متحد البؤر الخلايا الحية. نحن أيضا تحليل ultrastructurally تأثير التعبير عنها على بنية هذا الحيز التحت خلوية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تصور هيولي باطني شبكية النطاقات الفرعية في الخلايا المستزرعة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الدهون والبروتينات في الخلايا حقيقية النواة يتم تبادل مستمر بين المقصورات الخلية، على الرغم من أن هذه تحتفظ تكوينها مميزة وظائف على الرغم من مرور interorganelle الجزيئية مكثفة. التقنيات الموضحة في هذه الورقة هي وسيلة قوية لدراسة البروتين والدهون التنقل والاتجار في الجسم الحي في بيئتهم والفسيولوجية. مضان الانتعاش بعد photobleaching من (FRAP) وخسارة في مضان photobleaching من (FLIP) وتستخدم على نطاق واسع تقنيات التصوير الخلية الحية لدراسة الاتجار داخل الخلايا عن طريق إكسو التقامي المسار، والاستمرارية بين العضيات أو subcompartments، وتشكيل مجمعات البروتين، والبروتين التعريب في microdomains الدهون، والتي يمكن ملاحظتها في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية. القيود المفروضة على هذه المناهج هي أساسا نتيجة لاستخدام البروتينات الانصهار الفلورسنت، وتشمل سلبياتها المحتملة مصطنعة الإفراط في التعبير عنايون في الخلايا وإمكانية الاختلافات في للطي والتعريب من البروتينات الموسومة والأم. أخيرا، وكما الحد من قرار المجهر الضوئي (حوالي 200 نانومتر) لا يسمح التحقيق في هيكل غرامة من ER أو subcompartments المحددة التي يمكن أن تنشأ في الخلايا تحت الضغط (أي نقص الأكسجة، وإدارة المخدرات، والإفراط في التعبير من عبر الغشاء البروتينات ER المقيم) أو في ظل ظروف مرضية، ونحن الجمع بين التصوير الخلية الحية من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل مثقف مع التركيبية يحلل على أساس نقل الإلكترون المجهري.
المقدمة
اكتشاف بروتين الفلورية الخضراء (GFP) ومشتقاته الطيفية، وتطور مواز من مضان المجهري، وفتحت آفاقا جديدة تماما للتحقيق في سلوك البروتين في الخلايا. تقنيات مثل الانتعاش بعد مضان photobleaching من (FRAP) وخسارة في مضان photobleaching من (FLIP)، والتي هي ممكنة بسبب القدرة الذاتية للfluorophores لإطفاء مضان بهم تحت إضاءة مكثفة، تقوم على مبائر التصوير الخلية الحية واستخدام transfected البروتينات الفلورية الانصهار 1-3. وتستخدم على نطاق واسع لتقييم ليس فقط توطين البروتينات، ولكن أيضا قدرتهم على التنقل والنقل الحويصلي، والتي يمكن أن تكشف عن أدلة مهمة بشأن وظيفتها 4.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. البلازميد، زراعة الخلايا، وترنسفكأيشن مع ER نيون البروتينات
- البلازميد المستخدمة في هذه الدراسة يتكون من نسخة محسنة من GFP تنصهر في دورته C-محطة للمنطقة الذيل من الإسوي ER من الفئران السيتوكروم ب (5) (مختصر هنا ب (5)) عبر تسلسل رابط. يحتوي على منطقة الذيل تسلسل كامل (Pro94-Asp134) الذي لا يزال الغشاء المرتبطة بعد انشقاق التربسين من الأم ب (5)، بما في ذلك انظمة الدفاع الصاروخى التكتيكى 17 بقايا (المجال عبر الغشاء)، ويحيط بها سلاسل القطبية المنبع والمصب (يو بي اس وDPS) . يتكون رابط من حاتمة MYC تليها [(الغليسين) 4 سر] 3،
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويبين الشكل 2 دراسة FRAP سبيل المثال التنقل البروتين. ويتجلى تنقل د البروتين EGFP-ER من الانتعاش السريع بعد مضان photobleaching من OSERs في المبيض. للتحليل الكمي، وقد استمدت النصف الساعة وجزء المحمول من البيانات المقاسة معمليا عن طريق تركيب المعادلة monoexponential التالية:
F (ر) = F + آخر (آخر جمعة تفصيل-F) (ر 1 ه / τ)
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وقد استخدمت البروتوكولات والنهج التصوير وصفها في هذه الورقة للتحقيق في التوزيع والتنقل من transfected TA البروتينات الفلورية المقيمين في لائحة من الخلايا الحية. قمنا بتحليل أيضا تأثير الإفراط في التعبير من هذه البروتينات على بنية هذا الحيز التحت خلوية من خلال التحليلات التركيبية.
الجمع بين الخلية الحية التصوير متحد البؤر المجهر الإلكتروني ويمثل هو وسيلة قوية جدا من التحقيق في الخصائص الحيوية للبروتينات، ويمكن أن .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
المؤلفون ممتنون لFONDAZIONE Filarete على مساعدتها ودعمها في نشر هذا المقال. نود أيضا أن نشكر سنترو دي EUROPEO Nanomedicina لاستخدام TECNAI G2 المجهر الإلكتروني النافذ.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| دولبيكو s النسر المعدل المتوسط (DMEM) | Invitrogen | 41966029 | |
| Dulbecco' s النسر المعدل المتوسط (DMEM) بدون الفينول الأحمر | Invitrogen | 31053028 | |
| مصل الأبقار الجنينية (FBS) | Invitrogen | 10270106 | |
| القلم / البكتيريا العقدية | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine 200 mM محلول | Invitrogen | 25030-024 | |
| jetPEI | Polyplus Transfection | PP10110 | |
| OxyFluor | Oxyrase شركه. | OF-0005 | |
| جلوتارالديهايد من الدرجة الأولى | سيجما ألدريتش | G5882 | |
| كاكوديلات الصوديوم ثلاثي هيدرات | سيجما ألدريتش | C0250 | |
| أوزميوم رباعي أكسيد 4٪ محلول | علم المجهر الإلكتروني | 19150 | |
| أسيتات يورانيل ثنائي هيدرات | سيجما ألدريتش | 73943 | |
| أكسيد البروبيلين | قليلا سيجما ألدريتش | 82320 | |
| EPON تضمين مجموعة متوسطة | Sigma-Aldrich | 45359-1EA-F | |
| سترات | الرصاص علم المجهر | الإلكتروني 17800 | |
| جهاز طرد مركزي أعلى | مقاعد البدلاء Eppendorf | 5415 D | |
| المجهر الطيفي متحد البؤر | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| CO2< / sub> نظام حضانة قفص المجهر | OkoLab | ||
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC6 | |
| سكين الماس | Diatome | Ultra 45 & deg; | |
| مجهر إلكتروني ناقل | FEI | Tecnai G2 | |
| GraphPad Prism Software | GraphPad Software، Inc | ||
| غرفة خلية ثقافة فولاذية لأدوات | العلوم الحيوية | CSC-25 | |
| شبكات المجهر الإلكتروني | علم المجهر | G300Cu |
المراجع
- Fasana, E., et al. A VAPB mutant linked to amyotrophic lateral sclerosis generates a novel form of organized smooth endoplasmic reticulum. FASEB J. 24, 1419-1430 (2010).
- Borgese, N., Francolini, M., Snapp, E. Endoplasmic reticulum....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
