تتطلب الإجراءات التقليدية لعزل نوع قابل للذوبان 1 الكولاجين (COL1) حوالي 10 يوما من البداية الى النهاية بسبب حضانات عازلة طويلة وشاقة resuspensions من الألياف. هنا، نحن تصف وسيلة لتنقية COL1 الخزعات الجلدية الصغيرة في أقل من 3 دقائق.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
طريقة محسنة لإعداد النوع الأول الكولاجين من الجلد
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
ويستخدم نوع قابل للذوبان 1 الكولاجين (COL1) على نطاق واسع باعتبارها الركيزة لاصقة لمزارع الخلايا وكما سقالة الخلوية للتطبيقات التجدد. سريريا، ويستخدم على نطاق واسع هذا البروتين للجراحة التجميلية، والحقن الجلدية، تطعيم العظام، والجراحة الترميمية. مصادر COL1 لهذه الإجراءات هي غير البشرية عادة، مما يزيد من احتمال التهاب والرفض وكذلك انتقال المرض أجنبي بيولوجيا. في ضوء ذلك، فإن الأسلوب بكفاءة وبسرعة تنقية COL1 من كميات محدودة من أنسجة مستمدة autologously-تحايل العديد من هذه القضايا، ولكن العزلة البروتوكولات القياسية هي طويلة وتتطلب كميات كبيرة من الأنسجة كولاجيني كثير من الأحيان. هنا، علينا أن نظهر طريقة استخراج COL1 فعالة أن يقلل من الوقت اللازم لعزل وتنقية هذا البروتين من حوالي 10 أيام إلى أقل من 3 في الساعة. اخترنا الأدمة كمصدر الأنسجة لدينا بسبب توافره خلال العديد من الإجراءات الجراحية. Tيستخدم طريقته مخازن استخراج التقليدية جنبا إلى جنب مع الانفعالات قوية والترشيح الطرد المركزي للحصول على درجة عالية من محض، قابل للذوبان COL1 من كميات صغيرة من أدمة. لفترة وجيزة، يتم غسلها الخزعات الجلدية تماما في DH الجليد الباردة 2 O بعد إزالة الدهون، والنسيج الضام، والشعر. يتم تجريد عينات الجلد من البروتينات والسكريات غير كولاجيني باستخدام 0.5 M خلات الصوديوم وسرعة عالية مقعد بين كبار الخالط. يتم استخراج الكولاجين من المواد الصلبة المتبقية في وقت لاحق مع 0.075 M الصوديوم العازلة سيترات باستخدام الخالط. يتم تنقية هذه المقتطفات باستخدام 100،000 ميغاواط وقف انتاج المواد الانشطارية مرشحات الطرد المركزي التي تحقق الاستعدادات COL1 من نوعية مماثلة أو متفوقة على المنتجات التجارية أو تلك التي تم الحصول عليها باستخدام إجراءات التقليدية. نتوقع أن هذه الطريقة تسهل استخدام المستمدة autologously-COL1 للعديد من البحوث والتطبيقات السريرية.
المقدمة
على مدى عقود، وقد عزل الباحثون والباعة التجارية solubilized COL1 من مجموعة متنوعة من المصادر بما في ذلك الجلد والأنسجة وتر استخدام بعض الاختلاف من بروتوكول استخلاص الحمض بسيطة تليها تحييد، مما يؤدي الى إعادة تعليق من مصفوفة من الألياف COL1 المنظمة التي يمكن استخدامها لعدد وافر من التطبيقات الطبية الحيوية 1-4. في حين أن هناك العديد من الأمثلة على التطبيقات السريرية لCOL1، عدد قليل من هذه توظف COL1 المستمدة autologously لأن إعداد هذا البروتين يتطلب قلع مطولة مع الأخذ أيام أو أسابيع لأداء 5-7. ونتيجة لذلك، والمحققين البحوث والأطباء عموما استخدام، المستحضرات التجارية باهظة الثمن من COL1 التي يتم إعدادها باستخدام الأنسجة غير البشرية مثل الفئران والأبقار، أو أدمة الخنازير أو باستخدام إزالة الجثث من الجلد أو بعد ختان الذكور. للتطبيقات التجدد، وكثير من هذه المنتجات المعرض التباين فيما يتعلق قدرتها على تشكيل الصلبةمصفوفات أو يبني الأنسجة قادرة على دعم مرفق الخلية والنمو. وبالتالي، هناك حاجة واضحة لطريقة موحدة جديدة مصممة لاستخراج بسرعة COL1 من مصادر الأنسجة ذاتي الوصول إليها وفيرة.
أن مثل هذا الأسلوب توفير الوقت والمال في إعداد البحوث التي يمكن استخراجها COL1 من نموذج حيواني من الفائدة وتستخدم لاختبار قبل السريرية الأنسجة المهندسة وتجميعها على السقالات القائمة على الكولاجين. في الوقت نفسه، فإن وجود خيار استخدام معزولة بسرعة، COL1 المستمدة autologously في العيادة زيادة السلامة العامة للمرضى من شأنها أن تلقي خلاف ذلك خيفي أو مستحضرات أعضاء غير بشرية. للمرضى الذين يتلقون استعدادا ذاتي المنشأ، فإن هذا الأسلوب مبسطة يقلل كثيرا من الفاصل الزمني بين جمع خزعة وتطبيق الكولاجين. لهذه الأسباب، سعينا لتحسين بناء على COL1 العزلة وتنقية الأسلوب الراسخة باستخدام عالية السرعة AGitation والحجم الاستبعاد الطرد المركزي. هذه طريقة بسيطة لأداء باستخدام مخازن القياسية والمعدات الموجودة في العديد من المختبرات. من خلال توظيف عالية السرعة والإثارة، لدينا بروتوكول يقلل من الوقت اللازم لعزل القابلة للذوبان، الجلد COL1 من ما يقرب من 10 يوما إلى أقل من 3 ساعة 8. الأهم من ذلك، هذا الأسلوب لا يمكن أن يؤديها بسهولة في الإعداد السريرية من أجل إعداد COL1 المستمدة autologously للاستخدام في المرضى خلال مجموعة واحدة من الإجراءات.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
هنا سوف علينا أن نظهر عزلة COL1 من الجلد الضأن. كما هو مكتوب، وهذا البروتوكول يمكن أن تستخدم أيضا لعزل بنجاح COL1 من الأرانب وجلد الإنسان.
1. إعداد الجلدية عينة
- تتوازن جميع الكواشف إلى 4 درجة مئوية قبل استخدامها.
- شطف العينة الجلدي (25-50 غ) في DH الجليد الباردة 2 O وإزالة أي الصوف والفراء، أو الشعر مع كريم مزيل الشعر.
- استخدام شفرة حلاقة واحدة الحافة لكشط نظيفة عينة من النسيج الضام والدهون.
- شطف العينة في الجليد الباردة درهم 2 O.
- شريحة عينة الجلد إلى 1 سم × 1 سم قطع مع شفرة حلاقة واحدة الحافة.
2. إزالة المواد غير كولاجيني Solubilized
- تزن من 5 غرام من العينة في أنبوب 50 مل المخروطية وإضافة 30 مل من الجليد الباردة M 0.5 خلات الصوديوم.
- خلط الأنابيب لمدة 1 دقيقة في 6 إعداد م / ثانية باستخدام محول أنبوب 50 مل في الخالط مقعد بين كبار.
- تجاهل سوبernatant وتكرار لما مجموعه 7 الصوديوم خلات دورات الغسيل.
- شطف العينة في DH الجليد الباردة 2 O وتخلط مرة واحدة لإزالة خلات الصوديوم المتبقية.
- استخدام ملعقة لضغط العينة ضد الجانب من الأنبوب لإزالة السائل الزائد، ثم نقل إلى أنبوب 50 مل المخروطية الطازجة.
3. النوع الأول الكولاجين استخراج
- غسل العينة مرتين في 2 مل / ز 0.075 M الصوديوم العازلة سيترات لمدة 1 دقيقة في 6 متر / ثانية في الخالط مقعد بين كبار ضغط العينة والتخلص من طاف بعد كل غسل.
- إضافة جديدة 2 مل / ز قسامة من 0.075 M الصوديوم العازلة سترات للعينة.
- تنفيذ 6 متتابعة 1 دقيقة، 6 م / ثانية دورات مقعد بين كبار مزيج من الانفعالات الخالط دون إزالة المنطقة العازلة بين كل دورة.
- نقل، طاف واضحة سميكة إلى أنبوب جمع.
- إضافة مبلغ إضافي 1 مل / ز 0.075 M الصوديوم العازلة سيترات إلى عينة واحدة وأداء النهائي مقعد بين كبار الخالط agitaدورة نشوئها.
- إضافة هذا طاف النهائي إلى أنبوب جمع.
- أجهزة الطرد المركزي في أنبوب جمع 3،200 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- نقل طاف إلى المقصورة العلوي من 100،000 الوزن الجزيئي قطع جهاز تصفية الطرد المركزي.
- أجهزة الطرد المركزي في 3،200 x ج لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- نقل COL1 تنقيته من المقصورة العلوية لأنبوب مخروطي نظيفة وتخزينها في 4 درجات مئوية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
هذا البروتوكول العزلة COL1 يتطلب حوالي 2 ساعة و 15 دقيقة لإكمال. ويبين الشكل 1 رسما تخطيطيا يحدد الخطوات الرئيسية في هذا الإجراء. إعداد العينة وتنفيذ 7 دورات من الثورات عالية السرعة ويشطف مع خلات الصوديوم يستغرق حوالي 35 دقيقة (أرقام 1A-C). أداء التحريض واحدة وشطف دورة مع DH 2 O يستغرق حوالي 5 دقائق (أرقام 1D و1E). مضيفا سيترات الصوديوم وإخضاع العينة إلى التحريض واحدة وشطف دورة تليها 6 دورات من الهياج يستغرق حوالي 45 دقيقة (أرقا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وثمة عنصر حاسم لهذا الأسلوب هو ضغط كفاءة المتكررة من العينة عن طريق الجلد لإزالة السائل الزائد. فمن الأهمية بمكان لإزالة أكبر قدر ممكن خلات الصوديوم في الخطوة 2.5 عن طريق ضغط العينة. نستخدم ملعقة ضغط الجلد ضد الجانب من الأنبوب، ولكن يمكن أن تستخدم أيضا القماش القطني، على الرغم من أن هذا يستلزم إزالة عينة من الأنبوب وزيادة الوقت اللازم لتنفيذ هذه الخطوات. وبالمثل، فإنه من المهم لضغط العينة في الخطوة 3.1 بحيث حجم سيترات الصوديوم دقيقة في الخطوات اللاحقة استخراج. وفشل لإزالة السائل ك...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
والكتاب ليس لديهم مصالح مالية تتنافس في الكشف عنها.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل من خلال منحة بحثية من المعاهد الوطنية للصحة (HL068915 إلى DBC)، وجائزة الباحث جديد من صندوق البحوث الدراسه (لCAP)، منحة في والمساعدات من جمعية القلب الأمريكية (12GRNT11910008 إلى DBC) ، منحة بحثية من مؤسسة القلب للأطفال (لDBC)، والتبرعات لمستشفى صندوق الأطفال في بوسطن القلب التوصيل، والوقف ريان الأسرة، وديفيد بولمان.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
نظام
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| FastPrep-24 | MP Biomedicals | 116004500 | |
| جهاز طرد مركزي | Beckman | J6-MI | دوار دلو سوينغ لاستيعاب 50 مل من الأنابيب المخروطية عند 3,200 × جم. |
المراجع
- Nageotte, J. Coagulation fibrillaire in vitro du collagène dissous dans un acide dilué. CR hebd. séances Acad. Sei. 184, 115 (1927).
- Schmitt, F. O., Hall, C. E., Jakus, M. A. Electron microscope investigation of the structure of collagen. J. Cell Comp. Physiol. 20, 11-33 (1942).
- Choi, Y. H., et al. Cardiac conduction through engineered tissue. Am. J. Pathol. 169, 72-85 (2006).
- Pacak, C. A., Cowan, D. B. Fabrication of myogenic engineered tissue constructs. J. Vis. Exp. (27), (2009).
- Cliche, S., Amiot, J., Avezard, C., Gariepy, C. Extraction and characterization of collagen with or without telopeptides from chicken skin. Poultry Sci. 82, 503-509 (2003).
- Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat. Protoc. 1, 2753-2758 (2006).
- Seifter, S., Gallop, P. Preparation and properties of soluble collagens. Methods in Enzymology. Colowick, S., Kaplan, N. , Academic Press. NY. (1963).
- Pacak, C. A., Powers, J. M., Cowan, D. B. Ultrarapid purification of collagen type I for tissue engineering applications. Tissue Eng. Part C Methods. 17, 879-885 (2011).
- Ohan, M. P., Dunn, M. G. Glucose stabilizes collagen sterilized with gamma irradiation. J. Biomed. Mater. Res. A. 67, 1188-1195 (2003).
- Tyan, Y. C., Liao, J. D., Lin, S. P., Chen, C. C. The study of the sterilization effect of gamma ray irradiation of immobilized collagen polypropylene nonwoven fabric surfaces. J. Biomed. Mater. Res. A. 67, 1033-1043 (2003).
- Ber, S., Torun Kose, G., Hasirci, V. Bone tissue engineering on patterned collagen films: an in vitro study. Biomaterials. 26, 1977-1986 (2005).
- Liu, Y., Sun, S., Singha, S., Cho, M. R., Gordon, R. J. 3-D femtosecond laser patterning of collagen for directed cell attachment. Biomaterials. 26, 4597-4605 (2005).
- Thakar, R. G., Ho, F., Huang, N. F., Liepmann, D., Li, S. Regulation of vascular smooth muscle cells by micropatterning. Biochem. Biophys. Res. Comm. 307, 883-890 (2003).
- Leighton, J., Justh, G., Esper, M., Kronenthal, R. L. Collagen-coated cellulose sponge: three dimensional matrix for tissue culture of Walker tumor 256. Science. 155, 1259-1261 (1967).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
