مقالة منهجية

التحقيق في آثار البروبيوتيك على المكورات الرئوية الاستعمار باستخدام في المختبر الالتزام الفحص

DOI:

10.3791/51069

⸱

أبريل 28, 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Pneumococcal Research, Murdoch Childrens Research Institute, 2Allergy & Immune Disorders, Murdoch Childrens Research Institute, 3Department of Otolaryngology, The University of Melbourne, 4Department of Microbiology & Immunology at the Peter Doherty Institute for Infection & Immunity, The University of Melbourne

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في فحوصات المختبر التقيد يمكن استخدامها لدراسة إلحاق العقدية الرئوية لالظهارية الطبقات الوحيدة الخلية والتحقيق التدخلات المحتملة مثل استخدام البروبيوتيك لتثبيط استعمار المكورات الرئوية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمسك العقدية الرئوية (المكورة الرئوية و) لبطانة الظهارية من البلعوم الأنفي يمكن أن يؤدي إلى الاستعمار، ويعتبر شرطا أساسيا للعدوى المكورات الرئوية مثل الالتهاب الرئوي والتهاب الأذن الوسطى. في المختبر فحوصات الالتزام يمكن استخدامها لدراسة المرفق من المكورات الرئوية إلى الخلايا الظهارية الطبقات الوحيدة للتحقيق والتدخلات المحتملة، مثل استخدام البروبيوتيك، لمنع استعمار المكورات الرئوية. يتم استخدام بروتوكول الموصوفة هنا للتحقيق في الآثار المترتبة على اللعابية العقدية بروبيوتيك على التزام المكورات الرئوية إلى خط الخلايا الظهارية البشرية CCL-23 (التي يشار إليها أحيانا التهاب الكبد-2 خلايا). ينطوي على فحص ثلاث خطوات رئيسية: 1) إعداد الخلايا الظهارية والبكتيرية، 2) إضافة إلى البكتيريا الظهارية الطبقات الوحيدة الخلية، و3) الكشف عن المكورات الرئوية تمسكا من قبل التهم قابلة للحياة (التخفيف المتسلسل وتصفيح) أو الكمي في الوقت الحقيقي PCR (QPCR ). هذا تكhnique واضح ومباشر نسبيا ولا تتطلب معدات متخصصة أخرى من الإعداد زراعة الأنسجة. الفحص يمكن استخدامها لاختبار أنواع الكائنات الحية المجهرية الأخرى و / أو مثبطات المحتملة للاستعمار المكورات الرئوية ويمكن تعديلها بسهولة لمعالجة المسائل العلمية الأخرى بشأن الانضمام المكورات الرئوية والغزو.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العقدية الرئوية (المكورة الرئوية و) هي نوع من البكتيريا موجبة الجرام التي يمكن أن تسبب العدوى بما في ذلك الالتهاب الرئوي والتهاب الأذن الوسطى، والتهاب السحايا. بل هو سبب رئيسي للمرض في الأطفال في البلدان المنخفضة الدخل ومسؤولة عن ما يقدر ب 800،000 حالة وفاة للأطفال دون سن الخامسة سنويا 1. وكثيرا ما تتم المكورات الرئوية في البلعوم الأنفي للأطفال الصغار. على الرغم من أن هذا الاستعمار يعتبر عموما أعراض، فإنه يسبق عدوى المكورات الرئوية وبمثابة خزان للبكتيريا في التجمعات البشرية 2. تطعيم المكورات الرئوية بشكل فعال يقلل من نقل الأنماط المصلية الواردة في اللقاح. ومع ذلك، هناك أكثر من 90 الأنماط المصلية للمكورات الرئوية، والتطعيم يمكن أن يؤدي إلى استبدال النمط المصلي، حيث يتبع القضاء على الأنماط المصلية لقاح ارتفاع في النقل والأمراض الناجمة عن الأنماط المصلية nonvaccine 3. أيضا، في بعض المجموعات السكانية المعرضة للخطر، المكورات الرئويةالاستعمار غالبا ما يحدث في الحياة في وقت مبكر جدا، قبل إعطاء الجرعة الأولى لقاح 4،5. في الآونة الأخيرة، وقد اقترح استخدام البروبيوتيك باعتباره استراتيجية إضافية لمنع الالتهاب الرئوي الاستعمار 6،7. وقد استخدمت في المختبر فحوصات التمسك دراسة التقيد المكورات الرئوية 8،9. وقد تم تكييف هذه المقايسات للتحقيق في تأثير بروبيوتيك rhamnosus اكتوباكيللوس GG (LGG) على الالتزام المكورات الرئوية 10.

بالإضافة إلى LGG وغيرها من بكتيريا حمض اللاكتيك، المكورات العقدية اللعابية، وهو من سكان شيوعا من تجويف الفم، وقد تم التحقيق باعتباره بروبيوتيك المحتملة لالجهاز التنفسي بسبب الاستعمار إمكاناتها وقدرتها على تثبيط المكورات الرئوية ومسببات الأمراض التنفسية الأخرى في المختبر 11 - 13. بروتوكول المعروضة هنا يصف مقايسة التقيد تستخدم للتحقيق في آثار S. اللعابية K12 على الالتزام المكورات الرئويةإلى خط الخلايا الظهارية البشرية CCL-23. قبل استخدامها في الفحص، وجرى تقييم عزلات المكورات الرئوية لقدرات الالتزام، والنمو وخصائص الالتزام يمكن أن تختلف بشكل كبير بين العزلات 10،14. منحنيات نمو المكورات الرئوية وS. أجريت اللعابية لتحديد مرحلة منتصف السجل والتركيز تقدير (وحدات تشكيل مستعمرة أو كفو / مل) من خلال الكثافة الضوئية (OD، الشكل 1). فمن المستحسن لدراسة النمو من خلال عدد قابلة للحياة والتطوير التنظيمي لكل عزل قبل استخدامها في الفحص. هذا الاختبار لا يمكن أن يؤديها في أي مختبر زراعة الأنسجة مع مرافق القياسية والمعدات. في هذا البروتوكول، وآثار ثلاث جرعات من S. اللعابية تدار 1 ساعة قبل إضافة المكورات الرئوية على التزام S. PMP843 الرئوية، وهو النمط المصلي 19F عزل النقل المستمدة من مسحة البلعوم، ويتم فحص. يتم عرض طريقتين مختلفتين لتقدير المكورات الرئوية تمسكا: الطلاء على أجار الدم لردعالألغام التهم قابلة للحياة، واستخراج الحمض النووي والكشف عن الجين lytA المكورات الرئوية التي كتبها QPCR 15. تمسك بروتوكول الفحص الأساسية يمكن تعديلها بسهولة لاختبار الجرعات أو الوقت لإقامة البروبيوتيك مختلفة، ويمكن أن تستخدم أيضا مع السلالات أو الأنواع البكتيرية الأخرى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد الظهارية وخلايا البكتيرية

  1. ذوبان بال-23 الخلايا الظهارية
    1. Prewarm الدنيا وسائل الإعلام الأساسية (MEM) تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ~.
    2. تعقيم الأنسجة التي وافق عليها مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية الثقافة مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام، ومسح أسفل منطقة العمل مع الايثانول 70٪. مسح زجاجة سائل الإعلام تحسنت مع الايثانول 70٪ ومكان في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية.
    3. باستخدام ماصة 25 مل، 14 مل من نقل وسائل الإعلام إلى T-75 قارورة. وضع القارورة في الحاضنة 37 درجة مئوية بينما الخلايا ذوبان (القسم 1.1.4).
    4. إزالة قارورة من CCL-23 الخلايا من تخزين النيتروجين السائل باستخدام احتياطات السلامة المناسبة ودافئة في حمام مائي 37 درجة مئوية حتى 80٪ إذابة ~.
    5. العودة القارورة أعدت في القسم 1.1.3 الى مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية. مسح السطح الخارجي للقارورة من CCL-23 الخلايا مع الايثانول 70٪ ومحتويات نقل (1 مل) في T-75 القارورة باستخدام ماصة P1000.
    6. احتضان القارورة على جانبها في 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2، 95٪ الرطوبة النسبية الأنسجة حاضنة الثقافة بين عشية وضحاها (16-20 ساعة).
    7. فحص الخلايا تحت المجهر لتأكيد مورفولوجيا صحية، وإزالة وسائل الإعلام، واستبدالها مع 15 مل الطازجة، prewarmed + MEM 10٪ FBS.
  2. صيانة بال-23 الخلايا الظهارية
    1. مرة واحدة الخلايا هي ~ 80٪ متموجة (1-2 أيام)، والمرور من خلال إزالة وسائل الإعلام باستخدام ماصة 25 مل وغسل بلطف الخلايا مرتين مع 8-10 مل prewarmed الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) باستخدام ماصة مل 10.
    2. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 1 مل من 0.25٪ التربسين العقيمة-EDTA (0.25٪ (ث / ت) التربسين، 0.1 ملي EDTA). بدوره القارورة على جانبها، وتناوب لضمان التربسين يغطي طبقة متموجة من الخلايا، واحتضان القارورة لمدة 2-3 دقيقة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 الحاضنة.
    3. prewarmed العودة قارورة الى مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية، إضافة 9 مل + MEM 10٪ FBS، وماصة صعودا وهبوطا 6 -8X إلى resuspend الخلايا، إخراج السائل أسفل الجانب من القارورة لإزاحة الخلايا.
    4. انقسام الخلايا 01:15 (1 مل + 14 مل + MEM 10٪ FBS) أو 01:30 (0.5 مل + 14.5 مل + MEM 10٪ FBS)، وتجاهل الخلايا الزائدة، والعودة إلى القارورة 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 الحاضنة.
    5. مرور الخلايا مرتين على الأقل قبل الاستخدام في فحص الالتزام. عادة يتم تقسيم خلايا كل 3-4 أيام.
  3. البذر من CCL-23 الخلايا الظهارية (يوم واحد قبل الانضمام الفحص، بروتوكول 2)
    1. تقسيم الخلايا متموجة كما هو موضح في أقسام 1.2.1-1.2.3، إعادة التعليق في MEM prewarmed + 5٪ FBS (يخفض تركيز FBS للحد من احتمالات مكونات المصل التدخل في مقايسة). إزالة 20 ميكرولتر من الخلايا والعد باستخدام تلطيخ التريبان الأزرق وعدادة الكريات.
    2. تمييع الخلايا في prewarmed MEM + 5٪ FBS إلى تركيز 1.5 × 10 5 خلية / مل في 50 مل أنبوب العقيمة.
    3. البذور 1 مل من الخلايا / جيد في الأنسجةثقافة التعامل مع 24 لوحة جيدا.
  4. إعداد البكتيريا
    يمكن أن يتبع هذا الإجراء لإعداد والمكورات الرئوية S. اللعابية. وعادة ما يتم الاحتفاظ سائط النمو البكتيري في حاضنة 37 درجة مئوية خلال الليل لprewarm واختبار العقم (عموما سوف تظهر غائم إذا الملوثة).
    1. يومين قبل الانضمام فحص والبكتيريا متتالية على الحصان أجار الدم (HBA) لوحات واحتضان عند 35-37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 ل 18-24 ساعة. الأغنام أجار الدم يمكن استخدامها كبديل.
    2. في اليوم التالي، وإعداد ثقافة بين عشية وضحاها لكل الأنواع البكتيرية بواسطة pipetting 10 مل تود هيويت مرق مع 0.5٪ خلاصة الخميرة (THB + YE) المتوسطة في أنبوب معقم 30 مل. باستخدام حلقة 10 ميكرولتر، تطعيم ما يقرب من 10-12 المستعمرات مفصولة جيدا. دوامة لفترة وجيزة واحتضان عند 35-37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 ل14-16 ساعة. نلاحظ أن المكورات الرئوية سوف يحل ذاتيا إذا تركت فترة طويلة جدا في الثقافة مرق.

2 الالتزام الفحص:. إضافة إلى البكتيريا الظهارية الطبقات الوحيدة الخلية

  1. إعداد الثقافات البكتيرية تسجيل من منتصف المكورات الرئوية وS. اللعابية
    1. ماصة 10 مل من prewarmed THB + YE في كل من اثنين العقيمة 30 مل أنابيب، واحد المكورات الرئوية وصفت وغيرها S. اللعابية.
    2. للوصول إلى مرحلة منتصف السجل، المكورات الرئوية تتطلب ~ 3 ساعة وS. اللعابية تتطلب ~ 2 ساعة الحضانة (انظر الشكل 1). بدء الثقافتين في نفس الوقت. دوامة (3-5 ثانية) الثقافات البكتيرية بين عشية وضحاها وإضافة 100 ميكرولتر المكورات الرئوية و 100 ميكرولتر S. اللعابية في أنابيب المقابلة.
    3. دوامة لفترة وجيزة واحتضان الثقافات في 37 درجة مئوية لمدة ما يقرب من 2 ساعة لS. اللعابية و3 ساعة عن المكورات الرئوية.
  2. إعداد بال-23 خلايا للانضمام مقايسة
    1. باستخدام مجهر مقلوب، والتحقق من 24 لوحة جيدا لconfluenر الطبقات الوحيدة مع مورفولوجيا الخلايا السليمة. يجب أن تكون الطبقات الوحيدة> 80٪ متموجة، دون وجود أدلة من التثاقل الخلية أو آثار الاعتلال الخلوي مثل التقريب الخلية أو فقدان الالتزام (انظر الشكل 2).
    2. إزالة وسائل الإعلام في كل بئر باستخدام ماصة نقل، إمالة لوحة قليلا لتجنب إزعاج أحادي الطبقة الخلية.
    3. لغسل بلطف الخلايا، إضافة ~ 500 ميكرولتر PBS prewarmed في كل بئر باستخدام ماصة المصلية وإزالته مع ماصة نقل، إمالة لوحة قليلا. تجاهل برنامج تلفزيوني. كرر الخطوة غسل مرة واحدة.
    4. إضافة 500 ميكرولتر من MEM prewarmed + 5٪ FBS في كل بئر. عودة 24 لوحة جيدا للحاضنة CO 2 في حين تستعد الثقافات البكتيرية.
      ملاحظة: لتحديد بالضبط بال-23 عدد الخلايا لتعدد العدوى (وزارة الداخلية)، واثنين من الآبار يمكن trypsinized وعدها في يوم الإصابة.

3. الالتزام الفحص

  1. إضافة إلى المكورات الرئويةالخلايا CCL-23 في وزارة الداخلية ~ 10:01. اختبار الشروط المذكورة في الجدول 1 في الآبار مكررة.
    1. قياس الكثافة البصرية في A 600 (OD) من 1 مل من S. ثقافة اللعابية. يجب أن يكون بين 0.3-0.6 OD.
    2. نقل 5 مل من S. ثقافة اللعابية في أنبوب 10 مل وأجهزة الطرد المركزي في 1،870 x ج لمدة 4 دقائق.
    3. تجاهل طاف، واستنادا إلى القراءة OD في القسم 3.1.1، في resuspend S. اللعابية في 200-1،000 ميكرولتر من 0.85٪ كلوريد الصوديوم (تركيز النهائي ~ 1.5 × 10 9 كفو / مل). كمبدأ توجيهي عام، سيتم معلق على OD من 0.375 في 260 ميكرولتر. إعداد 1:10 و 1:100 التخفيفات من S. اللعابية باستخدام 0.85٪ كلوريد الصوديوم.
      ملاحظة: في المجموع، ثلاثة تركيزات (تمثل العالي والمتوسط ​​والجرعات المنخفضة) س. وسيتم اختبار اللعابية في الفحص. الجرعة العالية هي نسبة ~ 10 S. اللعابية: 1 المكورات الرئوية، والمتوسط ​​هو ~ 1 س. اللعابية: 1 المكورات الرئوية، وانخفاض هو ~ 1 S. اللعابية: 10 المكورات الرئوية.
    4. إخراج 24 لوحة جيدا من الحاضنة.
    5. من آبار المراقبة الهيبارين، وإزالة 40 ميكرولتر من وسائل الإعلام وإضافة 50 ميكرولتر من الهيبارين (1،000 U / مل تركيز الأسهم) لتركيز النهائي من 100 U / مل.
    6. إضافة 10 ميكرولتر من 0.85٪ كلوريد الصوديوم إلى الآبار التي تحتوي على خلايا بال-23 فقط والآبار التي تحتوي على بال-23 الخلايا والمكورات الرئوية (لا S. اللعابية).
    7. إضافة 10 ماي من غير مخفف، 1:10 و 1:100 من S. اللعابية لآبار منها.
      ملاحظة: S. اللعابية ويمكن أيضا أن تضاف في نفس الوقت المكورات الرئوية (coaddition) أو 1 ساعة بعد المكورات الرئوية (آخر بالإضافة إلى ذلك) لدراسة تأثير زمن الإدارة بروبيوتيك.
    8. أجهزة الطرد المركزي في 24 لوحة جيدا في 114 x ج لمدة 3 دقائق لتعزيز الاتصال البكتيرية مع طبقة الخلايا واحتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2.
    9. أداء التخفيف التسلسلي للS. الأسهم اللعابية في 0.85٪ كلوريد الصوديوم وعلى لوحة مكررة HBAلوحات لتهم قابلة للحياة. الأولى، إضافة 50 ميكرولتر من الأسهم إلى 450 ميكرولتر من 0.85٪ كلوريد الصوديوم لجعل 10 -1 التخفيف، ثم نبض دوامة (5 ثانية)، نصائح التغيير، وإضافة 50 ميكرولتر من التخفيف 10 -1 إلى 450 ميكرولتر من 0.85٪ كلوريد الصوديوم لجعل 10 -2 التخفيف وهكذا دواليك حتى 10 -7.
    10. لوحة 100 ميكرولتر من -5 10، 10 -6 و 10 -7 التخفيفات في مكررة على لوحات HBA وتنتشر مع رش العقيمة. احتضان لوحات HBA مقلوب بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2.
    11. نحو نهاية الحضانة 1 ساعة، كرر أقسام 3.1.1-3.1.3 عن المكورات الرئوية. يجب أن تكون المواد المستنفدة للأوزون بين 0،2-0،7. تدور باستمرار 1 مل من ثقافة المكورات الرئوية و resuspend بيليه في 300-2،000 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم 0.85٪ (على أساس القراءة OD) إلى تركيز ~ 1.5 × 10 8 كفو / مل. كمبدأ توجيهي عام، سيتم معلق على OD من 0.3 في 500 ميكرولتر.
    12. بعد 1 ساعة الحضانة مع S. اللعابية، إضافة 10 μ، ل المكورات الرئوية غير مخفف لجميع الآبار باستثناء آبار المراقبة السلبية (التي تحتوي على الخلايا فقط).
    13. أجهزة الطرد المركزي في 24 لوحة جيدا في 114 x ج لمدة 3 دقائق واحتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 لمدة 3 ساعة. أداء التخفيف المتسلسل للسهم المكورات الرئوية في 0.85٪ كلوريد الصوديوم كما هو موضح في القسم 3.1.9 والتخفيفات لوحة 10 -4، 10 -5، و 10 -6 على لوحات HBA مكررة عن التهم قابلة للحياة.
  2. بعد 3 ساعة، والتحقق من الخلايا تحت المجهر للتأكد من أن الطبقات الوحيدة تبدو صحية (انظر الشكل 2). إزالة وسائل الإعلام من كل بئر وبلطف غسل الخلايا 3X كما هو موضح في القسم 2.2.3. باستخدام ماصة مختلفة لكل حالة. هذه الخطوة ضرورية لإزالة المكورات الرئوية غير ملتصق. يجب على الطبقات الوحيدة لا تتمزق أثناء عملية الغسيل؛ هذا ويمكن التأكد عن طريق فحص مرة أخرى تحت المجهر.

ملاحظة: وسائل الإعلام خلال هذه الخطوة إزالة يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية لمدة تحليلات إضافية (<م> مثل قياس مستويات خلوى).

  1. إضافة 200 ميكرولتر من 0.1٪ ديجيتونين (منظف لطيف) إلى كل بئر واحتضان لمدة 7 دقائق عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2.
  2. إضافة 800 ميكرولتر من وسائل الإعلام THB إلى كل بئر. ليز الخلايا بواسطة pipetting صعودا وهبوطا، وإذا لزم الأمر، وتتخلص من الآبار 3-4X مع طرف ماصة للتأكد من إزالة الخلايا أحادي الطبقة تماما. تغيير نصائح بين الآبار.
  3. إزالة محتويات من كل بئر باستخدام ماصة P1000 ونقل إلى أنابيب microfuge المسمى.

4. الكمي لتمسكا الرئوية

المكورات الرئوية تمسكا يمكن قياسها كميا من خلال تحديد التهم قابلة للحياة (التخفيف المتسلسل وتصفيح على أجار الدم) أو عن طريق الكمي في الوقت الحقيقي PCR.

  1. طريقة العد قابلة للحياة
    يجب أن يتم تنفيذ هذه الطريقة على الفور بعد الخطوة 3.5 من الفحص الالتزام.
    1. لكل بئر مقايسة، وإعداد التخفيفات التسلسلي للعينات التي تم جمعها فيالخطوة 3.5 من الفحص الالتزام بإضافة 50 ميكرولتر من العينات إلى 450 ميكرولتر من 0.85٪ كلوريد الصوديوم، نبض vortexing ل، وتمييع متسلسل كما هو موضح في القسم 3.1.9 يصل إلى التخفيف 10 -6.
    2. لوحة 100 ميكرولتر من -3 10، 10 -4، 10 -5، و 10 -6 التخفيفات في مكررة على أجار الدم، تنتشر مع رش العقيمة، واحتضان لوحات مقلوب ليلا 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2. لاحظ أن الآبار التي تحتوي على بال-23 الخلايا وحدها ينبغي أن لا يحتوي على أية البكتيريا ويمكن مطلي أنيق (100 ميكرولتر غير مخفف) كعنصر تحكم العقم.
    3. في اليوم التالي، وتحديد قائح المكورات الرئوية عن طريق عد المستعمرات على لوحات التخفيف المناسبة (التي تحتوي على 30-300 المستعمرات) التي أعدت في القسم 3.1.13 للمقايسة الالتزام. حساب كفو / مل من قائح باستخدام قيمة متوسط ​​من اثنين من لوحات. وبالمثل، وتحديد S. اللعابية قائح عن طريق عد المستعمرات على لوحات أعدتفي القسم 3.1.10.
      ملاحظة: يجب أن تحتوي لوحات المكورات الرئوية فقط؛ وجود أنواع أخرى تشير إلى أن فحص كانت ملوثة وغير صالحة النتائج.
    4. لتحديد مستويات الالتزام المكورات الرئوية، عد لوحة التخفيف المناسبة (التي تحتوي على 30-300 المستعمرات المكورات الرئوية) لكل عينة أعدت في القسم 4.1.1. نلاحظ أن S. سوف المستعمرات اللعابية تكون صغيرة وبيضاء، في حين سيكون بسبب المكورات الرئوية مسطحة ومخضر إلى α-انحلال الدم، كما هو موضح في الشكل 3. لحساب الالتزام المكورات الرئوية، وتطبيع عدد من المكورات الرئوية تمسكا من حالة ب. بال-23 + الخلايا الرئوية إلى 100٪، ومقارنة المكورات الرئوية تمسكا من الشروط الأخرى لهذا الشرط.
  2. طريقة QPCR
    العينات التي تم جمعها في الالتزام الفحص الخطوة 3.5 يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية حتى استخراج الحمض النووي. يتم تنفيذ استخراج الحمض النووي باستخدام طقم التجارية وصفها في أقسام 4.2.1-4.2.9 وQPCR كماويقول في أقسام 4.2.10-4.2.20.
    1. إعداد الأنزيمية الاحتياطي تحلل (50 ملي الفوسفات العازلة درجة الحموضة 6.7 يحتوي على 1 ملغ / مل الليزوزيم، 0.075 ملغ / مل mutanolysin، و 2 ملغ / مل بروتين K). الوصفة التالية يمكن استخدامها جعل 10 مل (ما يكفي لمدة 50 الاستخراج). العازلة تحلل الأنزيمي يجب الطازجة قبل استخدامها.

      7.25 مل من حل 50 ملي فوسفات العازلة (درجة الحموضة 6.7)
      1.00 مل من 10 ملغ / مل الليزوزيم الأسهم للنهائي [1 ملغ / مل]
      0.75 مل من 1 ملغ / مل mutanolysin الأسهم للنهائي [0.075 ملغ / مل]
      1.00 مل من 20 ملغ / مل الأسهم بروتين كاف للنهائي [2 ملغ / مل]
    2. ذوبان الجليد العينات على الجليد أو على 4 درجات مئوية. دوامة ونقل 100 ميكرولتر مأخوذة من كل عينة في أنابيب microfuge المسمى. العودة عينات الأصلي مرة أخرى في الثلاجة -20 درجة مئوية.
    3. الطرد المركزي العينات في 6700 x ج لمدة 10 دقيقة.
    4. إزالة وتجاهل طاف. إضافة 200 ميكرولتر من العازلة تحلل الأنزيمي لبيليه ودوامة ل resuspend. Incubأكلت العينات عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. لفترة وجيزة الطرد المركزي (5 ثانية) في 6700 x ج لجمع السائل في الجزء السفلي من الأنبوب.
    5. إضافة 10 ميكرولتر من 20٪ SDS لاستكمال تحلل الخلية والمزيج بلطف في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة.
    6. إضافة 4 ميكرولتر من ريبونوكلياز A (100 ملغ / مل الأسهم) والمزيج بلطف (على الكرسي الهزاز أو عكس الأنابيب) في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة.
    7. إضافة 200 ميكرولتر من العازلة AL (من مجموعة) ودوامة لمدة 15 ثانية. احتضان العينات عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. لفترة وجيزة الطرد المركزي (5 ثانية) في 6700 x ج لجمع السائل في الجزء السفلي من الأنبوب.
    8. إضافة 200 ميكرولتر من 100٪ ETOH ودوامة لمدة 15 ثانية. تدور لفترة وجيزة لجمع السائل في أسفل الأنبوب، ثم نقل الخليط (بما في ذلك أي راسب) لعمود الدوران (في أنبوب جمع 2 مل) من دون ترطيب الحافة. اتبع الخطوات من غسل وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (لا يظهر هنا).
    9. لأزل الحمض النووي، ونقل العمود في أنبوب microfuge المسمى، إضافة 50 ميكرولتر من العازلة AE (الابمجموعة أوم)، ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي في 4300 x ج لمدة 1 دقيقة. أكرر مرة واحدة لحجم شطف النهائي من 100 ميكرولتر. ويمكن تخزين الحمض النووي في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    10. لأداء QPCR، تعقيم خزانات مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة قبل أن تبدأ. إعداد 96 لوحة جيدا خريطة رقة عمل لتسجيل المواقع جيدا لكل عينة ويوصى.
    11. إعداد منحنى القياسية باستخدام 10 نانوغرام / ميكرولتر من الحمض النووي الأسهم المكورات الرئوية الجيني (المستخرج من سلالة مرجعية آي تي ​​سي سي 6305).
      1. ذوبان الجليد الحمض النووي الأسهم المكورات الرئوية وتدور باستمرار لفترة وجيزة (5 ثانية) في جهاز للطرد المركزي الطاولة.
      2. أداء 01:10 التخفيفات التسلسلي في 6 أنابيب microfuge prelabeled بإضافة الحمض النووي 3 ميكرولتر إلى 27 ميكرولتر nuclease خالية H 2 O، وتغيير نصائح وبين كل vortexing لتخفيف. سلسلة التخفيف النهائية يتكون من 6 أنابيب: 1، 0.1، 0.01، 0.001، 0.0001، و0.00001 نانوغرام / ميكرولتر.
        ملاحظة: هذه يمكن تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
    12. PreparMASTERMIX ه lytA على النحو التالي في العقيمة 15 مل أنبوب مخروطي في PCR غطاء العقيمة. ذوبان الجليد على الجليد مكونات ودوامة مباشرة قبل الاستعمال.
      عنصر في رد فعل س 102 (لوحة كاملة)
      lytA F 0.25 ميكرولتر من 10 ميكرومتر الأسهم 25.5 ميكرولتر
      lytA R 0.25 ميكرولتر من 10 ميكرومتر الأسهم 25.5 ميكرولتر
      lytA التحقيق 0.5 ميكرولتر من 10 ميكرومتر الأسهم 51 ميكرولتر
      H 2 O 9.5 ميكرولتر 969 ميكرولتر
      مزيج الرئيسي 12.5 ميكرولتر 1،275 ميكرولتر
      الحجم النهائي 23 ميكرولتر 2،346 ميكرولتر
      ملاحظة: بعض الأجهزة في الوقت الحقيقي PCR تتطلب استخدام صبغة المرجعية، الذي يرد في بعض mastermixes تجارية أو يمكن أن تضاف بشكل منفصل. تم تصميم هذا البروتوكول لتشغيل 25 ميكرولتر ردود الفعل في لوحة 96 جيدا ولكن يمكن تعديلها لاستيعاب مختلفة في الوقت الحقيقي آلات PCR. نشرت الاشعال وتسلسل التحقيق في الأصل من قبل 15 كارفاليو وآخرون. وترد في قائمة المواد.
    13. دوامة وتحميل 23 ميكرولتر / جيد من lytA خلط في الآبار المناسبة. الرجوع إلى لوحة الخريطة.
    14. لوحة وسائل النقل إلى منطقة القالب بالإضافة إلى ذلك (ويفضل أن يكون مجلس الوزراء العقيمة في غرفة منفصلة) لعينة التحميل.
    15. استخدام ماصة P2 لتحميل العينات، وتغيير نصائح لكل بئر. يتم تشغيل جميع العينات في مكررة. الرجوع إلى لوحة خريطة للموقع.
    16. للآبار منحنى القياسية، إضافة 1 ميكرولتر / جيد من التخفيف المناسبة من الحمض النووي منحنى القياسية زائد 1 ميكرولتر / جيد H 2 O لجلب الحجم النهائي إلى 25 ميكرولتر.لا لآبار المراقبة القالب، إضافة 2 ميكرولتر H 2 O.
    17. إضافة 2 ميكرولتر / جيد عينة من الحمض النووي في الآبار المناسبة.
    18. تتويج جميع الآبار في الاستخدام. يتم إغلاق جعل القبعات تأكد بشكل مريح. تدور بسرعة لوحة PCR (5 ثانية) قبل تحميل لوحة في الوقت الحقيقي PCR الجهاز.
    19. لوحة PCR الحمل في الجهاز وتشغيل QPCR وفقا للتعليمات التي تقدمها الشركة المصنعة للجهاز. وأوصى التحقيق الظروف الدراجات التحلل التالية:
      الخطوة 1 (1X): 3 دقيقة في 95 ° C
      الخطوة 2 (40X): 20 ثانية في 95 ° C
      20 ثانية في 60 ° C
    20. جمع البيانات وتحديد الحمض النووي المكورات الرئوية باستخدام منحنى القياسية. يتم حساب الأحمال البكتيرية كما هو موضح سابقا 17، مقدرا أن 1 خريج من الحمض النووي الجيني ما يعادل 447.4 الخلايا، وكما ذكرت كفو / مل (على افتراض سشمال شرق الجينوم في كفو، ونسخة واحدة من lytA في الجينوم؛ انظر الشكل 4). لفحص ناجحة، ينبغي ≥ آر 2 القيمة 0.98 وجميع نتائج إيجابية ضمن مجموعة من منحنى القياسية (CT قيم أقل من تلك التي يحصل عليها لنانوغرام 0.00001 / ميكرولتر نقطة منحنى القياسية تعتبر الخلفية / lytA سلبية).
      ملاحظة: بعض أنظمة PCR الوقت الحقيقي تأتي مع برامج التحليل التي يمكن استخدامها لبناء منحنيات القياسية وحساب المجهولة. خلاف ذلك، وهذه الحسابات لا يمكن أن يؤديها في Excel أو برامج مماثلة. ويظهر منحنى القياسية سبيل المثال في الشكل 4.
    21. لحساب الالتزام المكورات الرئوية، وتطبيع عدد من المكورات الرئوية تمسكا من حالة ب. بال-23 + الخلايا الرئوية إلى 100٪، ومقارنة المكورات الرئوية تمسكا من الشروط الأخرى لهذا الشرط.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

النتائج من تجربة تمثيلية في المكورات الرئوية التي تمت إضافتها (S. الرئوية PMP843، وهو 19F عزل استعمار) لCCL-23 الخلايا 1 ساعة بعد إضافة S. اللعابية، وكان كميا الالتزام من قبل كل من المكورات الرئوية العد قابلة للحياة وlytA QPCR وترد في الجدول 2. وكانت النتائج متسقة بين طريقتين لكلا العدد المطلق من البكتيريا (كما عرضت كفو / مل) والتقيد٪، تطبيع لعدد المكورات الرئوية من ملتصقة في الآبار التي تحتوي على المكورات الرئوية وحدها. يستخدم الهيبارين...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جزء حاسم من هذا الاختبار هو إضافة تركيزات مناسبة من S. اللعابية والمكورات الرئوية في الأقسام 3.1.7 و3.1.12. وتقدر تركيزات باستخدام قراءات OD ولكن لم يتم تحديد قائح بالضبط حتى تحسب لوحات في اليوم التالي. لهذا السبب، فإننا ننصح أداء منحنيات النمو لقياس OD وتعول قابلة للحياة (كفو / مل) مع مرور الوقت لجميع السلالات البكتيرية المستخدمة في الفحص لتحديد المرحلة سجل منتصف والمساعدة في تقدير تركيز من قبل OD. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للسلالات المكورات الرئوية تختلف كثيرا في خصائص انض...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل من خلال تمويل من معهد أبحاث الطفولة مردوخ وبرنامج دعم البنية التحتية التشغيلية للحكومة فيكتوريا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الحد الأدنى من الوسائط الأساسية (MEM)ثيرمو فيشر العلميSH30244.01 
مصل الأبقار الجنيني (FBS)ثيرمو فيشر العلميSH30084.03 
T-75 قارورةNunc156472 
خلايا CCL-23ATCCCCL-23 
تربسينلايفتكنولوجيز 15090046 
24-بئر خلية لوحة ثقافةNunc142475 
لوحات أجار دم الحصان (HBA)OxoidPP2001لوحات أجار دم الأغنام مقبولة أيضا
مرق تود هيويتأوكسويدCM0189  ؛
مستخلص الخميرةبيكتون ديكنسون212750 
Digitoninسيجما - ألدريتشD141-100MG  ؛
كوفيت يمكن التخلص منهKartell1938 
HeparinPfizer2112105في أمبولات معقمة بسعر 5,000 وحدة دولية / 5 م/ .
موزعة معقمةTechnoplasS10805050بدلا من ذلك ، يمكن غمس موزعة الزجاج في 96٪ من الإيثانول وتعقيم باللهب قبل كل استخدام
LysozymeSigma-AldrichL6876  ؛
MutanolysinSigma-AldrichM9901 
Proteinase KQiagen19133 
SDS 20٪ حلAmbionAM9820 
RNase AQiagen19101 
QIAamp DNA mini-kit (250)Qiagen51306 
LytA F التمهيديSigma-Aldrichمخصص صنع5 '-> 3' تسلسل ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA
LytA R التمهيديSigma-Aldrichصنع مخصص5 '-> 3' تسلسل   TCGTGCGTTTTAATTCCAGCT
LytA مسبارEurogentecمخصص مصنوع5 '-> 3' تسلسل Cy5-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ3 ، يمكن استخدام الفلوروفورات البديلة
خالية من النوكليزAmbionAM9906  ؛
Brilliant III Ultra Fast QPCR mastermixAgilent Technologies600880 
الكشف الحرارية السريعة 96ثيرمو فيشر العلميAB-1100  ؛
شرائط غطاء qPCR فائقة الوضوحThermo Fisher ScientificAB-0866  ؛
نظام Mx3005 QPCRAgilent Technologies401449 
* تتوفر مصادر بديلة لمعظم / جميع المنتجات المدرجة.
يأتي لوحة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. O'Brien, K. L., et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. Lancet. 374, 893-902 (2009).
  2. Bogaert, D., de Groot, R., Hermans, P. W. M. Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. Lancet Infect. Dis. 4 (04), 144-154 (2004).
  3. Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination. Lancet. 378 (10), 1962-1973 (2011).
  4. Jacoby, P., et al. Modelling the co-occurrence of Streptococcus pneumoniae with other bacterial and viral pathogens in the upper respiratory tract. Vaccine. 25, 2458-2464 (2007).
  5. Kwambana, B., Barer, M., Bottomley, C., Adegbola, R., Antonio, M. Early acquisition and high nasopharyngeal co-colonisation by Streptococcus pneumoniae and three respiratory pathogens amongst Gambian new-borns and infants. BMC Infect. Dis. 11, (2011).
  6. Licciardi, P. V., et al. Protecting against pneumococcal disease: critical interactions between probiotics and the airway microbiome. PLoS Pathog. 8, (2012).
  7. Popova, M., et al. Beneficial effects of probiotics in upper respiratory tract infections and their mechanical actions to antagonize pathogens. J. Appl. Microbiol. 113 (6), 1305-1318 (2012).
  8. Pracht, D., et al. PavA of Streptococcus pneumoniae modulates adherence, invasion, and meningeal inflammation. Infect. Immun. 73, 2680-2689 (2005).
  9. Adamou, J. E., Wizemann, T. M., Barren, P., Langermann, S. Adherence of Streptococcus pneumoniae to human bronchial epithelial cells (BEAS-2B). Infect. Immun. 66, 820-822 (1998).
  10. Wong, S. S., et al. Inhibition of Streptococcus pneumoniae adherence to human epithelial cells in vitro by the probiotic Lactobacillus rhamnosus GG. BMC Res. Notes. 6 (1), 135(2013).
  11. Wescombe, P. A., Heng, N. C. K., Burton, J. P., Chilcott, C. N., Tagg, J. R. Streptococcal bacteriocins and the case for Streptococcus salivarius as model oral probiotics. Future Microbiol. 4, 819-835 (2009).
  12. Di Pierro, F., Adami, T., Rapacioli, G., Giardini, N., Streitberger, C. Clinical evaluation of the oral probiotic Streptococcus salivarius K12 in the prevention of recurrent pharyngitis and/or tonsillitis caused by Streptococcus pyogenes in adults. Expert. Opin. Biol. Ther. 13 (3), 339-343 (2013).
  13. Fiedler, T., et al. Protective mechanisms of respiratory tract streptococci against Streptococcus pyogenes biofilm formation and epithelial cell infection. Appl. Environ. Microbiol. 79, 1265-1276 (2013).
  14. Slotved, H. C., Satzke, C. In vitro growth of pneumococcal isolates representing 23 different serotypes. BMC Res. Notes. 6, 10-1186 (2013).
  15. Carvalho, M. dG. S., et al. Evaluation and improvement of real-time PCR assays targeting lytA, ply, and psaA genes for detection of pneumococcal DNA. J. Clin. Microbiol. 45, 2460-2466 (2007).
  16. Tonnaer, E. L. G. M., et al. Involvement of glycosaminoglycans in the attachment of pneumococci to nasopharyngeal epithelial cells. Microbes Infect. 8, 316-322 (2006).
  17. Smith-Vaughan, H., et al. Measuring nasal bacterial load and its association with otitis media. BMC Ear Nose Throat Disord. 6, (2006).
  18. Letourneau, J., Levesque, C., Berthiaume, F., Jacques, M., Mourez, M. In vitro assay of bacterial adhesion onto mammalian epithelial cells. J. Vis. Exp. , (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Streptococcus salivarius qPCR CCL 23

مقالات ذات صلة