مقالة منهجية

عزل وتوصيف البروتينات التعبير عن مدينة Chimeric الإنسان باستخدام البروتين A غشاء Adsorbers وسير عمل مبسطة

6.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/51023

⸱

يناير 8, 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Ohio University, 2Biomedical Engineering Program, Russ College of Engineering and Technology, Ohio University, 3Department of Dermatology, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School

في هذه المقالة

ملخص

بالمقارنة مع الكروماتوغرافيا تقارب التقليدية باستخدام البروتين Agarose حبة معبأة الأعمدة، البروتين A غشاء الممتزات يمكن أن تسرع بشكل كبير العزل المختبرية على نطاق الأجسام المضادة وغيرها من البروتينات Fc التعبير عن جزء. ويمكن أن تزيد أساليب التحليل والتقدير الكمي المناسبة من تسريع معالجة البروتين، مما يسمح بإكمال العزل/التوصيف في يوم عمل واحد، بدلا من 20 ساعة عمل.

الملخص

يمكن إنجاز المقياس المختبري لتنقية الجزيئات الحيوية من الجزيئات الحيوية من الحيوانات الخارقة زراعة الخلايا وحلول الخلايا المتحللة باستخدام الكروماتوغرافيا تقارب. في حين أن الكروماتوغرافيا تقارب باستخدام البروتين المسامية حبات agarose معبأة في أعمدة يمكن القول إن الطريقة الأكثر شيوعا لعزل نطاق المختبر من الأجسام المضادة والبروتينات المؤتلفة التعبير عن شظايا Fc من IgG، يمكن أن يكون عملية تستغرق وقتا طويلا ومكلفة. الوقت والقيود المالية شاقة بشكل خاص في مختبرات العلوم الأساسية الصغيرة التي يجب استرداد مئات ميكروغرام لكميات ملليغرام من البروتين من المحاليل المخففة، ولكن تفتقر إلى الوصول إلى أنظمة توصيل السائل الضغط العالي و / أو الموظفين ذوي الخبرة في التركيبات الحيوية. وعلاوة على ذلك، قد يؤدي تحديد كمية المنتج وتوصيفه أيضا إلى إطالة وقت المعالجة بشكل مفرط على مدى عدة أيام عمل وتضخيم النفقات (المواد الاستهلاكية والأجور وما إلى ذلك). لذلك، هناك حاجة إلى بروتوكول سريع وغير مكلف وفعال في الوقت الذي يتم فيه عزل الأجسام المضادة والبروتينات الأخرى التي تمتلك شظية Fc وتوصيفها على نطاق المختبر. وتحقيقا لهذه الغاية، وضعنا بروتوكولا يمكن أن يكمله موظفون تقنيون محدودو الخبرة في أقل من 9 ساعات (يوم عمل واحد تقريبا) وبسرعة 4 ساعات، على عكس الأساليب التقليدية التي تتطلب أكثر من 20 ساعة عمل. معظم المعدات المطلوبة متاحة بسهولة في العلوم الطبية الحيوية القياسية، والكيمياء الحيوية، ومختبرات الهندسة الكيميائية (الحيوية)، وجميع الكواشف متوفرة تجاريا. لإثبات هذا البروتوكول ، يتم تقديم نتائج تمثيلية تم فيها دمج murine galectin-1 في Fc البشري (Gal-1hFc) من فلورة زراعة الخلايا باستخدام بروتين ممزوج بالغشاء A. تم قياس كمية Gal-1hFc المنقى باستخدام إجراء تحليل النشاف الغربي المعجل وتميز باستخدام قياس التدفق الخلوي. ويمكن تعديل سير العمل المبسط للبروتينات الأخرى المعبرة عن ال FC، مثل الأجسام المضادة، و/أو تغييره ليشمل أساليب بديلة للقياس الكمي والتوصيف.

