بالمقارنة مع الكروماتوغرافيا تقارب التقليدية باستخدام البروتين Agarose حبة معبأة الأعمدة، البروتين A غشاء الممتزات يمكن أن تسرع بشكل كبير العزل المختبرية على نطاق الأجسام المضادة وغيرها من البروتينات Fc التعبير عن جزء. ويمكن أن تزيد أساليب التحليل والتقدير الكمي المناسبة من تسريع معالجة البروتين، مما يسمح بإكمال العزل/التوصيف في يوم عمل واحد، بدلا من 20 ساعة عمل.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
عزل وتوصيف البروتينات التعبير عن مدينة Chimeric الإنسان باستخدام البروتين A غشاء Adsorbers وسير عمل مبسطة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يمكن إنجاز المقياس المختبري لتنقية الجزيئات الحيوية من الجزيئات الحيوية من الحيوانات الخارقة زراعة الخلايا وحلول الخلايا المتحللة باستخدام الكروماتوغرافيا تقارب. في حين أن الكروماتوغرافيا تقارب باستخدام البروتين المسامية حبات agarose معبأة في أعمدة يمكن القول إن الطريقة الأكثر شيوعا لعزل نطاق المختبر من الأجسام المضادة والبروتينات المؤتلفة التعبير عن شظايا Fc من IgG، يمكن أن يكون عملية تستغرق وقتا طويلا ومكلفة. الوقت والقيود المالية شاقة بشكل خاص في مختبرات العلوم الأساسية الصغيرة التي يجب استرداد مئات ميكروغرام لكميات ملليغرام من البروتين من المحاليل المخففة، ولكن تفتقر إلى الوصول إلى أنظمة توصيل السائل الضغط العالي و / أو الموظفين ذوي الخبرة في التركيبات الحيوية. وعلاوة على ذلك، قد يؤدي تحديد كمية المنتج وتوصيفه أيضا إلى إطالة وقت المعالجة بشكل مفرط على مدى عدة أيام عمل وتضخيم النفقات (المواد الاستهلاكية والأجور وما إلى ذلك). لذلك، هناك حاجة إلى بروتوكول سريع وغير مكلف وفعال في الوقت الذي يتم فيه عزل الأجسام المضادة والبروتينات الأخرى التي تمتلك شظية Fc وتوصيفها على نطاق المختبر. وتحقيقا لهذه الغاية، وضعنا بروتوكولا يمكن أن يكمله موظفون تقنيون محدودو الخبرة في أقل من 9 ساعات (يوم عمل واحد تقريبا) وبسرعة 4 ساعات، على عكس الأساليب التقليدية التي تتطلب أكثر من 20 ساعة عمل. معظم المعدات المطلوبة متاحة بسهولة في العلوم الطبية الحيوية القياسية، والكيمياء الحيوية، ومختبرات الهندسة الكيميائية (الحيوية)، وجميع الكواشف متوفرة تجاريا. لإثبات هذا البروتوكول ، يتم تقديم نتائج تمثيلية تم فيها دمج murine galectin-1 في Fc البشري (Gal-1hFc) من فلورة زراعة الخلايا باستخدام بروتين ممزوج بالغشاء A. تم قياس كمية Gal-1hFc المنقى باستخدام إجراء تحليل النشاف الغربي المعجل وتميز باستخدام قياس التدفق الخلوي. ويمكن تعديل سير العمل المبسط للبروتينات الأخرى المعبرة عن ال FC، مثل الأجسام المضادة، و/أو تغييره ليشمل أساليب بديلة للقياس الكمي والتوصيف.
المقدمة
يمكن تحقيق عزل الأجسام المضادة والبروتينات المؤتلفة التي تعبر عن شظايا الغلوبولين المناعي G (IgG) Fc من الخلايا المستنشقة ومحلولات الخلايا المميعة المخففة باستخدام البروتين الكروماتوغرافيا المتقاربة. في مختبرات العلوم والهندسة الأساسية والصناعة ، والأعمدة معبأة مع بروتين مسامية A المغلفة agarose والزجاج ، أو الخرز البوليمري هي الأكثر شيوعا للكروماتوغرافيا تقارب ، على الرغم من ارتفاع التكاليف المالية وأوقات المعالجةالطويلة 1-3. ومن الامتنان أن تقارب الكروماتوغرافيا يمثل أكبر حساب ومعالجة عنق الزجاجة في كل من المختبر والإعدادات الصناعية2،4. ونتيجة لذلك، تم تطوير العديد من التحسينات لتقليل التكلفة ووقت المعالجة دون التضحية باسترداد المنتج بشكل عام م....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. تحقق من تقارب البروتين A
- تحقق من أن البروتين المعبر عن Fc (بروتين الاندماج المؤتلف أو الأجسام المضادة IgG ، المشار إليها حتى الآن باسم "البروتين") لديه تقارب مقبول للبروتين A14-17 قبل استخدام البروتين A غشاء الممتز ، واختبار وجود البروتين في محلول المخزون(على سبيل المثال ثقافة الخلية supernatant أوضحها الطرد المركزي في 1000 × غرام لمدة 5 دقائق إلى الخلايا المعلقة بيليه). استخدام قياس التدفق الخلوي، النشاف الغربي، ELISA، الخ. للكشف عن وظيفة البروتين و / أو وجود Fc ، استنادا إلى تفضيل المختبر. من الناحية المثالية، تحديد البروتين في خلية الثقافة الفائقة (الخطوة 6) لتجنب تجاوز البروتين قدرة غشاء الممتز. المضي قدما إذا تم الكشف عن ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يتم استخدام البروتوكول المبسط لعزل وتوصيف البروتينات المعبرة عن Fc بشكل روتيني لمعالجة البروتينات الموريميرية murine galectin-1 المنصهرة في Fc الإنسان (Gal-1hFc) من الخلايا المخففة ثقافة الخلايا الفائقة. يوضح المخطط الانسيابي في الشكل 2 سير العمل والوقت لكل خطوة في البروتوكول. بالنسبة لدفعة نموذجية من 300 مل من الناموست ، يكون إجمالي وقت المعالجة حوالي 9 ساعات عند إجراء اختبار قياس التدفق الخلوي الاختياري لكسور elution. إذا تم حذف جميع تحليل قياس التدفق الخلوي ، بسبب عدم وجود مقياس تدفق للخلايا أو تفضيل .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تم تطوير البروتوكول الموصوف هنا لعزل وتوصيف بروتين الاندماج الشيمي الذي يعبر عن Fc البشري (Gal-1hFc) بسرعة ، دون المساس بشكل كبير باسترداد المنتج أو تضخيم التكلفة. المكونات الرئيسية لسير العمل المبسطة هي بروتين ممتز غشاء للعزلة ، ونقل شبه مجفف والمناعة بمساعدة الفراغ لتوصيفها عن طريق النشاف الغربي.
الانخفاض الكبير في وقت المعالجة لعزل وتوصيف Gal-1hFc من 300 مل من الخلايا التناسخية (حوالي 9 ساعات في البروتوكول المبسط مقارنة ب 20 + ساعة في بروتوكول تقليدي) يعزى إلى حد كبير إلى دمج المكونات الرئي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
لا يوجد شيء للكشف عنه.
شكر وتقدير
ويود المؤلفان أن يشكرا السيد لويس ف. دلغاديو (قسم الهندسة الكيميائية والجزئية الحيوية، جامعة أوهايو)، والسيد ماثيو ويليامز (قسم الهندسة الكيميائية والجزيئات الحيوية، جامعة أوهايو)، والدكتور فيليبرتو سيدينو - لوران (مستشفى بريغهام ومستشفى النساء وكلية الطب بجامعة هارفارد) على المساعدة التقنية الخبيرة. الكتاب أيضا أن أشكر شتاء 2011 CHE 404/BME 504 و خريف 2012 CHE 4830/BME 5830 الطلاب (قسم الهندسة الكيميائية والبيولوجية الجزيئية وبرنامج الهندسة الطبية الحيوية, جامعة أوهايو) للحصول على المشورة التقنية والمناقشة. تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم (NSF) منحة أدوات البحوث الرئيسية CBET-1039869 (MMB)، NSF CBET-1106118 (MMB)، منحة أبحاث مؤسسة الأمراض الجلدية A050422 (SRB)، المعاهد الو....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| بروتين أ غشاء ممتز (Sartobind Protein A 2 ml) | Sartorius-Stedim | 93PRAP06HB-12 - A | |
| فلتر طرد مركزي Amicon Ultra ، 10 كيلو دالتون ، 4 مل | UFC801008 Millipore | استخدم حجم 15 مل إذا لزم | |
| الأمر وحدة فلتر فراغ معقمة ، 0.22 وميكرو ؛ م ، 500 مل | محاقن Millipore | SCGPU05RE | |
| 10 مل مع أطراف Luer Lock | BD | 301604 | |
| 30 مل محاقن مع أطراف Luer Lock | BD | 309650 | |
| مختبر Tygon (1/16 بوصة × 1/8 بوصة × 50 قدما) أجهزة | Cole Parmer | WU-95903-16 | |
| Slide-A-Lyzer MINI (10K MWCO) | Thermo Scientific | 69576 | |
| المفاجئة هوية مجموعة الأجسام المضادة صينية | EMD Millipore | WBAVDABTR | |
| Snap معرف حامل وصمة عار بئر | واحدة EMD Millipore | WBAVDBH01 | |
| Elution | Buffer Thermo Scientific | 21004 | |
| Tris ، فائقة النقاء | فيشر Scientific | 819623 | |
| كلوريد الصوديوم | فيشر Scientific | 7647-14-5 | |
| Tween 20 | فيشر Scientific | BP337-100 | |
| DPBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| DPBS مع Ca2 + < / sup> / Mg2 + < / sup> | Life Technologies | 14080-055 | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| مختبرات أبحاث البيثيل | البشرية Fc | P80-104 | |
| مكافحة الإنسان FC-APC | جاكسون Immunoresearch | 109136170 | |
| Anti-Human Fc-AP | Bio-Rad | 170-5018 | |
| ركيزة الفوسفاتيز القلوية | Promega | S3841 | |
| أنابيب قياس التدفق الخلوي (5 مل من البوليسترين أو البولي بروبيلين) | BD | 352054 | |
| مضخة حقنة | هارفارد | 55-2226 | المضخة التمعجية مقبولة أيضا |
| هلام البروتين نظام الرحلان الكهربائي | مختبرات Bio-Rad | 552BR094876 | أي نظام للرحلان الكهربائي للهلام مقبول ، لكن أنظمة الهلام الصغيرة تعمل بشكل أسرع |
| نشاف شبه جاف | مختبرات Bio-Rad | 690BR006163 | أي نظام نقل مقبول ، لكن أنظمة النقل المتقطعة تؤدي النقل الكهربائي أسرع |
| الكشف عن البروتين بمساعدة هوية SNAP | EMD Millipore | WBAVDBASE | حل نموذج تمت ترقيته محل هذه الأداة المحددة ، ولكن يجب أن يعمل أي منهما أيضا |
المراجع
- Gagnon, P. Technology trends in antibody purification. J. Chromatogr. A. 1221, 57-70 (2012).
- Gottschalk, U. Bioseparation in antibody manufacturing: The good, the bad and the ugly. Biotechnol. Prog. 24, 496-503 (2008).
- Liu, H. F., Ma, J., Winter, C., Ba....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
