يتم استخدام نهج الفجوة الفازلين قطع مفتوحة للحصول على تسجيلات انخفاض مستوى الضجيج من التيارات الأيونية والمعزولة من القنوات الأيونية التي تعتمد على الجهد أعرب في البويضات القيطم مع ارتفاع القرار من حركية القناة بسرعة. مع تعديلات طفيفة، ويمكن أن يقترن الجهد المشبك قياس التألق لبروتوكول البويضة قطع مفتوحة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الفجوة البويضة الفازلين قطع مفتوحة (COVG) تقنية المشبك الجهد يسمح لتحليل الخصائص الكهربية والحركية من القنوات الأيونية مغاير في البويضات. تسجيلات من الإعداد قطع مفتوحة مفيدة بشكل خاص لتسوية منخفضة التيارات حجم النابضة، وتفعيل سريع الحالية الأيونية، والتعطيل. وتشمل الفوائد الرئيسية على مدى يومين الجهد الكهربائي المشبك (TEVC) تقنية زيادة سرعة المشبك، ونسبة تحسن الإشارة إلى الضوضاء، والقدرة على تعدل بين الخلايا والوسط خارج الخلية.
هنا، ونحن توظيف قناة الصوديوم القلب البشري (HNA V 1.5)، وأعرب في البويضات القيطم، للتدليل على الإعداد قطع مفتوحة والبروتوكول وكذلك التعديلات المطلوبة لإضافة قدرات التألق المشبك الجهد.
خصائص سريع القنوات الأيونية تفعيل، مثل HNA V 1.5، لا يمكن حلها بالكامل بالقرب من درجة حرارة الغرفة باستخدام TEVC، في whicوفرضت ح مجمل غشاء البويضة، مما يجعل من الصعب السيطرة على الجهد. ومع ذلك، في تقنية قطع مفتوحة، عزل سوى جزء صغير من غشاء الخلية يسمح للقط السريع المطلوبة لتسجيل بدقة حركية سريعة في حين منع قناة متهدم المرتبطة تقنيات المشبك التصحيح.
بالتزامن مع تقنية COVG، حركية القناة الايونية والخصائص الكهربية يمكن أن يعاير مزيد باستخدام الجهد المشبك قياس التألق، حيث يتم تعقب البروتين الحركة عبر السيستين اقتران fluorophores تطبيقها خارج الخلية، إدخال البروتينات الفلورية المرمزة وراثيا، أو إدماج من الأحماض الأمينية غير طبيعي في المنطقة من اهتمام 1. تعطي هذه البيانات معلومات إضافية حول الحركية التي تعتمد على إعادة ترتيب الجهد بتكوين جزئي من البروتين عن طريق تغييرات في المكروية المحيطة جزيء نيون.
المقدمة
تسمح التقنيات الجهد لقط المتخصصة في تسجيل التيارات الأيونية في إمكانات غشاء رقابة. تستخدم على نطاق واسع يومين الجهد الكهربائي المشبك (TEVC) وتوفير تقنيات المعلومات المشبك التصحيح الكهربية يمكن الاعتماد عليها على خصائص العديد من القنوات الأيونية. ومع ذلك، كل من هذه الأساليب لديهم عيوب التي تحول دون الحصول على البيانات الموثوقة لقنوات الصوديوم الجهد بوابات قنوات سريعة وتفعيل سريع أخرى في الأغشية مثل تلك البويضات القيطم. مختبرات Bezanilla وستيفاني بالتالي تطوير تقنية الفجوة الفازلين الجهد المشبك قطع مفتوحة (COVG) لالبويضات 2. وقد تم تطبيق هذه التقنية على نطاق واسع لتسجيل، نا +، K +، والكال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. الإعداد الأولي معدات
- ضع المرحلة ومناور مسرى مكروي على نظام الاهتزاز والعزل (مثل جدول الهواء) مع قفص فاراداي المحيطة لمنع الضوضاء الكهربائية والميكانيكية.
- جندى ستة الكريات حج / أجكل إلى ستة بوصة أطوال الأسلاك 24 AWG. واحدة من هذه الأطوال (أن تكون متصلا P1)، لصق في سلك الثاني لتشكيل "Y". على طرفي كل سلك لحام الذهب BNC دبوس، الذي تم تضمينه مع مكبر للصوت.
- ربط خمسة الكريات حج / أجكل ملحوم إلى 24 AWG الأسلاك إلى headstage الحمام / الح....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
الشكل 4 يعرض يتم تطبيق التغيير في نفاذية البويضة كحل سابونين إلى القسم السفلي من بويضة. الشكل 5 يوضح سعر الصرف حل داخل الخلايا عن طريق الانتشار التالية permeabilization سابونين. ويلزم 20-40 دقيقة من أجل التوصل إلى حالة مستقرة، 2،18.
عرض الرقم 6A آثار الناتجة عن بروتوكول التسجيل. يوضح الشكل التيارات الأيونية (بعد P/-8 تسرب الطرح) ردا على بروتوكول الجهد .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
البويضة الفازلين الفجوة الجهد تقنية المشبك قطع مفتوحة يسمح لتسوية سريعة للبيانات، وانخفاض مستوى الضجيج، وزيادة السيطرة على الحل الداخلي وتكوين الحل الخارجي، والتسجيلات مستقرة عبر بروتوكولات طويلة نسبيا 19. هذه المزايا تعيين هذه التقنية وبصرف النظر عن مستوى الجهد الكهربائي يومين المشبك وتقنيات المشبك التصحيح. على الرغم من المعدات المتخصصة مطلوب والبروتوكول أمر صعب نسبيا، تحدث عدد قليل جدا من القضايا مرة واحدة وقد تم تحسين النظام. وهذا يسمح للتسجيلات استنساخه من الصوديوم .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
جميع أعضاء جامعة واشنطن في سانت لويس مختبر الهندسة القلب الجزيئي. A بوروز مرحبا بكم جائزة شهادة الصندوق في واجهة العلمية - 1010299 (لشبيبة).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| رقم كتالوج | العلامة التجارية | للمحلول الخارجي | [النهائي] ، الوزن أو الحجم |
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Sigma-Aldrich | M2004 | 25mM |
| ملح الصوديوم | MES Sigma-Aldrich | M5057 | 90mM |
| HEPES | Research Products International | H75030 | 20mM |
| هيدروكسيد الكالسيوم | سيجما ألدريتش | 239232 | 2 ملي مولار |
| MES هيدرات | سيجما-ألدريتش | M8250 | متغير (درجة الحموضة إلى 7.4) |
| محلول | |||
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Sigma-Aldrich | M2004 | 105mM |
| ملح الصوديوم | MES Sigma-Aldrich | M5057 | 10mM |
| أبحاث HEPES | International | H75030 | 20mM |
| الإيثيلين جلايكول - بيس (2-أمينوإيثيل إيثر) - N ، N ، N '، N '- حمض رباعي الأسيتيك (EGTA) | سيجما ألدريتش | E4378 | 2 ملي مولار |
| MES هيدرات | سيجما ألدريتش | M8250 | متغير (درجة الحموضة إلى 7.4) |
| محلول | |||
| KCl | سيجما ألدريتش | 221473 | 110 ملي |
| كلوريد المغنيسيوم | سيجما ألدريتش | M8266 | 1.5 ملي |
| كلوريد الكالسيوم | Caisson | C021 | 0.8mM |
| HEPES | Research Products International | H75030 | 10mM |
| Pipet Solution | |||
| KCl | Sigma-Aldrich | 221473 | 3M |
| Saponin | |||
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | 0.125g |
| داخلي الحل | انظر أعلاه | 50 مل | |
| محلول | |||
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Sigma-Aldrich | M2004 | 100 مل من منتجات أبحاث 1M |
| HEPES | International | H75030 | 1.2g |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | متغير (درجة الحموضة إلى 7.4) |
| أجار المحببة | حل التخزين | ||
| NMDG | |||
| NMDG ، HEPES ، MES محلول هيدرات | انظر أعلاه | 40 مل | |
| ماء | 60 مل | ||
| اسم المواد / المعدات | رقم كتالوج | الشركة | التعليقات / الوصف |
| الأداء المشبك البويضة | Dagan | CA-1B | |
| نظام الحصول على البيانات | Axon CNS | & nbsp ؛ Digidata 1440A | |
| راسم الذبذبات | Tektronix | TDS 210 | |
| مرشح طاقة الرف | APC ؛ | G5 | |
| جهاز التحكم في درجة حرارة الحمام للتدفئة / التبريد | Dagan | HCC-100A | |
| PC | Dell | Optiplex 990 | |
| pCLAMP 10.3 Voltage Clamp Software | Molecular Devices ، LLC | pCLAMP10.3 | |
| TMC التحكم في الاهتزاز الجدول Top Platform | TMC | 64 SERIES | |
| TMC التحكم في الاهتزاز طاولة الهواء | TMC | 20 Series < / a> | |
| V1 / I قطب كهربائي جامع | البيانات Dagan | جزء من CA-1B | |
| MX10L Micromanipulator | Siskiyou | MX10L | |
| Bath / Guard (I / V) Headstage (مع الموصلات المناسبة) Dagan | جزء من CA-1B | ||
| Microscope | Omano | OM2300S-JW11 | |
| Temperature Sleep Bath | Custom أو Dagan | Custom أو غرفة مخصصة HE-204C | مصنوعة من مواد من البوليمرات الباردة (سلسلة D). يوفر داغان أيضا مرحلة مسبقة (HE-204C). |
| حاوية بيليه AgCl مخصصة | مخصصة | تشكيله | |
| Ag / AgCl ، بيليه ، 2.0 مم | Warner | E-206 | |
| حمام البويضة الخارجية | مخصص أو Dagan | Custom أو CC-1-T-LB | مخصص تشكيله أو تم شراؤه من Dagan |
| Internal Oocyte Bath | Custom أو Dagan | Custom أو CC-TG-ND | مخصص تشكيله أو شراؤه من Dagan |
| الشعيرات الدموية لجسور أجار والأقطاب الكهربائية المسحوبة | حوامل Warner | G150T-4 | |
| القابلة للدوران للمجهر ، ومعالج دقيق ، وحمام | Siskiyou | SD-1280P | |
| Fiber-Lite | Dolan-Jenner | LMI-600 | |
| Regular Bleach | Clorox | 470174-764 | |
| Xenopus laevis Ovcytes | Nasco | LM535M (الإناث الناضجات جنسيا) | |
| 90 Na+ الحل الخارجي | انظر ورقة | ||
| 10 Na+ الحل الداخلي | انظر ورقة | ||
| 3 M KCL | انظر ورقة | ||
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| NMDG | Storage Solution انظر ورقة | ||
| الحلولماصات نقل 5 مل | SciMart | GS-52 | |
| حاقن قطب كهربائي KCl | معدل BD | 309659 | طرف حقنة بلاستيكية ذائب للسماح بحقن المحلول في أقطاب كهربائية. بدلا من ذلك ، يمكن شراء Microfil بواسطة WPI. |
| Microvaccum | مخصص | ||
| مخصص ملقط | VWR | 63040-458 | |
| أدوات مناولة البويضات (مضخة الماصة) | VWR | 53502-222 | |
| زجاجة بخاخ الماء منزوع الأيونات | VWR | 16649-911 | |
| الفازلين الفازلين الفازلين | فيشر العلمي | 19-086-291 ؛ | |
| المواد الإضافية المطلوبة لتسجيلات VCF: | |||
| مجهر VCF | نيكون | كسوف FN1 | |
| نيكون CFI APO 40XW NIR الهدف | نيكون | N40X-NIR | |
| X-Y نظام مترجم للمجاهر المستقيمة ذات المرحلة الثابتة | أدوات Sutter | MT500-586 | |
| حمام البويضات | الخارجي VCF مخصصتشكيله مخصص. أبعاد الغرفة 2.7 × 1.9 × 0.4 سم. | ||
| حمام البويضة الداخلي VCF | مخصص | تشكيله. أبعاد الغرفة 1.6 × 1.6 × 0.4 سم. | |
| التحكم في درجة الحرارة المعدل | مخصصة | مصنوعة من مواد من البوليمرات الباردة (سلسلة D). أبعاد الغرفة لحمام التحكم في درجة الحرارة المعدلة هي 2.7 × 1.9 × 0.3 سم للغرفة الأفقية ، و 1 × 2.5 × 0.5 سم للغرفة العمودية. |
المراجع
- Kalstrup, T., Blunck, R. Dynamics of internal pore opening in KV channels probed by a fluorescent unnatural amino acid. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 8272-8277 (2013).
- Stefani, E., Bezanilla, F. Cut-open oocyte voltage-clamp technique. Methods Enzymol
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