المقدمة

يمكن تحقيق عزل الأجسام المضادة والبروتينات المؤتلفة التي تعبر عن شظايا الغلوبولين المناعي G (IgG) Fc من الخلايا المستنشقة ومحلولات الخلايا المميعة المخففة باستخدام البروتين الكروماتوغرافيا المتقاربة. في مختبرات العلوم والهندسة الأساسية والصناعة ، والأعمدة معبأة مع بروتين مسامية A المغلفة agarose والزجاج ، أو الخرز البوليمري هي الأكثر شيوعا للكروماتوغرافيا تقارب ، على الرغم من ارتفاع التكاليف المالية وأوقات المعالجةالطويلة 1-3. ومن الامتنان أن تقارب الكروماتوغرافيا يمثل أكبر حساب ومعالجة عنق الزجاجة في كل من المختبر والإعدادات الصناعية2،4. ونتيجة لذلك، تم تطوير العديد من التحسينات لتقليل التكلفة ووقت المعالجة دون التضحية باسترداد المنتج بشكل عام من قطار العملية1,2,5-7. واعدة بشكل خاص لعزل الأجسام المضادة وغيرها من البروتينات التي تعبر عن Fc هو الكروماتوغرافيا تقارب باستخدام البروتين A غشاء adsorber2,5,7-10. في حين أن التقاط Fc في كروماتوغرافيا العمود محدود الانتشار(أي أن البروتين المعبر عن Fc يجب أن ينتشر داخل المسام الداخلية وعبرها للوصول إلى غالبية البروتين A) مع انخفاض الضغط العالي عبر العمود ، فإن النقل الجماعي في الأغشية الممتزة مدفوع بالحماس الحراري السائب ، مما يؤدي إلى تجنب قيود الانتشار8،9،11،12. وبالإضافة إلى ذلك، انخفاض الضغط عبر غشاء الممتز منخفضة، مما يسمح أسرع معدلات تدفق التغلغل مقارنة مع الأعمدة معبأة حبة8،9،11،12. وبالتالي ، بالنسبة لعزل النطاق المختبري ، من المتوقع أن يقلل لون الغشاء من وقت العزل لعدة ساعات ويزيد من التقاط المنتج مقارنة بالكروماتوغرافيا العمودية. وعلاوة على ذلك، تم اقتراح نماذج رياضية لامتزاز IgG في الأغشية adsorbers8،9،11،12، مما يسمح للمستخدمين النهائيين للتنبؤ الأداء في المختبر.

وثمة اختناق آخر في مختبرات العلوم والهندسة الأساسية هو توصيف البروتين المعبر عن ال FC. ومع ذلك ، فإن اختيار الطرق المناسبة لإكمال اختبارات التوصيف ، مثل هذه البقع الغربية ، يمكن أن يقلل إلى حد كبير من الوقت الذي يقضيه في اختبار المنتج. على سبيل المثال، نقل شبه مجفف في نظام عازل متقطع يمكن إنجاز نقل البروتينات الكهربائية من هلام SDS-PAGE إلى غشاء ثنائي فلوريدين متعدد الفينيل (PVDF) في غضون دقائق، في مقابل 1-2 ساعة في نقل خزان (الرطب) في نظام عازل مستمر13.

ويرد هنا وصف بروتوكول سريع وغير مكلف وفعال لعزل وتوصيف بروتين الاندماج الشيمي الذي يعبر عن جزء Fc من IgG البشري. معظم المعدات متاحة بسهولة في العلوم الطبية الحيوية الأساسية القياسية والبيولوجيا والكيمياء ومختبرات الهندسة الكيميائية (الحيوية) ، وجميع الكواشف متوفرة تجاريا. على الرغم من أن النتائج التمثيلية تم إنشاؤها من عزل وتوصيف بروتين الانصهار الموريني galectin-1/human Fc chimeric protein (Gal-1hFc) ، يمكن تطبيق البروتوكول المبسط على عزل الجزيئات الأخرى التي تمتلك جزءا من Fc ، مثل الأجسام المضادة ، أو شظايا Fc نفسها ، أو بروتينات الاندماج Fc الأخرى. وقد انخفضت التحسينات بشكل كبير وقت المعالجة (أقل من 4 ساعات ولكن عادة ~ 9 ساعة ، مقارنة مع 20 + ساعات العمل) مع تحقيق استرداد المنتج مماثلة أو محسنة مقارنة بالطرق القياسية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. تحقق من تقارب البروتين A

  1. تحقق من أن البروتين المعبر عن Fc (بروتين الاندماج المؤتلف أو الأجسام المضادة IgG ، المشار إليها حتى الآن باسم "البروتين") لديه تقارب مقبول للبروتين A14-17 قبل استخدام البروتين A غشاء الممتز ، واختبار وجود البروتين في محلول المخزون(على سبيل المثال ثقافة الخلية supernatant أوضحها الطرد المركزي في 1000 × غرام لمدة 5 دقائق إلى الخلايا المعلقة بيليه). استخدام قياس التدفق الخلوي، النشاف الغربي، ELISA، الخ. للكشف عن وظيفة البروتين و / أو وجود Fc ، استنادا إلى تفضيل المختبر. من الناحية المثالية، تحديد البروتين في خلية الثقافة الفائقة (الخطوة 6) لتجنب تجاوز البروتين قدرة غشاء الممتز. المضي قدما إذا تم الكشف عن البروتين.

2. إعداد البروتين ومكثف الأغشية وخلايا الثقافة Supernatant

  1. اتبع تعليمات الشركة المصنعة لإعداد الغشاء adsorber. لا تدع الهواء يدخل الغشاء الممتز. يجب أن تكون جميع الحلول التي يتم اختراقها من خلال ممتز الغشاء في درجة حرارة الغرفة ومصفاة مسبقا باستخدام فلتر 0.22 ميكرومتر. ملء حقنة 10 مل مع 0.22 ميكرومتر تصفيتها الفوسفات Dulbecco المالحة المخزنة مؤقتا (DPBS) أو العازلة من الاختيار وتفريغ فقاعات الهواء. Perfuse DPBS لإزالة محلول التخزين و equilibrate غشاء adsorber مباشرة قبل الاستخدام.
  2. تصفية الخلايا الثقافة supernatant مباشرة قبل التغلغل من خلال غشاء adsorber، وذلك باستخدام فراغ يحركها 0.22 ميكرومتر وحدة الترشيح العقيمة.

3. تحميل البروتين A غشاء الممتز

  1. أسبيرات ثقافة الخلية supernatant في حقنة لوير لوك (30 مل أو أكبر)، وتفريغ أي فقاعات الهواء.
  2. تجميع المواد والمعدات كما هو موضح في الشكل 1. ربط المحاقن إلى مدخل من غشاء الممتز. إرفاق أنابيب مرنة إلى منفذ الغشاء الممتز. إذا رغبت في ذلك، ضع مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر بين الحقنة وممتز الغشاء. استخدام قارورة أو زجاجة للقبض على تدفق من خلال (المعروف أيضا باسم filtrate)، من الممتز.
  3. تعيين مضخة حقنة لمعدل التدفق الحجمي المطلوب، ولكن لا تتجاوز معدل التدفق الموصى بها من قبل الشركة المصنعة(على سبيل المثال 10 مل / دقيقة). Perfuse ثقافة الخلية supernatant من خلال غشاء الممتز ، وجمع تدفق من خلال في كوب أو حاوية أخرى. إعادة تحميل المحاقن مع المضادات اللازمة.
  4. إذا رغبت في ذلك، اختبار تدفق من خلال لوجود البروتين باستخدام قياس التدفق الخلوي، النشاف الغربية، ELISA، الخ. بناء على تفضيل المختبر. عادة ما يكون من غير الضروري إعادة بث التدفق من خلاله.

4. بروتين Elute من مذبات الغشاء

  1. اغسل الغشاء الممتز مع 10 مل DPBS لإزالة أي بروتين غير منضم.
  2. بروتين إلوت من غشاء الممتز بمعدل التدفق المطلوب(على سبيل المثال 1 مل / دقيقة) باستخدام 10-15 مل من العازلة elution(على سبيل المثال، العازلة الوضوء القائم على الأمين (pH 2.8)). التقاط eluate في أنبوب يحتوي على العازلة تحييد(على سبيل المثال 1 M تريس (pH 9.4)) في 10٪ من حجم elution (1.0-1.5 مل).
  3. بدلا من ذلك، elute البروتين في واحد مل زيادات في أنابيب تحتوي على 100 ميكرولتر من العازلة تحييد، وذلك باستخدام حجم إجمالي من 10-15 مل elution العازلة. استخدم طريقة التوصيف المفضلة لاختبار كل كسر لوجود البروتين.
  4. تجديد الغشاء adsorber وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. Perfuse 10 مل من 0.22 ميكرومتر تصفيتها DPBS أو العازلة من الاختيار، ثم 10 مل من 0.22 ميكرومتر تصفيتها 50 mM NaOH في 1 N NaCl، وأخيرا 10 مل من 0.22 ميكرومتر تصفيتها DPBS. ملء غشاء الامتزاز مع الإيثانول 20٪ في DPBS للتخزين على المدى الطويل في 4 درجة مئوية.

5. التركيز و Dialyze البروتين

  1. إيداع جميع eluate (أو elution كسور تحتوي على البروتين كما هو محدد في الخطوة 4.3) في 10 كيلودا الوزن الجزيئي قطع وحدة تصفية الطرد المركزي. اتبع تعليمات الشركة المصنعة للطرد المركزي.
  2. Dialyze retentate في وحدة غسيل الكلى حجم صغير (10 كيلودا خفض الوزن الجزيئي) ضد العازلة من اختيار, اتباع تعليمات الشركة المصنعة. قد تحتاج إلى إضافة المخزن المؤقت إلى المواد dialyzed إذا كان هطول الأمطار البروتين مصدر قلق. إذا رغبت في ذلك، يمكن تبريد المواد التي تم طلبها حتى يمكن تنفيذ الخطوة 6، ولكن لا ينصح بالتخزين على المدى الطويل دون المواد الحافظة.

6. تحديد وتوصيف المنتج المنقى في إجراء النشاف الغربي المعجل

  1. حل البروتين النقي ومعايير FC على هلام من اختيار SDS-PAGE، في ظل ظروف الحد أو غير التعليم على النحو المطلوب18-20. استخدام هلام مصغرة بدلا من هلام ميدي لتقليل وقت التشغيل.
    1. إذا لم تكن معروفة بالفعل، تحديد نطاق معايير FC على إشارة النطاق الذي يختلف خطيا فيما يتعلق بكمية محملة(على سبيل المثال 0.1-1 ملغ). استخدم نفس الجل وظروف التشغيل وظروف النقل والكواشف التي سيتم استخدامها لقياس البروتين النقي وتوصيفه.
    2. قم بتحميل كميات عينات متعددة من البروتين المنقى، بما في ذلك العينات المخففة مع DPBS، لضمان أن إشارات نطاق البروتين المنقى تقع ضمن نطاق الإشارة الخطية لمعايير Fc في تحليل الصور.
  2. نقل البروتينات من الجل إلى غشاء فلوريد البولي فينيلدن (PVDF) في نظام عازل متقطع باستخدام لطخة نصفمجففة 13، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لللطخة. نقل الوقت عادة 5-10 دقيقة. إذا رغبت في ذلك، Coomassie وصمة عار الجل بعد نقل للتحقق من كفاءة نقل21.
  3. إجراء الانتفاخ المناعي مع المضادة Fc أو المضادة IgG المقترنة الفوسفاتاز القلوية (AP) أو الحصان الفجل peroxidase (HRP)، استنادا إلى تفضيل المختبر، وذلك باستخدام نظام الكشف عن البروتين بمساعدة فراغ. وقت الانتفاخ المناعي عادة أقل من ساعة واحدة.
  4. تطوير مناعة باستخدام الركيزة وطريقة الاختيار(مثل ركيزة AP وتعزيز chemiluminescence).
  5. قياس البروتين المنقى عن طريق تحليل الصورة. إجراء انحدار خطي على إشارات النطاق من معايير Fc. إذا R 2 >0.90، استخدم المعادلة للخط لحسابكميةالبروتين من إشارة الفرقة (ق). حساب لتخفيف العينة إذا لزم الأمر. منذ يتم إجراء القياس الكمي للبروتين على أساس Fc، وضبط قيمة الاختلافات الوزن الجزيئي بين البروتين وFc. إذا R2<0.90، كرر الخطوة 6 في مجملها.
  6. التحقق من صحة البروتين باستخدام المقايسات الوظيفية أو أساليب للكشف عن Fc عن طريق قياس التدفق الخلوي، النشاف الغربي، ELISA، الخ. بناء على تفضيل المختبر.
  7. تمييع البروتين إلى التركيز المطلوب و / أو إضافة أي مواد حافظة أو مثبتات مرغوبة إلى محلول البروتين النقي قبل الاقتباس للتخزين على المدى الطويل ، المجمدة أو غير ذلك.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يتم استخدام البروتوكول المبسط لعزل وتوصيف البروتينات المعبرة عن Fc بشكل روتيني لمعالجة البروتينات الموريميرية murine galectin-1 المنصهرة في Fc الإنسان (Gal-1hFc) من الخلايا المخففة ثقافة الخلايا الفائقة. يوضح المخطط الانسيابي في الشكل 2 سير العمل والوقت لكل خطوة في البروتوكول. بالنسبة لدفعة نموذجية من 300 مل من الناموست ، يكون إجمالي وقت المعالجة حوالي 9 ساعات عند إجراء اختبار قياس التدفق الخلوي الاختياري لكسور elution. إذا تم حذف جميع تحليل قياس التدفق الخلوي ، بسبب عدم وجود مقياس تدفق للخلايا أو تفضيل ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تم تطوير البروتوكول الموصوف هنا لعزل وتوصيف بروتين الاندماج الشيمي الذي يعبر عن Fc البشري (Gal-1hFc) بسرعة ، دون المساس بشكل كبير باسترداد المنتج أو تضخيم التكلفة. المكونات الرئيسية لسير العمل المبسطة هي بروتين ممتز غشاء للعزلة ، ونقل شبه مجفف والمناعة بمساعدة الفراغ لتوصيفها عن طريق النشاف الغربي.

الانخفاض الكبير في وقت المعالجة لعزل وتوصيف Gal-1hFc من 300 مل من الخلايا التناسخية (حوالي 9 ساعات في البروتوكول المبسط مقارنة ب 20 + ساعة في بروتوكول تقليدي) يعزى إلى حد كبير إلى دمج المكونات الرئي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لا يوجد شيء للكشف عنه.

شكر وتقدير

ويود المؤلفان أن يشكرا السيد لويس ف. دلغاديو (قسم الهندسة الكيميائية والجزئية الحيوية، جامعة أوهايو)، والسيد ماثيو ويليامز (قسم الهندسة الكيميائية والجزيئات الحيوية، جامعة أوهايو)، والدكتور فيليبرتو سيدينو - لوران (مستشفى بريغهام ومستشفى النساء وكلية الطب بجامعة هارفارد) على المساعدة التقنية الخبيرة. الكتاب أيضا أن أشكر شتاء 2011 CHE 404/BME 504 و خريف 2012 CHE 4830/BME 5830 الطلاب (قسم الهندسة الكيميائية والبيولوجية الجزيئية وبرنامج الهندسة الطبية الحيوية, جامعة أوهايو) للحصول على المشورة التقنية والمناقشة. تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم (NSF) منحة أدوات البحوث الرئيسية CBET-1039869 (MMB)، NSF CBET-1106118 (MMB)، منحة أبحاث مؤسسة الأمراض الجلدية A050422 (SRB)، المعاهد الوطنية للصحة (NIH) منحة NCI 1R15CA 161830-01 (MMB)، زمالة ما بعد الدكتوراه NIH Kirschstein-NRSA F32CA144219-01A1 (SRB)، NIH/NCI R01CA173610 (CJD)، ومنحة NIH NCCAM R01AT004628 (CJD).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
بروتين أ غشاء ممتز (Sartobind Protein A 2 ml) Sartorius-Stedim93PRAP06HB-12 - A
فلتر طرد مركزي Amicon Ultra ، 10 كيلو دالتون ، 4 ملUFC801008 Milliporeاستخدم حجم 15 مل إذا لزم
الأمر وحدة فلتر فراغ معقمة ، 0.22 وميكرو ؛ م ، 500 ملمحاقن MilliporeSCGPU05RE
10 مل مع أطراف Luer LockBD301604
30 مل محاقن مع أطراف Luer LockBD309650
مختبر Tygon (1/16 بوصة × 1/8 بوصة × 50 قدما) أجهزةCole ParmerWU-95903-16
Slide-A-Lyzer MINI (10K MWCO)Thermo Scientific69576
المفاجئة هوية مجموعة الأجسام المضادة صينيةEMD MilliporeWBAVDABTR
Snap معرف حامل وصمة عار بئرواحدة EMD MilliporeWBAVDBH01
ElutionBuffer Thermo Scientific21004
Tris ، فائقة النقاءفيشر Scientific819623
كلوريد الصوديومفيشر Scientific7647-14-5
Tween 20فيشر ScientificBP337-100
DPBSThermo ScientificSH30028.02
DPBS مع Ca2 + < / sup> / Mg2 + < / sup>Life Technologies14080-055
BSASigmaA9647
مختبرات أبحاث البيثيلالبشرية FcP80-104
مكافحة الإنسان FC-APCجاكسون Immunoresearch109136170
Anti-Human Fc-APBio-Rad170-5018
ركيزة الفوسفاتيز القلويةPromegaS3841
أنابيب قياس التدفق الخلوي (5 مل من البوليسترين أو البولي بروبيلين)BD352054
مضخة حقنةهارفارد55-2226المضخة التمعجية مقبولة أيضا
هلام البروتين نظام الرحلان الكهربائيمختبرات Bio-Rad552BR094876أي نظام للرحلان الكهربائي للهلام مقبول ، لكن أنظمة الهلام الصغيرة تعمل بشكل أسرع
نشاف شبه جافمختبرات Bio-Rad690BR006163أي نظام نقل مقبول ، لكن أنظمة النقل المتقطعة تؤدي النقل الكهربائي أسرع
الكشف عن البروتين بمساعدة هوية SNAPEMD MilliporeWBAVDBASEحل نموذج تمت ترقيته محل هذه الأداة المحددة ، ولكن يجب أن يعمل أي منهما أيضا
أنابيب غسيل الكلى نظام

المراجع

  1. Gagnon, P. Technology trends in antibody purification. J. Chromatogr. A. 1221, 57-70 (2012).
  2. Gottschalk, U. Bioseparation in antibody manufacturing: The good, the bad and the ugly. Biotechnol. Prog. 24, 496-503 (2008).
  3. Liu, H. F., Ma, J., Winter, C., Bayer, R. Recovery and purification process development for monoclonal antibody production. MAbs. 2, 480-499 (2010).
  4. Low, D., O'Leary, R., Pujar, N. S. Future of antibody purification. J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, 48-63 (2007).
  5. Boi, C. Membrane adsorbers as purification tools for monoclonal antibody purification. J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, (1016).
  6. Cuatrecasas, P. Protein purification by affinity chromatography. Derivatizations of agarose and polyacrylamide beads. J. Biol. Chem. 245, 3059-3065 (1970).
  7. Shukla, A. A., Gottschalk, U. Single-use disposable technologies for biopharmaceutical manufacturing. Trends Biotechnol. 31, 147-154 (2013).
  8. Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. Performance of a new protein a affinity membrane for the primary recovery of antibodies. Biotechnol Prog. 24, 640-647 (2008).
  9. Dancette, O. P., Taboureau, J., Tournier, E., Charcosset, C., Blond, P. Purification of immunoglobulins g by protein a/g afinity membrane chromatography. J. Chromatogr. B. 723, 61-68 (1999).
  10. Thommes, J., Etzel, M. Alternatives to chromatographic separations. Biotechnol. Prog. 23, 42-45 (2007).
  11. Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. Modelling and simulation of affinity membrane adsorption. J. Chromatogr. A. 1162, 24-33 (2007).
  12. van Beijeren, P., et al. Computer-aided process design of affinity membrane adsorbers: A case study on antibodies capturing. Chem. Pap. 62, 458-463 (2008).
  13. Lauriere, M. A semidry electroblotting system efficiently transfers both high- and low-molecular-weight proteins separated by sds-page. Anal. Biochem. 212, 206-211 (1993).
  14. Darcy, E., Leonard, P., Fitzgerald, J., Danaher, M., O'Kennedy, R. Purification of antibodies using affinity chromatography. Methods Mol. Biol. 681, 369-382 (2011).
  15. Hjelm, H., Hjelm, K., Sjoquist, J. Protein a from staphylococcus aureus. Its isolation by affinity chromatography and its use as an immunosorbent for isolation of immunoglobulins. FEBS Lett. 28, 73-76 (1972).
  16. Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein a chromatography for antibody purification. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 848, 40-47 (2007).
  17. Kronvall, G. A surface component in group a, c, and g streptococci with non-immune reactivity for immunoglobulin g. J. Immunol. 111, 1401-1406 (1973).
  18. Cedeno-Laurent, F., et al. Development of a nascent galectin-1 chimeric molecule for studying the role of leukocyte galectin-1 ligands and immune disease modulation. J. Immunol. 185, 4659-4672 (2010).
  19. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage t4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  20. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354 (1979).
  21. Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. The use of Coomassie brilliant blue g250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).
  22. Cedeno-Laurent, F., et al. Metabolic inhibition of galectin-1-binding carbohydrates accentuates antitumor immunity. J. Invest. Dermatol. 132, 410-420 (2012).
  23. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  24. Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), (2009).
  25. Ernst, O., Zor, T. Linearization of the Bradford Protein Assay. J. Vis. Exp. (38), (2010).
  26. Simonian, M. H., Smith, J. A. Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter. 10, 10-1002 (2006).
  27. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
  28. Gravel, C., Li, C., Wang, J., Hashem, A. M., Jaentschke, B., Van Domselaar, G., et al. Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays. J. Vis. Exp. (50), (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة