مقالة منهجية

جسيمات PLGA النانوية المكونة من مستحلب أحادي أو مزدوج مع فيتامين E-TPGS

68K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/51015

⸱

ديسمبر 27, 2013

 , 
1Barrow Brain Tumor Research Center, Barrow Neurological Institute

في هذه المقالة

ملخص

نصف إنتاج وتوصيف الجسيمات النانوية والجسيمات الدقيقة المكونة من بولي (حمض اللاكتيك والجليكوليك) باستخدام فيتامين E-TPGS كمستحلب. من خلال تغيير معلمات الصياغة مثل تركيز المستحلب ، من الممكن إنتاج جسيمات نانوية بأقطار متوسطة تتراوح من 220 نانومتر إلى 1.98 ميكرومتر.

الملخص

< p class = "jove_content" > Poly (حمض اللاكتيك كو جليكوليك) (PLGA) هو عضو متوافق حيويا في عائلة البوليستر الأليفاتي من البوليمرات القابلة للتحلل. لطالما كان PLGA خيارا شائعا لتطبيقات توصيل الأدوية ، خاصة أنه معتمد بالفعل من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) للاستخدام في البشر في شكل خيوط قابلة للامتصاص. يتم تغليف الأدوية الكارهة للماء والمحبة للماء في جزيئات PLGA عن طريق مستحلب أحادي أو مزدوج. باختصار ، يتم إذابة الدواء بالبوليمر أو مستحلب بالبوليمر في مرحلة عضوية يتم استحلبها بعد ذلك بالمرحلة المائية. بعد تبخر المذيب ، يتم غسل الجسيمات وجمعها عن طريق الطرد المركزي للتجميد والتخزين طويل الأجل. يتحلل PLGA ببطء عن طريق التحلل المائي في البيئات المائية ، ويتم إطلاق العوامل المغلفة على مدى أسابيع إلى شهور. على الرغم من أن PLGA هي مادة تمتلك العديد من المزايا لتوصيل الأدوية ، إلا أن التكوين القابل للتكرار للجسيمات النانوية يمكن أن يكون أمرا صعبا. يتم إدخال تباين كبير من خلال استخدام معدات مختلفة ، ودفعة الكواشف ، وطريقة دقيقة للاستحلاب. هنا ، نصف بتفصيل كبير تكوين وتوصيف الجسيمات الدقيقة والجسيمات النانوية التي تتكون من مستحلب أحادي أو مزدوج باستخدام عامل الاستحلاب فيتامين E-TPGS. يتم تحديد مورفولوجيا الجسيمات وحجمها باستخدام الفحص المجهري الإلكتروني الماسح (SEM). نحن نقدم صور تمثيلية SEM للجسيمات النانوية المنتجة بتركيز مستحلب متفاوت ، بالإضافة إلى أمثلة على تصوير القطع الأثرية والاستحلاب الفاشل. يمكن تكييف هذا البروتوكول بسهولة لاستخدام مستحلبات بديلة (مثل بولي (كحول الفينيل) ، PVA) أو المذيبات (مثل ثنائي كلورو الميثان ، DCM).

المقدمة

أصبحت البوليمرات وسائل توصيل الأدوية شائعة بشكل متزايد في العقود العديدة الماضية للتطبيقات التي تتراوح من علاج الورم المستهدف1 إلى تعديل الجهازالمناعي 2. غالبا ما تكون الأدوية المغلفة بالبوليمر أو المترافقة أكثر فعالية من نظيراتها التي يتم تسليمها بحرية ، حيث أن الأدوية المرتبطة بالبوليمر محمية من التدهور. تترجم هذه الحماية إلى عمر نصف بيولوجي أطول وفعالية محسنة مع تقليل الآثار الجانبية الجهازية3-5.

< p class = "jove_content" > Poly (حمض اللاكتيك والجليكوليك) (PLGA) يعرض العديد من الخصائص المثالية لنظام التوصيل النانوي ، مما يوفر إطلاقا طويل الأمد للعامل المغلف ويتحلل إلى منتجات متوافقة حيويا لحمض اللاكتيك والجليكوليك. أظهرت الجزيئات الصغيرة والبروتينات والأحماض النووية المغلفة في PLGA نشاطا معززا في مجموعة متنوعة من تطبيقات الأمراض8. الأهم من ذلك ، أن منصة المواد تسهل التخصيص السهل لميزات مثل الحجم والشحنة والعرض السطحي للروابط لاستهداف الجسيمات إلى أنسجة معينة أو لأغراض التصوير. نظرا لأن PLGA يستخدم بالفعل في البشر في شكل خيوط قابلة للتحلل (مثل Purasorb و Purac Biomaterials و Vicryl و Ethicon Inc.) ، فإن إمكانية الترجمة السريرية عالية.

< p class = "jove_content" >مستحلب الزيت والماء (الفردي) أو الماء والزيت والماء (المزدوج) هو إحدى الطرق التي يمكن من خلالها استخدام PLGA لتغليف الأدوية الكارهة للماء والمحبة للماء في شكل دقيق أو نانوي. باختصار ، يتم إذابة PLGA في مرحلة عضوية (زيت) مستحلبة بخافض للتوتر السطحي أو مثبت (ماء). تضاف الأدوية الكارهة للماء مباشرة إلى مرحلة الزيت ، بينما يمكن استحلاب الأدوية المحبة للماء (الماء) أولا بمحلول البوليمر قبل تكوين الجسيمات. تسهل رشقات الصوتنة عالية الكثافة تكوين قطرات بوليمر صغيرة. يضاف المستحلب الناتج إلى مرحلة مائية أكبر ويقلب لعدة ساعات ، مما يسمح للمذيب بالتبخر. يتم جمع الجسيمات النانوية المتصلبة وغسلها بالطرد المركزي (الشكل 1).

هنا ، نصف تقنية لصنع جسيمات PLGA النانوية باستخدام مستحلب أحادي ومزدوج ، مع أسيتات الإيثيل (EtAc) كمذيب وفيتامين E- D-α-Tocopherol البولي إيثيلين جلايكول سكسينات (TPGS) كعامل استحلاب. يوفر استخدام فيتامين E-TPGS العديد من المزايا المحتملة مقارنة بالأنواع الأخرى من عوامل التثبيت (مثل بولي (كحول الفينيل) ، PVA) ، بما في ذلك كفاءة الاستحلاب والتغليف المحسنة. أبلغت مجموعات أخرى عن مزايا فيتامين E-TPGS ، بما في ذلك تثبيط P-gp ، وهو بروتين تدفق عبر الغشاء ، والذي يتم التعبير عنه بشكل مفرط في الخلايا السرطانية والمعروف أنه يساهم في مقاومة الأدوية عن طريق نقل الأدوية من الخلايا المستهدفة. بالإضافة إلى ذلك ، نوضح كيفية توصيف الجسيمات وحجمها باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) وتقديم مزيد من الإرشادات حول تعديل الحجم عن طريق تغيير البروتوكول.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحضير الجسيمات النانوية

يجب تنفيذ جميع الخطوات التي تنطوي على مذيب أو بوليمر مذاب / مستحلب في غطاء دخان كيميائي.

  1. يزن 100 مجم (+/- 5 مجم) من بولي (حمض اللاكتيك كو جليكوليك) (PLGA) ويوضع في أنبوب اختبار 13 مم × 100 مم.
  2. نقل مذيب 1 مل (أسيتات الإيثيل (EtAc) أو ثنائي كلورو الميثان (DCM)) إلى العينة باستخدام ماصة زجاجية مصلية.
  3. قم بتغطية الجزء العلوي من الأنبوب بقطعة صغيرة من رقائق الألومنيوم ، وقم بتغليف الرقاقة بإحكام ، مع التأكد من لف البارافيلم بإحكام عبر الحافة العلوية للقارورة وكذلك الحافة السفلية للرقائق.
  4. ضع علامة على مستوى المذيب على السطح الخارجي لأنبوب الاختبار. دع البوليمر يذوب طوال الليل ، مع إضافة مذيب إضافي في اليوم التالي في حالة حدوث تبخر.
    ملحوظة: يمكن أيضا إذابة البوليمر في يوم تحضير الجسيمات النانوية ، إذا لزم الأمر. اتبع الخطوات 1.1-1.3 ، ثم الدوامة على ارتفاع حتى يذوب البوليمر بالكامل (~ 10 دقائق).
  5. قم بإعداد منطقة عمل في غطاء الدخان باستخدام المعدات / المواد التالية بجوار الموجات فوق الصوتية: دوامة ، وماصتان زجاجيتان صغيرتان من Pasteur مع مصابيح مطاطية ، ولوحة تحريك مغناطيسية. ضع كوبا كبيرا مليئا بالماء المثلج على حامل أسفل الموجات فوق الصوتية.
  6. أضف 45 مل من 0.3٪ وزن / حجم فيتامين E-TPGS إلى دورق زجاجي سعة 200 مل بقضيب تقليب مغناطيسي واضبط سرعة التقليب على 360 دورة في الدقيقة.
  7. أضف 2 مل من 0.3٪ وزن / حجم فيتامين E-TPGS إلى أنبوب اختبار زجاجي مقاس 13 مم × 100 مم.
  8. إضافة الدواء:
    بالنسبة للعوامل الكارهة للماء: أضف المغلف مباشرة إلى محلول البوليمر (مع الحرص على تجنب جدران أنبوب الاختبار) وقم بتدوير الأنبوب حتى يتشتت المغلف بشكل متجانس.
    بالنسبة للعوامل المحبة للماء: قم بتغليف مستحلب بمحلول البوليمر قبل المتابعة. أضف ما يصل إلى 50 ميكرولتر من الدواء في الماء أو المخزن المؤقت إلى سطح محلول البوليمر. الموجات فوق الصوتية لفترة وجيزة لاستحلاب الدواء بالبوليمر (عادة 10 ثوان ، أو حسب الضرورة لتحقيق محلول متجانس وغير شفاف). يجب تنفيذ خطوة الصوتنة هذه على الجليد.
  9. ضع بوليمر / مغلف الأنبوب المفتوح بالقرب من الدوامة. أثناء الإمساك بأنبوب الاختبار الذي يحتوي على فيتامين E-TPGS عموديا وعلى دوامة عالية، استخدم ماصة باستور زجاجية لإضافة محلول البوليمر/المغلف بالتنقيط. احرص على تجنب جوانب الأنبوب وإسقاط محلول البوليمر مباشرة على سطح المستحلب الدوامي. بعد إضافة 1 مل بالكامل من محلول البوليمر إلى فيتامين E-TPGS ، استمر في دوامة المحلول (الآن مستحلب) لمدة 15 ثانية إضافية.
  10. انقل البوليمر المستحلب على الفور إلى الموجات فوق الصوتية. حافظ على أنبوب الاختبار مغمورا في الماء المثلج وقم بصوتنة المستحلب في ثلاث رشقات نارية مدتها 10 ثوان (سعة 40٪ لصوتنة 700 واط ، 1/8 في حجم طرف المسبار). حرك المستحلب لأعلى ولأسفل المسبار لضمان صوتنة متساوية ، مع الحرص على تجنب لمس المسبار على جانبي أو أسفل أنبوب الاختبار. توقف مؤقتا بين كل عشر ثوان صوتنة للسماح للحل بالتبريد قبل المتابعة.
  11. أضف 1-2 مل من 0.3٪ فيتامين E-TPGS من محلول التحريك إلى المستحلب باستخدام ماصة باستور زجاجية ، مما يخفف البوليمر المستحلب بحيث يصب بسهولة أكبر. أفرغ المستحلب في محلول التحليق. كرر هذه الخطوة لغسل أي محلول متبقي من أنبوب الاختبار إلى محلول التحريف.
  12. اترك الجسيمات النانوية تتصلب مع التحريك لمدة ثلاث ساعات. إذا كان المغلف حساسا للضوء ، فقد يتم لف الدورق بورق الألمنيوم ، مما يترك الجزء العلوي مفتوحا لتسهيل تبخر المذيبات.
< ص الفئة = "jove_title" >2. مجموعة الجسيمات النانوية

  1. قسم الجسيمات النانوية المتصلبة إلى أنبوبين للطرد المركزي Oak Ridge (حجم اسمي 30 مل) وتوازن في حدود 0.1 جم.
  2. الجسيمات النانوية لأجهزة الطرد المركزي في دوار بزاوية ثابتة لمدة 15 دقيقة عند 17,000 × جم. ستؤدي أوقات الطرد المركزي الأطول إلى جمع جزء أعلى من الجسيمات النانوية الأصغر.
  3. تخلص من المادة الطافية ، مع الحرص على عدم إزعاج حبيبات الجسيمات النانوية (قد يتم سكب الماء أو سحب ماصاته). أضف 15 مل diH2O واستخدم جهاز صوتي للحمام المائي و / أو دوامة لإعادة تعليق الجسيمات النانوية تماما.
  4. اجمع محتويات أنبوبي الطرد المركزي في أنبوب واحد وكرر الخطوات 2.1-2.3 2x أكثر ، ليصبح المجموع ثلاث غسلات في 30 مل من diH2O في كل مرة. يجب أن يكون حجم السائل لإعادة تعليق الحبيبات الأخيرة 4-5 مل
    يمكن إضافة نسبة وزن 1: 2 تريهالوز: بوليمر في هذه المرحلة كمادة تبريد (قم بتجميد كمية صغيرة من الجسيمات النانوية بدون تريهالوز لتصوير SEM). قد تؤدي بلورات الجليد التي تتشكل أثناء عملية التجميد إلى إتلاف سطح الجسيمات وإحداث التراكم ، وقد ثبت أن إدراج تريهالوز يحسن إعادة التعليق المنتظم والكامل للجسيمات النانوية PLGA13.
  5. انقل الجسيمات النانوية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 5 مل وقم بتجميدها عند -80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل.
  6. تحرك بسرعة حتى لا تذوب المحتويات المجمدة ، قم بفك غطاء الأنبوب وقم بتغطية الجزء العلوي عن طريق تثبيت أنسجة المختبر عبر الجزء العلوي بشريط مطاطي. ** في حالة حدوث أي ذوبان ، أعد التجميد قبل وضعه في المجفف بالتجميد.
  7. تجميد 72 ساعة لحجم 5 مل. قم بتخزين الجسيمات المجففة بالتجميد في أنبوب ملفوف ب Parafilm عند -80 درجة مئوية.
< p class = "jove_title" >3. التحجيم ومورفولوجيا السطح

المسح المجهري الإلكتروني

  1. يجب تحضير عينات من SEM في يوم التصوير. ضع شريطا من شريط الكربون على الوجهين على كعب SEM. يمكن استخدام علامة دائمة لتسمية الجزء المعدني من كعب الروتين للرجوع إليه لاحقا.
  2. استخدم ملعقة معدنية لجمع كمية صغيرة من الجسيمات النانوية المجففة بالتجميد ونشرها برفق عبر سطح الشريط. قم بتنظيف سطح كعب الروتين بأنسجة مختبر أو استخدم الهواء المضغوط لإزالة الجسيمات النانوية السائبة.
  3. قم بتغطية العينة بالذهب لمدة 30-120 ثانية. سينتج عن وقت الرش الأطول سطحا أكثر نعومة للتصوير ، على الرغم من أن هذا قد يؤدي إلى فقدان تفاصيل السطح الدقيقة.
  4. المعلمات النموذجية لتصور الجسيمات هي مسافة عمل من 5-15 مم ، وقوة شعاع من 5-12 كيلو فولت ، وحجم بقعة من 1-3. قد تؤدي قوة الحزمة العالية إلى تسخين إقليمي للعينة ، مما سيغير مورفولوجيا سطح الجسيمات. لوحظت الجسيمات الدقيقة عند تكبير 100X وسيتم تمييز الجسيمات النانوية عند تكبير 3,000X.
  5. ستتألف العينة المثالية من طلاء موحد للجزيئات عبر السطح المسطح للكعب. في بعض الأحيان ، قد تنتج الهياكل الثانوية (بما في ذلك الرقائق أو الكرات) عن التجميد بالتجميد. سيساعد التركيز على حافة التقشر ، حيث تلتقي القشرة بالشريط ، أو الجزء العلوي من الكرة في تحديد موقع الجسيمات التي يمكن تصورها بسهولة باستخدام SEM. اجمع ثلاث صور على الأقل لكل دفعة من أجل الحصول على عينة تمثيلية لحجم الجسيمات والتشكل.

النتائج

تظهر صور المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) النموذجية لجزيئات PLGA الدقيقة والنانوية التي تم تحضيرها باستخدام هذا البروتوكول في الشكلين 2a و 2b. ستظهر الجزيئات ككرات منفردة غير ملتحمة، ذات مورفولوجيا سطحية ملساء وتوزيع واسع النطاق من الأحجام موزعة في جميع أنحاء العينة.

لتحديد متوسط القطر لكل دفعة، يتم أخذ القياسات مباشرة من صور SEM باستخدام وظيفة "measure" في برنامج ImageJ. يجب أخذ 150 قياساً كحد أدنى لقطر الجسيمات المختارة عشوائياً من مجال الرؤية للحصول على توزيع حجمي ممثل. يعتمد الحجم المتوسط لدفعة من الجسيمات على معاملات التركيبة. فعلى سبيل المثال، في الشكل 2a، تشكلت جسيمات دقيقة (متوسط قطر 730 nm±370) باستخدام 1 ml من المذيب لكل 100 mg من PLGA، مع استخدام 0.05% من Vitamin E-TPGS في مرحلة الاستحلاب، بينما في الشكل 2b، تشكلت جسيمات نانوية (متوسط قطر 340 nm±70) باستخدام 4 ml من المذيب لكل 200 mg من PLGA، مع تغليف عقار camptothecin الكاره للماء واستخدام 0.3% من Vitamin E-TPGS في مرحلة الاستحلاب (معاملات التركيبة الكاملة موصوفة في تعليق الشكل). وبشكل عام، فإن التركيز الأعلى للمستحلب سيؤدي إلى إنتاج جسيمات أصغر، حيث يمكن تحقيق أقطار متوسطة تتراوح بين 220-2,000 nm عن طريق تغيير تركيز المستحلب من 0.3-0.01% (الشكل 3).

تتراوح إنتاجيتنا بين 74-98% (بناءً على 22 دفعة من الجسيمات النانوية باستخدام مذيبات ومستحلبات وظروف استحلاب متنوعة، أعدها باحث واحد). وقد تُلاحظ إنتاجية أعلى في الدفعات ذات الحجم الأكبر (>150 nm)، نظراً لأن الجسيمات النانوية الصغيرة تُفقد بسهولة أثناء خطوة الطرد المركزي والغسيل، لا سيما عند سكب السائل الطافي من فوق الراسب. ويمكن أن يساعد السحب الدقيق للسائل بواسطة الماصة في تجنب هذه المشكلة. كما يمكن أن يؤدي استخدام سرعات أعلى و/أو زيادة مدة الطرد المركزي إلى تحسين الإنتاجية، وذلك من خلال تحسين تجميع الجزء فائق الصغر من الجسيمات النانوية وأيضاً عن طريق ضغط الراسب لتقليل الفقد في خطوة الغسيل. يركز البروتوكول الموصوف هنا على إنتاج جسيمات باستخدام TPGS كعامل استحلاب وEtAc كمذيب، ومع ذلك، يمكن استخدام مذيبات و/أو عوامل استحلاب بديلة. وبوجه عام، وجدنا أن EtAc ينتج جسيمات نانوية أصغر وأكثر تجانساً في الحجم مقارنة بـ DCM (على سبيل المثال أقطار تبلغ 540 nm±190 مقابل 2,160 nm±1,530 لـ EtAc مقابل DCM، بتركيز 100 mg/ml من PLGA في المذيب، مستحلبة في 2 ml من TPGS بتركيز 0.1%)، ويفترض أن ذلك يعود إلى أن EtAc قابل للامتزاج بالماء، بينما DCM ليس كذلك. يعد PVA عامل استحلاب شائعاً استخدمناه نحن ومجموعات بحثية أخرى على نطاق واسع. وقد لاحظنا تبايناً في الجسيمات النانوية المحضرة من دفعات مختلفة من PVA المتاح تجارياً؛ لذا يُنصح بالنظر في استخدام نفس المخزون من PVA كلما أمكن ذلك لتحسين إمكانية تكرار النتائج. ومن خلال تجاربنا، وجدنا أن PVA يعمل كمستحلب أكثر فعالية عند تركيزات أعلى بكثير من TPGS (على سبيل المثال قطر يبلغ 140 nm±48، لتركيز 100 mg/ml من PLGA في DCM، مستحلبة في 2 ml من PVA بتركيز 5%).

يمكن أن يكون توصيف الجسيمات النانوية باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) أمراً صعباً بسبب الاختلافات في المعدات وعملية التصوير. لذا، من المهم التمييز بين السمات المورفولوجية التي تشير إلى وجود مشكلات في تكوين الجسيمات وبين العيوب الاصطناعية (artifacts) التي تظهر عن غير قصد أثناء التصوير. يُلاحظ أحياناً في صور SEM حدوث اندماج (الشكل 4a و 4b)، أو تنقير (الشكل 4c)، أو تشقق (الشكل 4f) في الجسيمات. تشير هذه العيوب أحياناً إلى جسيمات ضعيفة التكوين (على سبيل المثال في الشكل 4a، كان تركيز المستحلب مرتفعاً جداً بحيث تعذر تكوين جسيمات منفصلة)، ولكنها قد تنتج أيضاً عن عيوب اصطناعية تسببها طريقة التوصيف (على سبيل المثال في الشكل 4b، سخنت العينة أثناء عملية الطلاء بالترذيذ، وفي الشكل 4c، أدى التسخين الموضعي الناتج عن شعاع SEM إلى تغيير المورفولوجيا السطحية للجسيمات أثناء التصوير). ولتجنب عيوب التصوير، يجب تقليل وقت الطلاء بالترذيذ والحفاظ على قدرة الشعاع منخفضة. وتُلاحظ مورفولوجيا أكثر نعومة عند زيادة وقت الترذيذ، ومع ذلك، قد يؤدي ذلك إلى اندماج الجسيمات. أما أوقات الترذيذ القصيرة جداً فقد تجعل التصوير صعباً، حيث تصبح الجسيمات مشحونة وتتحرك أثناء التقاط الصورة. ويساعد التقاط الصور بسرعة في تجنب التعرض المطول للشعاع وتشوه الصور (الشكل 4d و 4e). كما يمكن أن يؤدي التعرض العالي للشعاع إلى تمدد وتشقق سطح الجسيمات النانوية (الشكل 4f). وإذا تعذر تقليل عيوب المورفولوجيا عن طريق تغيير معاملات التوصيف، فمن المحتمل أن تكون هذه العيوب تعبيراً عن مشكلات حقيقية في الجسيمات النانوية نفسها. فخلال عملية التصنيع، قد ينتج الاندماج عن ارتفاع درجة الحرارة بسبب قدرة الموجات فوق الصوتية العالية، أو التبخر غير الكامل للمذيب، أو إعادة التعليق غير الكاملة خلال مرحلة الغسيل، أو فشل عملية التجفيف بالتجميد (lyophilization).

عملية فصل الزيت والماء؛ المعالجة بالموجات فوق الصوتية، التبخير، التجميع؛ مخطط التجفيف بالتجميد.
الشكل 1. مخطط توضيحي لتصنيع الجسيمات النانوية. انقر هنا لعرض صورة أكبر.

بنية الجسيمات النانوية (SEM) وتوزيع الحجم (μm, nm)، مخطط تحليل مقارن.
الشكل 2. صور SEM وتوزيعات الحجم المقابلة لجسيمات PLGA الدقيقة والنانوية المنتجة بطريقة المستحلب المفرد. في (A)، تم تكوين الجسيمات عن طريق استحلاب 100 mg من PLGA المذاب في 1ml من ethyl acetate في 2 ml من 0.05% Vitamin E-TPGS، وتم تصليدها في 45 ml من 0.01% Vitamin E-TPGS. يظهر توزيع الحجم المقابل في (C). في (B)، تم تكوين الجسيمات عن طريق استحلاب 200 mg من PLGA و40mg من camptothecin المذابين في 4mL من ethyl acetate في 4 ml من 0.3% Vitamin E-TPGS، وتم تصليدها في 90 ml من 0.3% Vitamin E-TPGS. يظهر توزيع الحجم المقابل في (D). انقر هنا لعرض صورة أكبر.

تحليل حجم الجسيمات؛ يوضح المخطط البياني وصور SEM تأثير نسبة TPGS على حجم الكرات المجهرية.
الشكل 3. يعتمد حجم الجسيمات على تركيز المستحلب. أدى زيادة تركيز Vitamin E-TPGS إلى الحصول على جسيمات نانوية أصغر حجماً. تظهر الأقطار المتوسطة وصور SEM المقابلة لجسيمات تم تحضيرها عن طريق استحلاب 100 mg من PLGA المذاب في 1 ml من ethyl acetate في (A) 0.01%، أو (B) 0.05%، أو (C) 0.1%، أو (D) 0.3% من Vitamin E-TPGS، ثم تصليدها في 45 ml من Vitamin E-TPGS بتركيز 0.3%. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري لـ 200 قياس للقطر تم إجراؤها من صورتين لدفعة واحدة. يمثل شريط المقياس 5 μm لـ (A-C) و 200 nm لـ (D).انقر هنا لعرض صورة أكبر.

صورة مجهرية SEM توضح مورفولوجيا الجسيمات وتجمعها. تحليل البنية المجهرية للمسحوق.
الشكل 4. عيوب المورفولوجيا السطحية الملحوظة باستخدام مجهر SEM. في (A)، ظهر اندماج كثيف وهياكل تشبه الصفائح في كامل العينة. كان تركيز Vitamin E-TPGS مرتفعاً جداً (1%) بحيث لم تتشكل جسيمات منفصلة. وفي (B)، اندمجت بعض مناطق العينة، ومع ذلك، وجدت جيوب كبيرة من الجسيمات النانوية المنفصلة، خاصة في المناطق التي كانت بها فجوات في طبقة الطلاء بالترذيذ (sputter coat). نعتقد أن عيوب الاندماج هذه تعود إلى التسخين أثناء عملية الطلاء بالترذيذ. وفي (C)، بدت الجسيمات ملساء في البداية، إلا أن التعرض المستمر للعينة لحزمة مجهر SEM أدى إلى ظهور تنقير وتجعيد. ويوضح الشكل (D) صورة ذات دقة منخفضة تم التقاطها مع الحد الأدنى من تعرض العينة لحزمة SEM؛ حيث تظهر الجسيمات ملساء وبمورفولوجيا مستديرة. وفي (E)، تعرضت العينة نفسها لفترة زمنية أطول، ولوحظ تشوه واضح في مورفولوجيتها الأصلية. وفي (F)، أدى التعرض الطويل للحزمة عند إعداد جهد عالٍ (12 kV) إلى تسخين وتشقق الجسيمات. انقر هنا لعرض صورة أكبر.

المناقشة

عادة ما يتم تحضير جزيئات PLGA بواسطة مستحلب أحادي أو مزدوج ، وهي طريقة توفر القدرة على تخصيص خصائص الجسيمات مثل الحجم والمغلف وخصائص السطح7. تعتمد هذه الخصائص وغيرها على العديد من المتغيرات ، بما في ذلك نوع المذيب ونسب التغذية وطريقة الاستحلاب ونوع المستحلب. ومع ذلك ، في تجربتنا ، من الممكن لمجرب واحد إنتاج جزيئات ذات خصائص متسقة. باستخدام نفس البروتوكول ، أنتج مجرب مدرب جيدا سبع دفعات منفصلة من الجسيمات النانوية بمتوسط الأقطار التالية: 317 نانومتر ±99 ، 342 نانومتر ±112 ، 298 نانومتر ±104 ، 361 نانومتر ±110 ، 339 نانومتر ±115 ، 360 نانومتر ±123 ، و 364 نانومتر ±110. ينتج عن متوسط دفعات المجرب المدرب جيدا متوسط قطر 340 نانومتر ±25 ومتوسط انحراف معياري داخل الدفعة يبلغ 110 نانومتر ±8. استخدم المجرب الثاني ، الذي دربه الأول ، نفس البروتوكول لإنتاج جسيمات نانوية يبلغ متوسط قطرها 328 نانومتر ±138. ومع ذلك ، اتبع متجرب ثالث ، كان يصنع الجسيمات النانوية بشكل مستقل لعدة أشهر ، نفس البروتوكول لإنتاج جسيمات نانوية يبلغ متوسط قطرها 220 نانومتر ±70. وبالتالي ، من الممكن صنع جزيئات ذات نطاق متوقع من الأقطار ، لكن هذا يعتمد على النسخ المتماثل الدقيق للتقنية التجريبية الدقيقة. قد يمكن تجميع الدفعات من إنتاج كميات كبيرة من الجسيمات النانوية ذات الخصائص الركامية المتطابقة. على سبيل المثال ، عندما نقوم بتعديل الجسيمات النانوية على السطح للدراسة في المختبر أو في الجسم الحي ، يتم تحضير دفعات متعددة (تصل إلى 6) 200 مجم وغسلها وجمعها وخلطها في أنبوب واحد ، ثم تقسيمها لتعديل السطح. هذا يضمن أن حجم الجسيمات النانوية ، وتحميل الدواء ، والشحنة ، وجزء من مواقع السطح المتاحة للتعديل ستكون قابلة للمقارنة بين مجموعتين من العلاج. في مثال آخر ، إذا كان المتغير محل الاهتمام هو فعالية الدواء مع تحميل عوامل مختلفة في دفعات مختلفة من الجسيمات النانوية ، فمن المهم قياس التباين في تحميل الدواء والتحكم فيه. من الأهمية بمكان قياس خصائص الجسيمات لكل دفعة من الجسيمات المنتجة ، وتصميم التجارب وتكرارها للتحكم في التباين من دفعة إلى دفعة.

يعد المستحلب الكامل للمراحل العضوية والمائية أمرا بالغ الأهمية لتكوين جزيئات صغيرة. بولي (كحول الفينيل) (PVA) ربما يكون المستحلب الأكثر استخداما. لقد استخدمنا نحن وآخرون مجموعة متنوعة من عوامل الاستحلاب والتثبيت ، بما في ذلك فيتامين E-TPGS9 ، PVA14 ، يمتد15 ، و poloxamers16 (لمناقشة شاملة لمجموعة واسعة من العوامل المستخدمة لإنتاج جزيئات PLGA ، انظر المراجعة التي أجراها Wischke et al.17). سيظهر البوليمر المستحلب بشكل صحيح كمحلول متجانس ، أبيض حليبي / معتم. سيظهر المستحلب الضعيف (أو "المكسور") عدم تجانس أو حبيبات عيانية ، وقد ينقسم إلى طبقتين متميزتين بصريا في الأنبوب. يشير هذا بشكل عام إلى فشل تكوين الجسيمات النانوية. قد ينكسر المستحلب بعد الخطوة 1.9 إذا لم يتم نقله على الفور إلى الموجات فوق الصوتية. إذا حدث هذا ، فقم بالدوامة مرة أخرى حتى تصبح متجانسة وانتقل على الفور إلى الصوت. لا ينبغي أن يحدث الانفصال بعد خطوة الصوتنة (1.10). بمجرد تشتيت الجسيمات في حجم مائي أكبر (الخطوة 1.11) ، يجب أن يكون المحلول معتما بشكل موحد إلى شفاف قليلا. ستزداد الجودة الشفافة مع انخفاض حجم الجسيمات ، ويمكن ملاحظة اللون الأزرق للجسيمات النانوية الصغيرة جدا. قد لا يتم ملاحظة هذا اللون إذا كانت الجسيمات تغلف دواء. إذا فشل المستحلب في التشتت بشكل موحد في الحجم المائي الكبير أو بدا حبيبيا ، فلا ينبغي أن تستمر التجربة. من الطبيعي ملاحظة بعض الاختلاف في مظهر حبيبات الجسيمات ، وكذلك تماسكها. قد تعليق بعض الكريات على دوامة خفيفة, في حين أن البعض الآخر قد يستغرق عدة دقائق من صوتنة حمام مائي. يجب ألا تستغرق إعادة التعليق أكثر من 5 دقائق. قد تأخذ الجزيئات المجففة بالتجميد مجموعة متنوعة من القوام من الشبيهة بالقطن إلى التدفق الحر.

تتمثل إحدى المزايا العديدة ل PLGA كمادة للجسيمات النانوية في القدرة على تحسين عملية التصنيع لإنشاء الحجم المطلوب للجسيمات للتطبيق المقصود. سوف تغلف الجسيمات النانوية الأكبر حجما جزءا أعلى من الدواء الكاره للماء (بالنسبة لوزن البوليمر) من الجسيمات النانوية الصغيرة ، ومع ذلك ، قد تتأثر حركية إطلاق الدواءأيضا 18-20. حجم الجسيمات النانوية له تأثير مباشر على آليات استيعاب الجسيمات بواسطة الخلايا ، وكذلك توزيعها في الأنسجة ، مما قد يؤدي إلى اختلافات كبيرة في فعالية التوصيل. على سبيل المثال ، سيقوم نظام البلعمة أحادية النواة بتمييز وإزالة العوامل الموجودة في الدورة الدموية الجهازية التي يزيد حجمها عن 1 ميكرومتر. قد تكون الجسيمات النانوية الصغيرة ذات أهمية للتسريب المباشر في الدماغ ، حيث يتم احتجاز الجسيمات النانوية الأكبر حجما في المصفوفة الضيقة خارج الخلية. قد يسهل توصيل الجسيمات النانوية الصغيرة أيضا الاستهداف السلبي للأورام عبر تأثير النفاذية والاحتفاظ المعزز. تختلف كفاءة تغليف الدواء بشكل كبير ، اعتمادا على خصائص الدواء المحدد ، وحجم الجسيم ، والمستحلب (أي قابليته للذوبان في الماء مقابل المذيب). سيؤثر المستحلب الفردي مقابل المستحلب المزدوج أيضا على تحميل الدواء وحجم الجسيمات النانوية. قد يساعد تغليف العوامل الكارهة للماء عبر مستحلب واحد في إنتاج جزيئات نانوية صغيرة جدا ، مقارنة بطريقة المستحلب المزدوج. نوجه القارئ إلى موارد أخرى لمناقشة مستفيضة لهذا الموضوع23-28. أخيرا ، تتوفر طرق استحلاب بديلة ، بما في ذلك التجانس عالي السرعة ، وقد توفر هذه الأساليب الأخرى مزايا لأنواع معينة من الأدوية أو تطبيقات توصيل الأدوية29.

توفر طريقة المستحلب الفردي فرصة لتغيير مجموعة واسعة من متغيرات الصياغة ، كل منها قادر على تغيير خصائص الجسيمات النانوية. على سبيل المثال ، سيؤدي استخدام ثنائي كلورو ميثان (DCM) كمذيب بدلا من ذلك إلى إنتاج جزيئات نانوية أكبر بتوزيع أكبر حجما. نظرا لأن أسيتات الإيثيل (EtAc) قابلة للامتزاج في الماء ، فإن التوتر السطحي لقطرة البوليمر في المستحلب الأساسي ينخفض ، مما ينتج عنه جزيئات نانوية أصغر. يمكن استبدال DCM بنفس حجم EtAc. يمكن استخدام مذيبات بديلة أو مزيج من المذيبات لتحسين تغليف الدواء وخصائص الجسيمات. معلمات الصياغة الأخرى قادرة أيضا على تغيير حجم الجسيمات: على سبيل المثال ، زيادة حجم المذيب ، نسبة المذيب: البوليمر ، شدة الصوتنة ، أو سرعة / مدة الطرد المركزي ستؤدي جميعها إلى انخفاض حجم الجسيمات المجمعة. من الممكن تغيير حجم الجسيمات عن طريق إجراء الطرد المركزي المتسلسل (على سبيل المثال ، طرد مركزي سريع ومنخفض السرعة لإزالة الجسيمات الكبيرة أولا ، متبوعا بدوران أطول لجمع الجسيمات الصغيرة جدا) أو التصفية.

هنا ، نصف معلمات الصياغة التي تتيح تحضير جزيئات PLGA بأقطار متوسطة تتراوح من 220 نانومتر إلى 1.98 ميكرومتر. يمكن استخدام هذه الطرق لإنتاج الجسيمات المكونة من PLGA لتحسين تصميم الجسيمات (الحجم والمغلف وخصائص السطح) لتطبيق توصيل الدواء في المستقبل في المختبر أو في الجسم الحي.

الإفصاحات

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

المؤلفون ليس لديهم اعترافات.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
بولي(حمض اللاكتيك-كو-الجليكوليك)  (PLGA)figure-materials-1 LactelB6010-2Pاللزوجة المتأصلة: 0.55-0.75 dl/g
إيثيل أسيتات (EtAc)Sigma270989
كلوريد الميثيلين (DCM)
Vitamin E TPGSSigma57668
بولي (كحول الفينيل)87-89% hydrolized, 30,000-70,000 Da
المعدات
جهاز التفكيك الصوتي (Sonic Dismembrator)Fisher ScientificModel 705700 W (Ultrasonicator)
رأس جهاز السونيكيتورFisher Scientific1/8 in
جهاز خلط دوامي (Vortexer)VWR58816-121
محرك مغناطيسي متعدد المواضعCorningMP5I
جهاز طرد مركزي فائق السرعةBeckman-CoulterL8-80M
دوار ثابت الزاويةBeckman-Coulter50.2TI
جهاز سونيكيتور بحمام مائيFisher ScientificFS30
جهاز تجفيف بالتجميد (Lyophilizer)MillrockBT85

المراجع

  1. Peer, D., et al. Nanocarriers as an emerging platform for cancer therapy. Nat. Nanotechnol. 2, 751-760 (2007).
  2. Jiang, W., Gupta, R. K., Deshpande, M. C., Schwendeman, S. P. Biodegradable poly(lactic-co-glycolic acid) microparticles for injectable delivery of vaccine antigens. Adv. Drug Deliv. Rev. 57, 391-410 (2005).
  3. Haag, R., Kratz, F. Polymer therapeutics: Concepts and applications. Angew. Chem. 45, 1198-1215 (2006).
  4. Tong, R., Cheng, J. Anticancer polymeric nanomedicines. Polym. Rev. 47, 345-381 (2007).
  5. Kumari, A., Yadav, S. K., Yadav, S. C. Biodegradable polymeric nanoparticles based drug delivery systems. Colloids and Surf. B Biointerfaces. 75, 1-18 (2010).
  6. Anderson, J. M., Shive, M. S. Biodegradation and biocompatibility of PLA and PLGA microspheres. Adv. Drug Deliv. Rev. 28, 5-24 (1997).
  7. Jain, R. A. The manufacturing techniques of various drug loaded biodegradable poly(lactide-co-glycolide) (PLGA) devices. Biomaterials. 21, 2475-2490 (2000).
  8. Danhier, F., et al. PLGA-based nanoparticles: An overview of biomedical applications. J. Control. Rel. 161, 505-522 (2012).
  9. Mu, L., Feng, S. S. A novel controlled release formulation for the anticancer drug paclitaxel (Taxol): PLGA nanoparticles containing vitamin E TPGS. J. Control. Rel. 86, 33-48 (2003).
  10. Mu, L., Feng, S. S. PLGA/TPGS nanoparticles for controlled release of paclitaxel: effects of the emulsifier and drug loading ratio. Pharm. Res. 20, 1864-1872 (2003).
  11. Collnot, E. M., et al. Vitamin E TPGS P-glycoprotein inhibition mechanism: influence on conformational flexibility, intracellular ATP levels, and role of time and site of access. Mol. Pharm. 7, 642-651 (2010).
  12. Dintaman, J. M., Silverman, J. A. Inhibition of P-glycoprotein by D-alpha-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate (TPGS). Pharm. Res. 16, 1550-1556 (1999).
  13. Zhou, J., et al. Highly-penetrative, drug-loaded nanocarriers improve treatment of glioblastoma. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. , (2013).
  14. Cartiera, M. S., Johnson, K. M., Rajendran, V., Caplan, M. J., Saltzman, W. M. The uptake and intracellular fate of PLGA nanoparticles in epithelial cells. Biomaterials. 30, 2790-2798 (2009).
  15. Niwa, T., Takeuchi, H., Hino, T., Nohara, M., Kawashima, Y. Biodegradable submicron carriers for peptide drugs: Preparation of dl-lactide/glycolide copolymer (PLGA) nanospheres with nafarelin acetate by a novel emulsion-phase separation method in an oil system. Int. J. Pharm. 121, 45-54 (1995).
  16. Ameller, T., et al. Polyester-poly(ethylene glycol) nanoparticles loaded with the pure antiestrogen RU 58668: physicochemical and opsonization properties. Pharm. Res. 20, 1063-1070 (2003).
  17. Wischke, C., Schwendeman, S. P. Principles of encapsulating hydrophobic drugs in PLA/PLGA microparticles. Int. J. Pharm. 364, 298-327 (2008).
  18. Batycky, R. P., Hanes, J., Langer, R., Edwards, D. A. A theoretical model of erosion and macromolecular drug release from biodegrading microspheres. J. Pharm. Sci. 86, 1464-1477 (1997).
  19. Panyam, J., et al. Polymer degradation and in vitro release of a model protein from poly(D,L-lactide-co-glycolide) nano- and microparticles. J. Control. Rel. 92, 173-187 (2003).
  20. Siepmann, J., Faisant, N., Akiki, J., Richard, J., Benoit, J. P. Effect of the size of biodegradable microparticles on drug release: Experiment and theory. Journal of Controlled Release. 96, 123-134 (2004).
  21. Desai, M. P., Labhasetwar, V., Walter, E., Levy, R. J., Amidon, G. L. The mechanism of uptake of biodegradable microparticles in Caco-2 cells is size dependent. Pharm. Res. 14, 1568-1573 (1997).
  22. Alexis, F., Pridgen, E., Molnar, L. K., Farokhzad, O. C. Factors affecting the clearance and biodistribution of polymeric nanoparticles. Mol. Pharm. 5, 505-515 (2008).
  23. Barichello, J. M., Morishita, M., Takayama, K., Nagai, T. Encapsulation of hydrophilic and lipophilic drugs in PLGA nanoparticles by the nanoprecipitation method. Drug Dev. Ind. Pharm. 25, 471-476 (1999).
  24. Mundargi, R. C., Babu, V. R., Rangaswamy, V., Patel, P., Aminabhavi, T. M. Nano/micro technologies for delivering macromolecular therapeutics using poly(d,l-lactide-co-glycolide) and its derivatives. J. Control. Rel. 125, 193-209 (2008).
  25. Niwa, T., Takeuchi, H., Hino, T., Kunou, N., Kawashima, Y. Preparations of biodegradable nanospheres of water-soluble and insoluble drugs with D,L-lactide/glycolide copolymer by a novel spontaneous emulsification solvent diffusion method, and the drug release behavior. J. Control. Rel. 25, 89-98 (1993).
  26. Yang, Y. Y., Chia, H. H., Chung, T. S. Effect of preparation temperature on the characteristics and release profiles of PLGA microspheres containing protein fabricated by double-emulsion solvent extraction/evaporation method. J. Control. Rel. 69, 81-96 (2000).
  27. Yang, Y. Y., Chung, T. S., Ping Ng, N. Morphology, drug distribution, and in vitro release profiles of biodegradable polymeric microspheres containing protein fabricated by double-emulsion solvent extraction/evaporation method. Biomaterials. 22, 231-241 (2001).
  28. Zhang, Z., Feng, S. S. The drug encapsulation efficiency, in vitro drug release, cellular uptake and cytotoxicity of paclitaxel-loaded poly(lactide)-tocopheryl polyethylene glycol succinate nanoparticles. Biomaterials. 27, 4025-4033 (2006).
  29. Astete, C. E., Sabliov, C. M. Synthesis and characterization of PLGA nanoparticles. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 17, 247-289 (2006).
  30. Gaumet, M., Gurny, R., Delie, F. Fluorescent biodegradable PLGA particles with narrow size distributions: Preparation by means of selective centrifugation. Int. J. Pharm. 342, 222-230 (2007).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة