مقالة منهجية

محاكاة البنكرياس المرونة العصبية:

9.3K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/51049

⸱

أبريل 14, 2014

 ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Klinikum rechts der Isar, Technische Universität München, 2Department of Biotechnology, University of Applied Sciences Kaiserslautern/Zweibrücken

في هذه المقالة

ملخص

اللدونة العصبية هي ميزة المعترف بها على نحو متزايد، ولكن يفهم بشكل كاف من الجهاز الهضمي (GI) المسالك. هنا، في المثال من اضطرابات البنكرياس الإنسان، فإننا نقدم في المختبر فحص المرونة العصبية لدراسة اللدونة العصبية في الجهاز الهضمي على مستوى كل من المورفولوجية والوظيفية.

الملخص

المرونة العصبية هو سمة ملازمة للنظام والجهاز الهضمي (GI) المعوية العصبي والغدد العرقية في ظل ظروف مرضية. ومع ذلك، فإن دور المرضية في جسم المريض من المرونة العصبية في اضطرابات الجهاز الهضمي ما زال مجهولا. نماذج تجريبية الرواية التي تسمح المحاكاة والتشكيل من GI المرونة العصبية قد تمكين وتعزيز التقدير للمساهمة المرونة العصبية وبخاصة أمراض الجهاز الهضمي مثل سرطان البنكرياس (PCA) والتهاب البنكرياس المزمن (CP). هنا، نقدم بروتوكول للمحاكاة من المرونة العصبية البنكرياس في المختبر تحت ظروف استخدام الأطفال حديثي الولادة الظهري الفئران العقد الجذرية (DRG) والضفيرة العضلية المعوية (MP) الخلايا العصبية. هذا النهج المزدوج الخلايا العصبية يسمح ليس فقط رصد كل من المرونة العصبية، الجهاز الجوهرية وخارجي، ولكن أيضا تمثل أداة قيمة لتقييم ومورفولوجيا الخلايا العصبية الدبقية والكهربية. وعلاوة على ذلك، فإنه يسمح التشكيل وظيفية من محتويات microenvironmental الموردة لدراسة إيمباك بهمر على المرونة العصبية. بمجرد إنشائها، مقايسة المرونة العصبية الحاضر يحمل إمكانات قابلة للتطبيق على دراسة المرونة العصبية في أي جهاز GI.

المقدمة

وقد اشتعلت تغييرات في الجهاز الهضمي (GI) التشكل العصبية وكثافة انتباه أخصائي أمراض الباطنة والأطباء لفترة طويلة، ولكن أهميتها لالفيزيولوجيا المرضية لأمراض الجهاز الهضمي ما زال مجهولا 1-3. في الواقع، وترتبط العديد من الاضطرابات الشائعة GI عاليا مثل التهاب المعدة، التهاب المريء الجزر، والتهاب القولون، انسدادات، والتهاب الزائدة الدودية مع زيادة كثافة تعصيب في مناطق الأنسجة الملتهبة 1. ومع ذلك، فقد تم حتى الآن دفع أي اهتمام حقيقي لآليات ومعنى المرونة العصبية في الجهاز الهضمي. لا الأعصاب GI تغير شكليا تختلف من الأعصاب GI العادي، أي دولة طبيعية في الجهاز العصبي المعوي، من حيث وظيفتها؟ ما هي الآثار المترتبة على تغير المحتوى نيوروبيبتيدي / الناقل العصبي في الأعصاب المعوية البلاستيك؟ لا المرونة العصبية الطرفية تنطوي دائما يشير إلى تغير في الجهاز العصبي المركزي؟ وأين هي التوقعات المركزية للextri البلاستيكNSIC مسارات GI العصبية؟ ويمكن بسهولة أن تتولد سلسلة طويلة من هذه الأسئلة الأساسية عند النظر إلى قلة معرفتنا عن الجوانب الفنية للGI المرونة العصبية.

دراسة GI المرونة العصبية على مستوى وظيفي يتطلب نماذج تجريبية صالحة، واستنساخه تزال تنطبق بسهولة. في عصر تزايد شعبية وقبول النماذج المعدلة وراثيا المشروطة الماوس (GECoMM)، مثل الإعدادات في الجسم الحي تحمل القدرة على توضيح جوانب لم تكن معروفة سابقا من GI المرونة العصبية بطريقة واقعية 1. ومع ذلك، فإن تصميم وإنتاج GECoMM تبقى مكلفة، وكثيفة العمالة، وخاصة، تستغرق وقتا طويلا. وعلاوة على ذلك، فإنها تتطلب بداهة اختيار الهدف المراد التضمين مشروط في الماوس المعدلة وراثيا (المعدلة وراثيا مثل overexpression من عامل نمو الأعصاب / نيسان الخليج في الخلايا الظهارية المعوية). وبالتالي، لقصرIGN من GECoMM ناجحة، يحتاج الباحثون بعض المؤشرات (مثل البيانات التجريبية السابقة) من هدف جدير بالاهتمام، أي أن جزيء من الفائدة (هنا NGF) يمكن على الأقل أن يتوقع أن تمارس بعض الآثار ذات الصلة بيولوجيا الأعصاب في معهد جوته.

ويمكن بسهولة أن تستمد هذه المؤشرات كافية من نماذج في المختبر الذي فرعية خلية معزولة عن المكروية معقدة لفي الجسم الحي النظام يمكن cocultured انتقائي بطريقة غيروي 4-7. التشكيل الأهداف الجزيئية في مثل هذا الإعداد الثقافة غيروي هو في المتوسط ​​من الناحية الفنية أقل تعقيدا، وأسرع، وبالتالي يمكن أن تساعد في prefiltering أهداف جديرة بالاهتمام للتحقق في في الدراسات المجراة.

في الآونة الأخيرة، قدمنا ​​في المختبر فحص المرونة العصبية التي صممت لمحاكاة زيادة كثافة العصبية وتضخم في شمال شرق داخل البنكرياسrves في سرطان البنكرياس الإنسان (PCA) والتهاب البنكرياس المزمن (CP) الأنسجة. هنا، تعرضت الخلايا العصبية المشتقة من الأطفال حديثي الولادة الظهري الفئران الجذر العقد (DRG) أو الضفيرة العضلية المعوية (MP) لمقتطفات من الأنسجة PCA مقطوعة جراحيا أو CP أنسجة العينات ومقارنة تلك المستزرعة في البنكرياس الإنسان العادي (NP) مقتطفات الأنسجة 5. بدلا من مقتطفات الأنسجة، ويمكن للمرء أيضا استخدام خط الخلية supernatants لدراسة تأثير أنواع الخلايا المحددة على المرونة العصبية. عند دمجها مع قياس كيمونسيجيا موحدة، المرونة العصبية مقايسة قدمت يسمح تقييم صالحة وقابلة للتكرار من اللدونة العصبية في البنكرياس استجابة لmicroenvironments مختلفة. خاصة، فإنه يسمح للمحاكاة 1) المرونة العصبية المورفولوجية، أي تغييرات في ثمرة neurite، المتفرعة نمط وحجم الخلايا العصبية، و2) المرونة العصبية الوظيفية، أي تغييرات في استثارة الخلايا العصبية الطرفية. علاوة على ذلك، ليس فقط الطرفية (أي المعوية)، ولكن أيضا المركزية (على سبيل المثال DRG أو الثانية الشوكي النظام) يمكن تضمين الخلايا العصبية في مقايسة الحاضر لتقييم رد فعل المورفولوجية والوظيفية لمختلف محتويات الأنسجة GI. في فيديو تعليمي الحاضر، ونحن لشرح بروتوكول التقنية لأداء هذا الاختبار ومناقشة مزايا ونقاط ضعفها. وعلاوة على ذلك، نود أن نلفت الانتباه إلى انطباق المفهوم الأساسي لهذا الفحص لدراسة المرونة العصبية في أي جهاز GI.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

اتباع جميع الإجراءات التجريبية الحيوانية في البروتوكول المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان من جامعة ميونخ التقني، ألمانيا.

1. الإعلام / استخراج إعداد

  1. الأنسجة التجانس
    نوعية تجانس الأنسجة أمر بالغ الأهمية لكشف اللاحقة من التعديلات المرونة العصبية في الخلايا العصبية مثقف. هنا، ينصح الخالط التي تمكن تفارق الأنسجة من دون زيادة كبيرة في درجة حرارة الأنسجة.
    1. نقل 5 مم × 5 مم × 5 مم مكعبات من نسيج البنكرياس مباشرة من -80 درجة مئوية إلى النيتروجين السائل ومكان في المرحلة الصلبة في homogenator الأنسجة. ان homogenator مثالية فصل الأنسجة بسرعة كافية، دون السماح لها defreeze.
    2. مباشرة بعد التفكك، resuspend والصلبة، مثل مسحوق جناسة في 300-500 ميكرولتر من الفوسفات مخزنة المالحة 0.1X (PBS). هنا، لا تستخدم أي تحلل العازلة (مثل RIPA) لأن هذا قد ليز الخلايا العصبية.
    3. أجهزة الطرد المركزي في الخليط لمدة 15 دقيقة على الأقل في أقصى سرعة من أجهزة الطرد المركزي الخاصة بك مقاعد البدلاء (على سبيل المثال 21،130 x ج). جمع طاف واضحة والذي يمثل استخراج الأنسجة.
  2. supernatants خط الخلية
    1. السماح للخلايا الفائدة تصل إلى 70 على الأقل - 80٪ التقاء في وسط النمو الطبيعي.
    2. عادة، هذه الوسائط تحتوي على مكونات المصل وربما يؤدي الى تأثيرات لا يمكن السيطرة عليها على نمو الخلايا العصبية. لذلك، بعد أن وصلت كثافة الخلية المطلوبة، وغسل الخلايا الخاصة بك على الأقل 3X مع خلية ثقافة الصف PBS ووضعها في المصل خالية المتوسطة (SFM) لمدة تصل إلى 48 ساعة.
      ملاحظة: وهنا، نعتبر أن بعض الخلايا (مثل الخلايا النجمية البنكرياس) قد تحتاج المصل في وسائل الإعلام نموها من أجل الحفاظ على حالتها الطبيعية والبنية. في مثل هذه الحالات، نفذ التخفيفات التسلسلي في مصل المتوسطة من الخلية من الفائدة من أجل العثور على أدنى محتوى المصل ممكن اللازمة لfunctio خلية سليمةن.
    3. قياس تركيز البروتين من جناسة الأنسجة أو الخلايا supernatants عبر برادفورد فحص البروتين. في حين أن هذه القيم تختلف تبعا لنوع الأنسجة والخلايا، لمقتطفات الأنسجة البنكرياس، يتوقع المرء أن مجموعة تركيز بين 5-12 ميكروغرام / ميكرولتر، وsupernatants خط الخلية بين 3-8 ميكروغرام / ميكرولتر.

2. قسامة مقتطفات وSupernatants الخليوي

اعتمادا على تركيز لاستخدامها في الفحص، يجب أن يكون تركيز النهائي من استخراج أو طاف في المتوسط ​​العصبية 100 ميكروغرام / مل 5،8.

ملاحظة: للحصول على مقايسة مع الخلايا العصبية المتزايدة في 500 ميكرولتر المتوسطة في كل بئر من 24 لوحة جيدا، ويحتاج المرء 50 ميكروغرام من البروتين من كل مستخلص أو طاف لكل بئر. عند تركيز مستخلص نموذجية من حوالي 10 ميكروغرام / ميكرولتر، فإن المرء بحاجة إلى 5 ميكرولتر من استخراج / طاف لكل بئر. في كل settinز يؤديها باعتبارها ثلاث نسخ، وهذا يتوافق مع 15 ميكرولتر من استخراج / طاف. لأنواع مختلفة من الخلايا أو الأنسجة، نفذ التخفيفات التسلسلي للمستخلص النهائي أو تركيز طاف ومقارنة آثار عصبية وحظ بين مختلف تركيزات استخراج / طاف.

3. عزل الخلايا العصبية

بمجرد الانتهاء من جمع استخراج / طاف، الاستمرار في عزل الخلايا العصبية.

  1. لDRG الخلايا العصبية، وجمع عنق الرحم لقطني DRG من الفئران حديثي الولادة بين يوم ما بعد الولادة (P) 2-12 بعد قطع الرأس وتشريح stereomicroscopic من DRG (الشكل 1A). من أجل الحصول على الخلايا العصبية DRG كافية ل24 لوحة جيدا، وجمع كل عنق الرحم لقطني DRG أحد الفئران حديثي الولادة (ما يعادل 52 DRG) لكل لوحة.
    1. قطع بعيدا الطرفية (العصبية) والتوقعات المركزية (الجذور) من DRG عن طريق microscissors.
      ترك التوقعات في مكان يعوق سحن ويزيد رانه خطر التلوث الثقافة عن طريق الخلايا الليفية.
  2. لالخلايا العصبية MP، قطع بعيدا مساريق من الأمعاء الدقيقة ويدويا وبعناية تجريد قبالة طبقة الطبقتين المصلية و العضلية للأمعاء الدقيقة (عن بروتوكول مفصلة عن النائب العزلة، والرجوع إلى شيفر وآخرون. 9، الشكل 1B). لMP، جمع ضفيرة من اثنين من الفئران في 24 لوحة جيدا.
    ملاحظة: حاول أن تكون لطيف ممكن من أجل تجنب الدموع في طبقة الطبقتين المصلية و العضلية لأنها تعرقل فصل ناجحة في الفترة من الأمعاء الدقيقة.
  3. جمع DRG وطبقة الطبقتين المصلية و العضلية في الجليد الباردة الحد الأدنى من المتوسط ​​الأساسية (MEM) المتوفرة مع الجنتاميسين (حجز 20mg في المتوسط ​​500ML) وmetronidazol (2.5 ملغ في 500 مل متوسطة).
  4. بعد جمع DRG، واحتضان لهم في محلول ملح هانك المتوازن (HBSS) المتوفرة مع كولاجيناز النوع الثاني لمدة 20-30 دقيقة. لMP العزلة، واحتضان في نوع كولاجيناز بين 1-3 ساعة، وهذا يتوقف على عمرمن الحيوان (الشكل 1C).
  5. لMP، جمع مثل صافي النائب قطعة تحت stereomicroscope ونقل إلى MEM الجليد الباردة.
  6. ثم يسحن على DRG والنائب من خلال الحقن مع تناقص القطر.
    ملاحظة: سحن المفرط يمكن أن تدمر الخلايا العصبية، ولكن أقل من الخلايا الدبقية.
  7. بمجرد أن تصبح متوسطة تحتوي على DRG أو النائب غائم، الطرد المركزي تعليق على 93.9 x ج لمدة 5 دقائق، تجاهل المتوسطة وresuspend في المتوسطة Neurobasal (تستكمل مع 100 U / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين، 0.5MM L-الجلوتامين و 2٪ B-27).
  8. عد العدد الكلي للخلايا (أي الخلايا العصبية والدبقية) عن طريق عدادة الكريات.
    ملاحظة: عدد الخلايا اللازمة يعتمد على المعلمة القياس. لتقدير حجم الكثافة محوار، ويحتاج المرء الثقافات أكثر كثافة وبالتالي عدد أكبر من الخلايا من لقياس ثمرة neurite، حجم perikaryonalوالمتفرعة نمط من الخلايا العصبية الفردية. لقياس كثافة محوار، مثل استخدام 10،000 الخلايا (الخلايا العصبية الدبقية +) / جيد أو 1،500 الخلايا العصبية / جيد. لقياس الأشكال على الخلايا العصبية الفردية، وجيزة (1 طويلة دقيقة) trypsination من الخلايا وزرع البذور من 2،500 خلايا / جيد أو 400 الخلايا العصبية / ويوصى أيضا. العائد نموذجي من الخلايا التي تم الحصول عليها من الفئران واحدة حوالي 300،000-500،000 الخلايا.
  9. البذور الخلايا على coverslips 13 ملم التي تم المغلفة في الليلة التي سبقت وتتصدر الآبار مع المتوسطة Neurobasal (تستكمل مع 100 U / البنسلين مل، 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين، و 0.5 ملي L-الجلوتامين و 2٪ B-27) (الشكل 1D).
    ملاحظة: استخدم بولي-D-يسين (40 ملغ / م 2) أو الأورنيثين و(1 ملغ / مل لكل منهما) المغلفة المغلفة laminin زلات الغطاء. خلايا نعلق على بولي-D-يسين سريع للغاية، وبالتالي مما يجعلها مناسبة للتجارب التي يلزم فيها العديد من الخلايا (أي قياسات كثافة محوار). التعلق Laminin الحالي هو في بعض العامةما أضعف، ولكن Laminin الحالي هو المروج قوية من ثمرة neurite. لذلك، لإجراء قياسات على الخلايا العصبية المتفرعة وطول محوار، تفضل الأورنيثين / laminin طلاء.
  10. السماح للخلايا نعلق على الآبار بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، وإعداد وسائل الإعلام التي استكملت استخراج (في النهائي تركيز استخراج / طاف من 100 ميكروغرام / مل).
  11. نضح المتوسطة البذر، وإجراء اختياري، وغسل لطيف جدا مع برنامج تلفزيوني، ثم ماصة ببطء استخراج / تستكمل طاف وسائل الإعلام (الشكل 1E).
  12. السماح للخلايا تنمو لمدة 48 ساعة. نضح وسائل الإعلام والإصلاح في بارافورمالدهيد 4٪ لالمناعية (الشكل 1F).
  13. أداء مزدوجة المناعي تلطيخ باستخدام الخلايا العصبية محددة (على سبيل المثال بيتا III-تويولين) والدبقية محددة (على سبيل المثال الدبقية fibriallary الحمضية بروتين / GFAP) علامات (الشكل 1G).
  14. لقياس الأشكال، استخدام المجهر الضوئي مقلوب مجهزة بكاميرا CCD في تركيبة وايال البرنامج الآلي الذي يسمح مقياس كثافة محوار (انظر الجدول).
  15. يتم قياس كثافة محوار من الثقافات العصبية على 4-5 photomicrographs ممثل في التكبير 200X 4 من أكثف مناطق مختلفة من النمو على كل ساترة عن طريق تتراكب 50 ميكرومتر × 50 ميكرون الشبكة وعد كثافة الألياف لكل متر مربع تقاس في ألياف المتقاطعة. ثمرة neurite، يعني عدد من الفروع في الخلايا العصبية، وطول فرع الوسط وحجم perikaryonal يمكن قياسها من اختيارها عشوائيا 30 الخلايا العصبية الانفرادي من كل ساترة عن طريق وضع علامة neurites التي وperikarya (الشكل 1H).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

المرونة العصبية المورفولوجية

في الفئة العمرية المشار إليها من الفئران حديثي الولادة (P2-12) وكثافة البذر، والنائب DRG الخلايا العصبية بالفعل بناء الشبكات العصبية الكثيفة بعد 48 ساعة (الشكل 2A). المقارنة بين الكثافة محوار بين الخلايا العصبية المزروعة في محكمة التحكيم الدائمة، CP، ومقتطفات NP يكشف أكبر كثافة محوار من الخلايا العصبية DRG في محكمة التحكيم الدائمة أو مقتطفات من CP في مقتطفات ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

ويهدف هذا البروتوكول لتوضيح المنهجية وراء البنكرياس في المختبر فحص المرونة العصبية التي تم تطويرها مؤخرا من قبل مجموعتنا لدراسة آليات المرونة العصبية في محكمة التحكيم الدائمة وCP 5. يتضمن البروتوكول إجراء لمدة ثلاثة أيام والتي يمكن بسهولة أن تطبق مرة واحدة اكتسبت خبرة كافية في أداء العزلة وثقافة DRG والنائب الخلايا العصبية. وعلاوة على ذلك، فإنه يمثل أداة قيمة لدراسة رد فعل يصاحب ذلك من المعوي والدبقية DRG المصاحب لمكونات microenvironmental البنكرياس.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

والكتاب ليس لديهم المصالح المتنافسة وليس الإفصاحات المالية.

شكر وتقدير

ساهمت جميع المؤلفين نحو إنشاء والتحقق من صحة مقايسة المطروحة ومشروع للمخطوطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
بولي دي ليسين هيدروبروميدسيجما ألدريتشP1149
أورنيثين / لامينينسيجما ألدريتشP2533 / L4544
13 مم CoverslipsMerckللاستخدام في ألواح 24 بئرا
Dismembranator SSartorius
Anti-Beta-III-tubulin الجسم المضادMilliporeMAB1637تركيز 1: 200
الأجسام المضادة ل GFAPDAKOM07611: 400 تركيز
RIPA العازلة + مثبطأي مورد
الوسيط العصبيالعصبي جيبكو / علوم الحياة21103-049
B-27 الملحقGibco / علوم الحياة17504044من المعروف أن جودة B-27 تعتمد على رقم الدفعة
Gentamicin / MetronidazolAny المورد
الحد الأدنى من الوسط الأساسيGibco / علوم الحياة31095-029
Hank ' s محلول الملح المتوازن (HBSS)Gibco / علوم الحياة24020133يحسن نشاط الكولاجيناز عند احتوائه على Ca / Mg
Collagenase من النوع الثانيورثينجتون الكيمياء الحيويةCLS-2الحصول على الكثير بنشاط لا يقل عن 200 وحدة / ملغ
Trypsin-EDTA 0.25٪Gibco / علومالحياة 25200056
4٪ بارافورمالدهايدأي مورد
تحليل SIS docu برنامجأوليمبوس
البروتياز

المراجع

  1. Demir, I. E., Schafer, K. H., Tieftrunk, E., Friess, H., Ceyhan, G. O. Neural plasticity in the gastrointestinal tract: chronic inflammation, neurotrophic signals, and hypersensitivity. Acta Neuropathol. 125, 491-509 (2013).
  2. Vasina, V., et al. Enteric neuroplasticity evoked by inflammation. Auton. Neurosci. 126-127, 264-272 (2006).
  3. Lomax, A. E., Fernandez, E., Sharkey, K. A. Plasticity of the enteric nervous system during intestinal inflammation. Neurogastroenterol. Motil. 17, 4-15 (2005).
  4. Demir, I. E., et al. Neural Invasion in Pancreatic Cancer: The Past, Present and Future. 2, 1513-1527 (2010).
  5. Demir, I. E., et al. The microenvironment in chronic pancreatitis and pancreatic cancer induces neuronal plasticity. Neurogastroenterol. Motil. 22, 480-490 (2010).
  6. Schafer, K. H., Mestres, P. The GDNF-induced neurite outgrowth and neuronal survival in dissociated myenteric plexus cultures of the rat small intestine decreases postnatally. Exp. Brain Res. 125, 447-452 (1999).
  7. Schafer, K. H., Van Ginneken, C., Copray, S. Plasticity and neural stem cells in the enteric nervous system. Anat. Rec. 292, 1940-1952 (2009).
  8. Liebl, F., et al. The severity of neural invasion is associated with shortened survival in colon cancer. Clin. Cancer Res. 19, 50-61 (2012).
  9. Schäfer, K. H., Saffrey, M. J., Burnstock, G., Mestres-Ventura, P. A new method for the isolation of myenteric plexus from the newborn rat gastrointestinal tract. Brain Res. Brain Res. Protoc. 1, 109-113 (1997).
  10. Ceyhan, G. O., et al. Nerve growth factor and artemin are paracrine mediators of pancreatic neuropathy in pancreatic adenocarcinoma. Ann. Surg. 251, 923-931 (2010).
  11. Demir, I. E., et al. Neuronal plasticity in chronic pancreatitis is mediated via the neurturin/GFRalpha2 axis. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 303, 1017-1028 (2012).
  12. Joseph, N. M., et al. Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut. J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة