مقالة منهجية

بروتوكول الأمثل لإعداد Wholemount الشبكية للتصوير والمناعية

DOI:

10.3791/51018

⸱

ديسمبر 13, 2013

 ,  ,  , 
1Ophthalmology, Weill Medical College of Cornell University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البروتوكول الموصوف هنا مخصص للتقييم الهيكلي لإعداد الشبكية الكاملة. يتضمن ذلك أوصافا لتشريح الأنسجة ، والتركيب على غشاء متعدد تترافلورو إيثيلين مجفف بالماء (PTFE) ، وتحميل البلعة بعلامات الفلورسنت ، ومقارنة التثبيت مع الكربوديميد وبارافورمالديهايد للتحليل الكيميائي المناعي للمكونات الخلوية والمشبكية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن أن يكون العمل مع الأنسجة الحساسة عاملا معقدا عند إجراء التقييم الكيميائي المناعي. هنا ، نقدم طريقة تستخدم غشاء PTFE المجفف بالماء المدعوم بالحلقة لتوفير الدعم الهيكلي لكل من الأنسجة الحية والثابتة أثناء المعالجة الكيميائية المناعية ، مما يسمح باستخدام مجموعة متنوعة من البروتوكولات التي من شأنها أن تسبب ضررا للأنسجة. أولا ، يتضح ذلك من خلال تحميل بلعة علامات الفلورسنت في أنسجة الشبكية الحية. تسمح هذه الطريقة بالتصور السريع للهياكل المستهدفة ، بينما يحافظ دعم الغشاء على سلامة الأنسجة أثناء الحقن ويسمح بنقل المستحضر بسهولة لمزيد من التصوير أو المعالجة. < p class = "jove_content" >ثانيا ، يتم وصف إجراء تلطيخ الأجسام المضادة في الأنسجة المثبتة بالكربوديميد. على الرغم من أن تثبيت بارافورمالديهايد أكثر شيوعا ، إلا أن تثبيت الكربوديميد يوفر ركيزة فائقة لتصور البروتينات المتشابكة. أحد قيود الكربوديميد هو أن الأنسجة الثابتة الناتجة هشة نسبيا. ومع ذلك ، يتم التغلب على ذلك باستخدام الغشاء الداعم. تستخدم أنسجة الشبكية لإثبات هذه التقنيات ، ولكن يمكن تطبيقها على أي نسيج هش.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يؤدي إجراء الكيمياء المناعية في الأنسجة السليمة الحساسة إلى خطر التلف أثناء المناولة والنقل. يمكن أن يحدث هذا إما في شرائح الدماغ أو الأنسجة الرقيقة الأخرى ، مثل شبكية العين المتدهورة. بالإضافة إلى ذلك ، هناك طرق معينة لتثبيت الأنسجة يمكن أن تكون مفيدة للتلوين المناعي للهياكل العصبية ، ولكنها تؤدي إلى ضعف الاستقرار الهيكلي ، مما يحول دون استخدامها. مثال خاص على ذلك هو التثبيت القائم على الكربوديميد، والذي يتفوق على تلطيخ المستقبلات والهرموناتمن 1 إلى 7 ولكن عادة ما يتم تجنبه بسبب عدم استقرار الأنسجة الثابتة.

هنا ، نصف إجراء يستخدم غشاء PTFE مجفف بالماء لدعم الأنسجة الحساسة هيكليا ، سواء كانت ثابتة أو غير ثابتة ، لمجموعة متنوعة من تقنيات التلوين. يسمح الغشاء الداعم بمعالجة الأنسجة الحساسة قبل التثبيت وبعده ، مما يسمح بعدة خطوات للمعالجة مع تقليل مخاطر تلف الأنسجة. بشكل عام ، توفر هذه الطريقة البسيطة للحفاظ على سلامة الأنسجة الفرصة لاستخدام التقنيات التي يمكن تجنبها. على هذا النحو ، يمكن أيضا استخدام هذا النهج بنجاح لإعداد مجموعة متنوعة من الأنسجة مثل شرائح الدماغ التي تصبح هشة بعد إجراءات التقطيع.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_content">في جميع الإجراءات التجريبية ، تم التعامل مع وفقا للوائح الواردة في بيان ARVO لاستخدام في أبحاث طب العيون والرؤية ووفقا للبروتوكولات المعتمدة من قبل كلية طب وايل كورنيل. تم القتل الرحيم للحيوانات عن طريق ثاني أكسيد الكربون وخلع عنق الرحم اللاحق.

< p class = "jove_title" >1. تشريح شبكية العين الكاملة

  1. بعد القتل الرحيم للفأر ، قم بنزع عينيه ووضعهما في محلول Ringer المخزن بالأكسجين HEPES (الجدول 1).
  2. قم بإزالة القرنية عن طريق القطع في مسار دائري على طول أورا سيراتا بمقص صغير ، مع إمساك العين عند الأطراف بالملقط. اسحب العدسة بالملقط.
  3. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الجسم الزجاجي باستخدام ملقط ذو حافة ضعيفة. هذه الخطوة مهمة لحقن البلعة والتسجيلات الفيزيولوجية الكهربية. ليس ضروريا عند إجراء الكيمياء المناعية وحدها.
  4. افصل شبكية العين عن واقية العين عن طريق وضع ملقط بين شبكية العين وكوب العين ، وتحريك الملقط ببطء حول المحيط. قم بتثبيت كوب العين عن طريق إمساك الصلبة بإحكام بمجموعة ثانية من الملقط. قطع العصب البصري في الموقع بين الشبكية وواقية العين لتسهيل فصل الشبكية عن الواقية.
  5. يمكن تشريح شبكية العين إلى قطع (مثل أرباع) أو استخدامها ككل. للتقطيع إلى قطع ، استخدم المقص لعمل شقوق من محيط الشبكية وصولا إلى العصب البصري. بدلا من ذلك ، لاستخدام شبكية العين بأكملها ، قم بعمل شقوق من المحيط في منتصف الطريق إلى العصب البصري. سوف تساعد الشقوق على عمل تحضير مسطح.
فئة

2. التركيب على إدراج غشاء PTFE المجفف بالماء

  1. تحضير الغشاء كما هو موضح أدناه. عند إجراء التسجيلات الفسيولوجية أو تجارب حقن الصبغة ، قم بتقصير الحامل باستخدام مخرطة أو منشار يدوي بحيث يبلغ ارتفاع الحلقة المتبقية 1 ><مم. ملاحظة: قد تكون إدخالات لوحة الثقافة إما غير معدلة أو معدلة (الشكل 1 أ). يتم تحديد اختيار التكوين من خلال الغرض من التجربة. بالنسبة للتلوين المناعي ، فإن الإدخال غير المعدل مناسب.
  2. قم بتلميع الأسطح الخشنة بورق صنفرة ناعم (300 حصى أو أعلى).
  3. (اختياري) قم بإزالة القدمين أسفل الحلقة بالمقص.
  4. لإزالة أي حطام ، اشطف الغشاء أو صوتيه في الماء المقطر لمدة 2-3 دقائق.
  5. قم بتركيب الأنسجة على الغشاء (الشكل 1 أ). ضع الأنسجة مع بعض المحلول فوق الغشاء باستخدام ماصة نقل بلاستيكية. اقطع الطرف الضيق للماصة إذا لزم الأمر، لتجنب التصاق عينة الأنسجة بالماصة أثناء النقل.
  6. اربط شبكية العين بخلايا العقدة (GCs) لأعلى: على الغشاء ، قم بإزالة المحلول تدريجيا أثناء نشر شبكية العين وفتح الطيات بالملقط.
  7. على الجانب الآخر من الغشاء ، ضع حقنة فارغة (1 مل) أسفل الأنسجة مباشرة. ضع الشفط عن طريق سحب المكبس للخلف إلى حجم 0.2-0.3 مل. قم بزيادة مساحة سطح الشفط عن طريق قطع طرف تثبيت المحقنة قبل الاستخدام. لا يتطلب النسيج مزيدا من العلاج للالتصاق ، لأنه متشابك جسديا داخل الغشاء.
فئة

3. حقن بلعة Isolectin Alexa 488

  1. تحضير ماصات التصحيح ومحلول التلوين. اسحب ماصات الرقعة من زجاج البورسليكات الشعري باستخدام مجتذب مشتعل/بني ، بمقاومة ~ 1 MΩ. اكسر طرف الماصة برفق.
  2. اصنع محلول تلطيخ عن طريق إضافة 0.3 ميكرولتر من محلول مخزون إيسولكتين Alexa 488 إلى 10 ميكرولتر من محلول Ringer المخزن مؤقتا ب HEPES الموضح في الخطوة 1.2.
  3. انقل العينة إلى إعداد مشبك التصحيح للحقن (الشكل 1 ج). ضع الغشاء مع الأنسجة المرفقة في غرفة التسجيل المليئة بمحلول Ringer الدافئ (37 درجة مئوية) والأكسجين المخزن HEPES.
  4. ضع الماصة المحتوية على صبغة على الغشاء المحدد الداخلي (ILM، الشكل 2 أ). باستخدام أداة المعالجة الدقيقة ، قم بدفع الماصة بشكل أكبر مقابل ILM حتى تخترقها. حقن محلول التلوين بضغط 10-20 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 1 ثانية باستخدام بيكوسبريتزرز. قد يتم استهداف مواقع فردية أو متعددة للحقن (الشكل 2 ب). في حالة عدم توفر بيكوسبريتزر ، يمكن استخدام حقنة سعة 10 مل لتوصيل ضغط هواء إيجابي للحقن.
  5. احتضان الأنسجة المحقونة لمدة 10 دقائق. أثناء الحضانة ، يمكن رؤية الأنسجة المحقونة تحت إضاءة التألق.
  6. بعد وضع العلامات ، يمكن نقل المستحضر إلى المجهر للتصوير. انقل الملحق إلى طبق ثقافة ذو قاع زجاجي ، مع وضع جانب الشبكية لأسفل (الشكل 1 ج).
  7. أضف قطرة من محلول HEPES للحفاظ على رطوبة العينة.
  8. ضع 2-3 بقع من الشحوم المفرغة حول محيط الحلقة البلاستيكية لتثبيت الملحق بإحكام في قاع طبق الثقافة.
  9. انقل الطبق إلى مرحلة المجهر.
< p class = "jove_title" >4. تثبيت بارافورمالديهايد وكاربوديميد

  1. قم بإصلاح العينة عن طريق نقل الملحق إلى مثبت لمدة 15 دقيقة ، ويمكن استخدام أوقات تثبيت أطول أو أقصر ، اعتمادا على التطبيق. يمكن استخدام كلا المثبتين بشكل فعال لإصلاح GFP أو isolectin أو هيدرازيدات Alexa الفلورية (على سبيل المثال تستخدم لملء الخلايا في تسجيلات المشبك التصحيح).
    ملاحظة: للتثبيت ، يمكن استخدام محاليل 4٪ carbodiimide أو 4٪ paraformaldehyde. للحفاظ على الالتصاق ، يجب أن يتم التثبيت بعد أن يتم ربط الأنسجة بالغشاء بالفعل. يمكن تثبيت الأنسجة مباشرة بعد التركيب ، أو بعد التسجيل الفسيولوجي و / أو حقن البلعة.
  2. اشطف الأنسجة في محلول الفوسفات (PB) لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، يمكن معالجة الأنسجة إما كحامل كامل (الخطوة 5) أو تقطيعها إلى أقسام رأسية ثم معالجتها (الخطوتان 6 و 7).
< p class = "jove_title" >5. التلوين المناعي لشبكية العين

  1. في طبق مكون من 24 بئرا (الشكل 1 د) ، قم بحظر قطع الشبكية على الغشاء لمدة 1 ساعة في محلول تلطيخ.
    2. قم
  2. بتخفيف الأجسام المضادة الأولية للفأر المضادة ل PSD-95 1: 300 في محلول التلوين وتطبيقه لمدة 48 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. أضف ~ 100-150 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة في كل بئر مع الأنسجة. لمنع الجفاف ، املأ الآبار غير المستخدمة بالماء المقطر.
  3. اشطفها لمدة 20 دقيقة في PB ، 3x.
  4. احتضان لمدة 24 ساعة في الحمار المضاد للفأر Alexa 568 الجسم المضاد الثانوي المذاب 1: 500 في محلول التلوين.
  5. اشطفها لمدة 20 دقيقة في PB ، 3x.
  6. ضع الملحق مع الأنسجة الملطخة في طبق بتري قياسي مقاس 3 سم مملوء بمحلول PB. باستخدام مقص صغير ، قم بقطع جزء الغشاء الذي يحتوي على شبكية العين من الحلقة.
  7. انقل شبكية العين على الغشاء إلى شبكية العين المنزلقة لأعلى. قم بإزالة PB ، أضف وسيط التركيب. ضع قطعا صغيرة من زجاج الغطاء المكسور بين الشريحة وأكواب الغطاء لتجنب الضغط الشديد وتلف شبكية العين. ضع غطاء.
  8. أغلق الغطاء في مكانه بطلاء الأظافر. احتفظ بالشرائح في الظلام في الثلاجة.
فئة

6. التقسيم الرأسي للأنسجة المثبتة على الغشاء

  1. بعد التثبيت ، اغمر الأنسجة الموجودة على الغشاء في محاليل تدرج السكروز بنسبة 10٪ و 20٪ و 30٪ سكروز لمدة 30 دقيقة و 1 ساعة وبين عشية وضحاها على التوالي. يتم تنفيذ الخطوة الليلية عند 4 درجات مئوية في الثلاجة ، وجميع الخطوات الأخرى في درجة حرارة الغرفة.
  2. باستخدام المقص ، قم بإزالة الغشاء مع الأنسجة من حلقة الإدخال البلاستيكية.
  3. ضع الغشاء المقطوع على بارافيلم مع شبكية العين لأعلى وقم بإزالة أكبر قدر ممكن من المحلول باستخدام Kimwipes.
  4. ضع البارافيلم مع الأنسجة في غرفة ناظم البرد وأضف قطرة من وسط OCT. استخدم جهاز الفريزر السريع لتسريع التجميد.
  5. افصل العينة المجمدة واقلبها.
  6. قطع OCT المجمدة الزائدة. اترك حوالي 2 مم حول العينة من ثلاثة جوانب ، واترك 5-6 مم من الجانب الذي سيتم توصيله بالحامل.
  7. قم بتغطية جانب الشبكية المكشوف (جانب الغشاء) بقطرة من OCT. اترك منطقة التثبيت خالية.
  8. تجميد الغشاء بأنسجة الشبكية. الآن العينة جاهزة لوضعها على حامل القطع.
  9. ضع قطرة من OCT على حلقة حامل بارد. أدخل العينة المجمدة على الفور في القطرة.
  10. قطع الأقسام بسمك 10-20 ميكرومتر ، وضبط درجة حرارة ناظم البرد عند -19 درجة مئوية. استخدم شرائح التصاق البوليسين الدافئة (درجة حرارة الغرفة). اترك الشرائح مع الأقسام المرفقة على منصة تسخين لمدة ~ 2-3 دقائق (41 درجة مئوية) في الظلام لضمان التصاق قوي للأقطع.
  11. ضع الشرائح في صندوق تخزين واحتفظ بها عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
< p class = "jove_title" >7. التلوين المناعي لأقسام الشبكية

  1. خذ الشرائح مع الأقسام من الفريزر. دعهم يبقون في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة لإزالة المكثفات.
  2. قم بتطويق الأقسام بحاصة سائلة لإنشاء حاجز لمزيد من الحضانة.
  3. ضع الشرائح في صندوق الحضانة. قم بتغطية الجزء السفلي من الصندوق بالماء لمنع تبخر محلول الجسم المضاد.
  4. اشطفها باستخدام PB لمدة 5 دقائق.
  5. قم بإعداد نفس محاليل التلوين واتبع الخطوات كما في الخطوة 5. تكون الحضانة مع الجسم المضاد الأساسي بين عشية وضحاها ومع 1 ساعة ثانوية. لا تستخدم الزجاج المكسور بين الغطاء والشريحة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فيما يلي تجربتان تمثيليتان تستفيدان من استخدام غشاء PTFE المجفف بالماء لدعم شبكية العين الكاملة أثناء إجراءات التلوين. توضح التجربة الأولى طريقة التوصيف السريع والبسيط لالأوعية الدموية في الشبكية ، وهي شبكة متقنة من الأوعية الدموية التي تمتد عبر طبقات متعددة من الشبكية (الشكل 2). يجمع هذا النهج بين تحميل بلعة الإيزولكتين ووضع العلامات الغاطسة مع SRH. هذه طريقة فعالة لوضع العلامات على الأنسجة الحية التي يمكن تصورها ومسحها ضوئيا على الفور تقريبا. في شبكية العين ، يمكن تمييز الأوعية الدموية من الطبقة السطح...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد التوافق الحيوي العالي والشفافية في الحلول لغشاء PTFE المجفف بالتجمد مفيدا عند العمل مع الأنسجة الحية. تم استخدام هذا المستحضر بنجاح في العمل السابق لتسجيلات مشبك التصحيح لاستجابات الضوء8-10. هنا ، نوضح كيف يمكن اعتماد هذا النهج للتحليل الهيكلي لشبكية العين الكاملة.

يمكن استخدام تقنية تحميل البلعة بشكل فعال لوضع العلامات على الأنسجة الحية. يتم مساعدة هذه التقنية من خلال الدعم الهيكلي لإدراج الغشاء. تشمل التطبيقات تحميل مؤشر الكالسيوم9 ، أو تلطيخ الأنسجة بعلامات الفلورس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس للمؤلفين مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_content">تم دعم هذا العمل من قبل منحة المعاهد الوطنية للصحة R01-EY020535 (BTS) ، والمؤسسة الدولية لأبحاث الشبكية ومؤسسة كارل كيرشجيسنر (BTS).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
إدراج ثقافة الخلايا Millicell ، 12 مم ،
PTFE محب للماء (Biopore) ، 0.4 & mu ؛ م		MilliporePICM01250
حقنة الأنسولين ، 1 ملبيكتون ديكنسون309659
مقصأدوات العلوم الدقيقة15003-08
ملقط تشريح ، دومون # 55 ، إينوكسأدوات العلوم الدقيقة11255-20تشريح
CryostatLeica
نيكونمختلف
الزجاج الشعريالعالمية أدوات الدقة1B150F-4
P-97 مشتعل / براون مجتذبسوتر صك كو.
أطباق ثقافة بيكوسبريتزر IIIباركر هانيفين
ذات القاع الزجاجيMatTek CorporationP35G-0-14-C
طبق بتريفالكون1008
ماصات نقل متدرجة يمكن التخلصمنها VWR16001-180
أطباق متعددة الآبار ، 24 بئربيكتونديكنسون 351147
غطاء زجاجي ، # 1علوم المجهر الإلكتروني72200-30
شرائح التصاق البوليسينعلوم المجهر الإلكتروني63412-01
شرائح المجهرGlobe1301
حاصرات السائلعلوم المجهر الإلكتروني71312
VECTASHIELD تصاعد متوسطمختبرات ناقلاتH-1000
OCT متوسطساكورا4583
فيلم مختبر بارافيلمفيشر13-374-10
داو كورنينج شحم عالي الفراغسيجما ألدريتشZ273554
ماوس مضاد ل PSD95ميليبورMABN68جسم مضاد
للحمار مضاد للفأر Alexa 568InvitrogenA10037الجسم المضاد
Isolectin Alexa 488InvitrogenI21411
ChemiblockerChemicon2170S
Triton X-100Sigma-AldrichT9284
SulforhodamineSigma-Aldrich341738
CarbodiimideThermo Scientific22980EDC
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148
نظام مجهر متحد البؤر المختلف

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Csaba, G., Kovacs, P., Pallinger, E. EDAC fixation increases the demonstrability of biogenic amines in the unicellular Tetrahymena: a flow cytometric and confocal microscopic comparative analysis. Cell Biol. Int. 30, 345-348 (2006).
  2. Fletcher, E. L., Hack, I., Brandstatter, J. H., Wassle, H. Synaptic localization of NMDA receptor subunits in the rat retina. J. Comp. Neurol. 420, 98-112 (2000).
  3. Gastinger, M. J., O'Brien, J. J., Larsen, N. B., Marshak, D. W. Histamine immunoreactive axons in the macaque retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40, 487-495 (1999).
  4. Haverkamp, S., Wassle, H. Immunocytochemical analysis of the mouse retina. J. Comp. Neurol. 424, 1-23 (2000).
  5. Koulen, P., Fletcher, E. L., Craven, S. E., Bredt, D. S., Wassle, H. Immunocytochemical localization of the postsynaptic density protein PSD-95 in the mammalian retina. J. Neurosci. 18, 10136-10149 (1998).
  6. Pena, J. T., et al. miRNA in situ hybridization in formaldehyde and EDC-fixed tissues. Nat. Methods. 6, 139-141 (2009).
  7. Tymianski, M., et al. A novel use for a carbodiimide compound for the fixation of fluorescent and non-fluorescent calcium indicators in situ following physiological experiments. Cell Calcium. 21, 175-183 (1997).
  8. Sagdullaev, B. T., Eggers, E. D., Purgert, R., Lukasiewicz, P. D. Nonlinear interactions between excitatory and inhibitory retinal synapses control visual output. J. Neurosci. 31, 15102-15112 (2011).
  9. Toychiev, A. H., Sagdullaev, B., Yee, C. W., Ivanova, E., Sagdullaev, B. T. A time and cost efficient approach to functional and structural assessment of living neuronal tissue. J. Neurosci. Methods. 214, 105-112 (2013).
  10. Yee, C. W., Toychiev, A. H., Sagdullaev, B. T. Network deficiency exacerbates impairment in a mouse model of retinal degeneration. Front Syst. Neurosci. 6, 8(2012).
  11. Ivanova, E., Muller, U., Wassle, H. Characterization of the glycinergic input to bipolar cells of the mouse retina. Eur. J. Neurosci. 23, 350-364 (2006).
  12. Dmitrieva, N. A., Strang, C. E., Keyser, K. T. Expression of alpha 7 nicotinic acetylcholine receptors by bipolar, amacrine, and ganglion cells of the rabbit retina. J. Histochem. Cytochem. 55, 461-476 (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Retinal Whlemount PreparationImmunohistochemical StainingCarbodiimide FixationFluorescent Marker LoadingTissue StabilizationMembrane Support TechniqueSynaptic Protein ImagingRetinal Tissue PreparationFluorescence MicroscopyCryostat Sectioning

مقالات ذات صلة