الاجتثاث من خلية واحدة من خلايا الأجنة ثمانية من القشريات Amphipod<em&gt; Parhyale hawaiensis</em

ملخص

وhawaiensis amphipod Parhyale هو كائن نموذج واعد للدراسات علم الأجنة القشريات والتنمية المفصلية المقارن والتطور. يصف هذا البروتوكول وسيلة لإزالة دليل عن Blastomeres احد من بداية مرحلة الانقسام الأجنة من Parhyale.

الملخص

وhawaiensis amphipod Parhyale هو القشريات الصغيرة وجدت في الموائل البحرية المد والجزر في جميع أنحاء العالم. على مدى العقد الماضي، برز Parhyale كما كائن نموذج واعد للدراسات المختبرية للتنمية، وتوفير المقارنة outgroup مفيدة للمدروسة نموذج المفصلية الحي ذبابة الفاكهة السوداء البطن. وعلى النقيض من الانشقاقات المخلوي من ذبابة الفاكهة، والانشقاقات في وقت مبكر من Parhyale هي شمولي التنسج. تعيين مصير باستخدام الأصباغ التتبع حقنها في وقت مبكر عن Blastomeres أظهرت أن وضعت كل الطبقات الجرثومية الثلاث وخط الجرثومية التي كتبها المرحلة ثمانية الخلايا. في هذه المرحلة، والحظ ثلاثة عن Blastomeres أن تؤدي إلى الأديم الظاهر، ومقدر لثلاثة تؤدي إلى الأديم المتوسط، وعن Blastomeres المتبقيين هي السلائف من الأديم الباطن والجرثومية خط على التوالي. ومع ذلك، فقد أظهرت التجارب الاجتثاث قسيم أرومي أن الأجنة Parhyale أيضا تمتلك قابليات تنظيمية كبيرةوفاق، مثل أن مصائر عن Blastomeres ذاب في مرحلة ثماني خلايا يمكن الاستيلاء عليها من قبل أحفاد بعض عن Blastomeres المتبقية. وقد سبق وصفها قسيم أرومي الاجتثاث من جانب واحد من طريقتين: حقن وتفعيل لاحقة من الأصباغ الضوئية أو الاجتثاث اليدوي. ومع ذلك، جذ بالضوء يقتل عن Blastomeres ولكنه لا يزيل خلايا الجسم الميتة من الجنين. ولذلك قد الإزالة المادية كاملة من عن Blastomeres محددة يكون الأسلوب المفضل الاجتثاث عن بعض التطبيقات. هنا نقدم بروتوكول للالإزالة اليدوية للعن Blastomeres واحدة من مرحلة الثمانية خلايا الأجنة Parhyale، مما يدل على الأدوات والإجراءات اليدوية اللازمة لإزالة كاملة من خلايا الجسم مع الحفاظ على ما تبقى على قيد الحياة عن Blastomeres وسليمة. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول إلى أي خلية Parhyale في مرحلة الثمانية خلايا، أو عن Blastomeres الأخرى مراحل الانقسام في وقت مبكر. بالإضافة إلى ذلك، من حيث المبدأ هذا البروتوكول يمكن أن تطبق على الحريه في وقت مبكرvage الأجنة مرحلة أخرى اللافقاريات البحرية الشق holoblastically.

المقدمة

برزت Parhyale hawaiensis amphipod القشريات على مدى العقد الماضي كنموذج كائن واعدة مع إمكانات كبيرة لاستخدامها في البحوث التطورية البيولوجيا التطورية ^1. بين المفصليات، معظم أنظمة النموذج هي الحشرات، ودرس على نطاق واسع معظم هذه هي ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة السوداء البطن. D. البطن هو عضو من ذوات الجناحين أجل الحشرات، وعلى هذا النحو يعرض العديد من الميزات الجنينية التي يتم اشتقاق فيما يتعلق بتلك المتفرعة من باسالي الحشرات ^2. علاوة على ذلك، يتم تداخل الحشرات داخل شعيبة Pancrustacea ^3، وهذا يعني أن الحشرات لها أقرب أقربائهم داخل الجماعة منذ فترة طويلة "طبيعية" ودعا pancrustaceans، وأن هذه المجموعة هي paraphyletic. وهذا يشير إلى أنه بالإضافة إلى المتفرعة باسالي نماذج الحشرات، وهناك حاجة لدراسات أخرى لمن القشريات اكتساب نظرة اوسع من التاريخ التطوري للالصفات التنموية والآليات الجزيئية الثانية التي تم دراستها بشكل جيد في D. البطن. ومع ذلك، عدد قليل جدا من القشريات تم راسخة لتحليل المختبر التجريبي للتنمية. وamphipod P. hawaiensis هو نظام نموذجي مختبر لين العريكة للغاية، قابلة لمجموعة من التقنيات التجريبية. عرض مزدوجات الأرجل العديد من المزايا الفريدة داخل فوق رتبة الأم Peracarida (النطاط الشاطئ، وصواريخ سكود، والجمبري جيدا)، ولذلك يعتقد أن تستمد نسبيا ضمن هذه المجموعة من القشريات. ومع ذلك، فإن السهولة النسبية في التلاعب الجيني الجنينية والوظيفية التي توفرها Parhyale جعل هذا amphipod إضافة قيمة إلى المخزون الحالي للكائنات النموذج.

كحيوان المختبر، P. hawaiensis توفر العديد من المزايا. الحيوانات متسامحون إلى مجموعة واسعة من درجات الحرارة والملوحة، والبقاء على قيد الحياة بشكل جيد في الثقافات كبيرة من مياه البحر الاصطناعي ^1. فمن السهل أن نميز betwالذكور والإناث التابعين على أساس الاختلافات الشكلية واضحة، وعلى الأخص، وكبيرة، مدمن مخدرات، والزوائد الجذع الأمامي أن الذكور استخدامها لفهم الإناث أثناء التزاوج. للعمل الجنينية والتنموية، P. hawaiensis لديها العديد من الميزات جذابة جدا. مرحلة التطور الجنيني تستغرق حوالي 10 يوما والوقت لمرحلة النضج الجنسي ما يقرب من ستة أسابيع عند 28 º C (لكن لاحظ أن Parhyale ينجو جيدا في درجات حرارة تتراوح من حوالي 20-30 º C، وأن معلومات مفصلة التدريج التنموية متاح للأجنة التي أثيرت في 18 º C ⁴ ، 25 º C ^4، و 26 º C ^5،6). البالغين تتزاوج على مدار السنة في المختبر، لذلك هي الأجنة متوفرة في أي وقت من السنة. وضع الإناث 2-20 (اعتمادا على عمر الأنثى) البويضات المخصبة في الحقيبة الحضنة بطني الواقعة بين أول عدة أزواج من الأرجل (أرقام 1A و 1B)، وأنه من الممكن لجمع هذه الأجنةق في التنمية في وقت مبكر جدا من دون قتل الأنثى أو إتلاف الأجنة (الشكل 1C). الأجنة البقاء على قيد الحياة في تصفية مياه البحر الاصطناعي حتى الفقس، يمكن ان تكون ثابتة للالتعبير الجيني لاحقة أو التحليل النسيجي ^7، ويسمح جدول التدريج مفصلة التحديد الدقيق للتقدم من خلال التنمية ^5. وقد استخدمت بروتوكولات قوية لإجراء تحليل التعبير الجيني عن طريق الموقع التهجين أو المناعية ^{8-15 4،16،17} في، ضربة قاضية الوظيفية التي تدخل الحمض النووي الريبي ^13،15 أو ¹² morpholinos، ومستقرة خط نقل الجينات الجرثومية ^18. باستخدام نظام نقل الجينات والتعبير ومحرض ¹⁴ فخ محسن ويمكن أيضا أن تستخدم أساليب ¹⁹ للتحقيق وظيفة الجين في P. hawaiensis. في حين أن تسلسل الجينوم للجمهور غير متوفر حاليا، والتي تحتوي على Transcriptome على النصوص التي تنتج أثناء التطور الجنيني وoogenesis والنحلن دي نوفو تجميعها والمشروح ^20، وأودعت في قاعدة بيانات يمكن البحث ^21، وتسهيل اكتشاف الجينات. باختصار، P. hawaiensis هو كائن نموذج لين العريكة للغاية ومناسبة لمناهج تجريبية وراثية متعددة لفهم التنمية.

على عكس الانقسامات المخلوي في وقت مبكر من D. البطن، P. الأجنة hawaiensis يلتصق holoblastically بعد الإخصاب (الشكل 2A). وقد أظهرت نسب تحليل تتبع ذلك عن طريق الانقسام الثالث، والحظ كل من انشقاق عن Blastomeres الثالث على وجه التحديد أن تؤدي إلى واحدة من الطبقات الجرثومية الثلاث أو خط الجرثومية ⁶ (الشكل 2B). هذه البيانات، جنبا إلى جنب مع بيانات ميكروأري ^22، نسب خلية يحلل ^6،23، ولقد اقترح التجارب قسيم أرومي العزلة ⁴ أن الإمكانيات التنموية هي منفصلة على الأقل بعض انشقاق عن Blastomeres الثالث بالميراث غير المتماثلة من سلل المحددات مصير. وفقا لذلك، في التجارب قسيم أرومي الاجتثاث التي تمت إزالة السلائف خط الجرثومية (وهو ما يسمى "ز" في Parhyale النسب الخلية التسميات ⁶⁾ في مرحلة الخلية الثمانية، تفتقر الأجنة الخلايا الجرثومية في المراحل التنموية في وقت لاحق ^4، كما يدل على ذلك عدم وجود خلايا معربا عن البروتين فاسا، الذي هو علامة خط الجرثومية في معظم metazoans ^24. في المقابل، أظهرت التجارب الجسدية الاجتثاث قسيم أرومي أن P. الأجنة hawaiensis أيضا تمتلك قدرات تنظيمية كبيرة، مثل أن مصير الأديم المتوسط ​​أو الأديم الظاهر عن Blastomeres السلائف ذاب في مرحلة الثمانية خلايا يمكن الاستيلاء عليها من قبل أحفاد بعض عن Blastomeres المتبقية ^25. كيف يمكن أن يحدث التنظيمية استبدال مصير الخلية، ومدى الحكم الذاتي اعتماد مصير خلية جسدية من قبل عن Blastomeres، ما زال مجهولا. تقنيات الجنينية التجريبية مثل قسيم أرومي الاجتثاث يمكن أن تكون مفيدة في فهمهاقرع الاستقلالية النسبية وnonautonomy القرارات مصير الخلية ^26،27، وبالتالي فهي ذات أهمية في دراسة P. hawaiensis مرحلة التطور الجنيني.

في التجارب التي أثبتت استبدال التنظيمية من الأدمة وأرومية متوسطة الأنساب، تم تنفيذ الاجتثاث قسيم أرومي عن طريق الحقن ²⁸ و الإثارة اللاحقة من الأصباغ الضوئية ^25. في حين أن هذا الأسلوب هو فعالة في قتل قسيم أرومي حقن (ق)، فإنه لا إزالة خلايا الجسم الميتة من الجنين. بالإضافة إلى ذلك، لوحظت اختلافات بين البيانات التي تجمع من خلال النسب الخلية إلى مراحل تكون المعيدة من التطور الجنيني عن طريق حقن عن Blastomeres مع استشفاف النسب الفلورسنت ^28،29، والبيانات التي جمعتها التالية عن Blastomeres رابط الجأش من خلال تطوير نفس المراحل الجنينية ^23. ولذلك قد الإزالة المادية كاملة من عن Blastomeres محددة يكون الأسلوب المفضل الاجتثاث عن بعض التطبيقات.

نشرنا سابقا نتائج النسب خلية تحليل الأجنة في الخلايا التي تم واحد ذاب ²³ يدويا. ومع ذلك، فإن عمليات حساسة المطلوبة لإزالة واحدة من أوائل عن Blastomeres الانقسام الأجنة المرحلة لم يتم وصفها بشكل كامل. هنا نقدم بروتوكول لجمع P. الأجنة hawaiensis والاجتثاث دليل لقسيم أرومي واحد من ثمانية خلايا الجنين المرحلة. الهدف من هذا الأسلوب هو تحقيق الإزالة الكاملة للجسم خلية من الجنين، مما يتيح مراقبة السلوكيات الخلوية والكفاءات مصير خلية من الخلايا المتبقية خلال مرحلة التطور الجنيني والتنمية في مرحلة ما بعد الجنينية. يظهر لدينا بروتوكول إزالة السلائف ز خط الجرثومية (الشكل 2C)، ولكن يمكن تطبيقها على أي خلية في المرحلة ثماني خلايا، أو عن Blastomeres من مراحل الانقسام في وقت سابق. من حيث المبدأ، يمكن تطبيق هذا البروتوكول لإزالة الخلايا واحد من أوائل الأجنة مرحلة الانقسام من آلات موسيقية أخرىص الشق holoblastically اللافقاريات البحرية.

البروتوكول

يشار إلى التعليقات التي قد تكون مفيدة في تنفيذ بعض الخطوات بخط مائل.

1. اليوم 1: إعداد مواد

1. إعداد المواد التالية (انظر الجدول المواد والمعدات):
   • 15 سم و 22 سم ماصات باستور
   • الماس الكاتب
   • تصفية مياه البحر الاصطناعي (الملوحة بين 0،0018-0،0020) تحتوي على 1 ملغ / مل الامفوتريسين B (1:100 من محلول المخزون 100 ملغ / مل)، و 100 وحدة / مل البنسلين و 100 ملغ / مل الستربتوميسين (1:50 من محلول المخزون تحتوي على 5،000 وحدة / مل من البنسلين و 5،000 ملغ / مل من الستربتوميسين)
   • تصفية مياه البحر الاصطناعي (الملوحة بين 0،0018-0،0020) دون إضافات
   • حاوية بلاستيكية كبيرة للأزواج الإسكان (لا يقل عن 15 سم x 15 سم x 5 سم)
   • (3 سم أو 5 سم) أطباق بتري صغيرة تصطف مع Sylgard
   • (3 سم أو 5 سم) أطباق بتري الصغيرة
   • على زجاجة ساعة أو الزجاج لوحة متعددة جيدا
   • المستمدة ملقط (نستخدم ملقط حادة جيئة وذهابام القديم دومون # 5 ملقط التي تضررت بطريق الخطأ في الإجراءات المختبرية الأخرى، والتي قمنا أغراض أخرى باستخدام ملقط شحذ الحجر للتأكد من أن طرفي ملقط وسلاسة، أن كلا من أسنان هي طول نفس، وأنه لم يعد لديهم نقطة حادة. ملقط غرامة للغاية، مثل دومون # 5 جديدة ملقط، غير مرغوب فيها لأنها قد تجرح الأجنة و / أو الإناث.)
   • ماصة باستور مع نهاية اتسعت (انظر الخطوة 1.2 أدناه)
   • أداة استرجاع الجنين يتكون من رقيقة، سلك التنغستن منحني جزءا لا يتجزأ في نهاية رقيقة من ماصة باستور (يمكن الاستعاضة عن بديل تنفيذ، وانظر 1.3 أدناه)
   • ماصة الفم مع فتحة صغيرة (انظر الخطوة 1.4 أدناه)
   • إبرة الزجاج مصنوعة من الزجاج الشعرية سحبت (انظر الخطوة 1.5 أدناه)
   لا تستخدم مواد سامة للإنسان في هذا البروتوكول. ومع ذلك، يجب على الباحثين التأكد من أنها ارتداء القفازات أو الملابس الواقية الأخرى كما هو مطلوب من قبل جويدل إدارة المخاطرإيناس مؤسستهم.
2. لجعل باستور ماصة اتسعت، والنتيجة الأولى حول ماصة باستير 15 سم عند النقطة التي يبدأ ماصة لتضييق مع الكاتب الماس، والتفاف المنطقة وسجل من ماصة في Kimwipe أو منشفة ورقية لحماية الأصابع، ثم بعناية كسر قبالة الطرف في سطر النتيجة. عقد نهاية كسر من ماصة على لهب الموقد بنسن لعدة ثوان لضمان سلاسة حواف. وينبغي أن يكون افتتاح أضيق قليلا من أقصى عرض لها ماصة.
3. لجعل التنغستن أداة تشريح الأسلاك، سلك التنغستن إدراج في نهاية 15 سم الزجاج ماصة باستور، وعقد لفترة وجيزة على لهب الموقد بنسن لإذابة الزجاج، وتحديد السلك في المكان. استخدام ملقط لمنحنى بلطف نهاية السلك في شكل مدمن مخدرات. انظر الشكل 3 للحصول على مثال لشكل مناسبة لهذه الأداة.
4. لجعل فتحة صغيرة للماصة الفم، وسحب نهاية رقيقة من 22 سم ماصة باستير إلى قسمين اوفإيه لهب، وقطع غيض من نهاية صغيرة. تضاف إلى نهاية حامل ماصة الفم.
5. جعل إبرة الزجاج التي سيتم استخدامها لثقب عن Blastomeres من الفائدة أثناء إجراء الاجتثاث باستخدام مجتذب الإبرة. يظهر على شكل إبرة مناسبة في الشكل 4. تم سحب هذه الإبرة على ساحبة سوتر P97 إبرة باستخدام البرنامج مع المعلمات 2X (الحرارة = 566، وسحب = 100، السرعة = 20، والوقت = 250) + 1X (الحرارة = 566، وسحب = 100، السرعة = 100، الوقت = 250). برنامج محدد وأداة تستخدم لجعل إبرة يمكن أن تختلف، ولكن يجب أن يكون إبرة نقطة غرامة، ولكن أيضا يكون قوي بما فيه الكفاية على عدم كسر عندما دفعت ضد المشيماء الجنين.

2. يوم 1: الأزواج التجمع Parhyale التزاوج

1. استخدام ماصة باستير اتسعت (الخطوة 1.2 أعلاه) لجمع التزاوج P. الأزواج hawaiensis من الحاوية ثقافة كبيرة، ونقلها إلى وعاء يحتوي ج منفصلةالعجاف مياه البحر الاصطناعي. فإنه ليس من الضروري أن مياه البحر هذه تتم تصفيته. فمن الأفضل لجمع أزواج التزاوج في فترة ما بعد الظهر في وقت لاحق وترك الأزواج في درجة حرارة الغرفة (20-23 درجة مئوية) بين عشية وضحاها، لذلك ان في صباح اليوم التالي، سيكون قد تم إخصابها معظم الأجنة وأودعت مؤخرا، وبالتالي في أوائل مراحل الانقسام مناسبة ل الاجتثاث. جمع ما لا يقل عن 20 أزواج التزاوج لضمان أن بعض الإناث سيتم تنفيذ المرحلة المبكرة الانقسام الأجنة من صباح اليوم التالي.

3. يوم 2: التجمع Parhyale الأجنة

• في صباح اليوم التالي، ولبث تصفية مياه البحر الاصطناعي (FASW) مع CO _2. سيكون قد سبح بعض الإناث خالية من الذكور أثناء الليل؛ جمع هذه الإناث وفصل تخدير لهم في FASW / CO _2. ويمكن إزالة ما تبقى من الذكور المفردة من الحاوية الزوج التزاوج، وعاد إلى ثقافة كبيرة. يمكن حفظ أزواج التزاوج المتبقية لجمع الجنين في وقت لاحقفي اليوم أو في اليوم التالي.
• نقل الإناث الخدر واحدة تحمل أجنة إلى الزجاج ووتش في FASW / CO _2. ومن المرجح أن تودع جميع الإناث فصل البيض، والتي سوف تكون مرئية بالعين كما وردي شاحب أو الأرجواني الكروية من خلال لوحات وركي شفافة من الإناث (الشكل 1A). لتحديد ما إذا كانت الأجنة في مراحل الانقسام في وقت مبكر، وبالتالي مناسبة لقسيم أرومي الاجتثاث، فإن الباحث لديك لإزالة الأجنة من الحقيبة الحضنة ويفحصها تحت المجهر.
• عرض إجراء تشريح تحت المجهر، فهم لوحات وركي على طول جانب واحد من الجسم مع ملقط. سوف الأجنة تكون مرئية في الحقيبة الحضنة بطني بين هذه اللوحات وركي (الشكل 1B).
• إدراج رقيقة، والأسلاك منحني أداة (الشكل 3، خطوة 1.3 أعلاه) في نهاية الخلفي من الحقيبة الحضنة، ورفع بلطف السلك في نهاية الأمامي من الحقيبة الحضنة لفصل الحضنةفرش الحقيبة (هذه الزوائد البطنية يتم تعديل دعا oostegites ^30)، وفتح الحقيبة وتخفيف الأجنة. الأجنة التي هي في غضون الساعة الأولى أو نحو ذلك من التي تزرع يتم تضمين كل ذلك ضمن رقيقة جدا، وغشاء شفاف من شأنها أن تتعطل بسهولة بواسطة أداة الأسلاك؛ يختفي هذا الغشاء قبل ما يقرب من 2-3 ساعة بعد وضع البيض، والأجنة ليست ملزمة إلى بعضها البعض أو إلى الأنثى بأي شكل من الأشكال من هذه النقطة فصاعدا طوال مرحلة التطور الجنيني. إذا كان العثور الباحثون انه غير مريح أو صعبة للمناورة الأداة الأسلاك المنحنية لإزالة الأجنة من الحقيبة الحضنة، بديلا تنفيذ يمكن استخدامها، طالما أن الحركات هي لطيف ويتم تطبيق أي ضغط قاس على الأجنة أو الحقيبة الحضنة. غيرها من الأدوات المناسبة لإزالة الأجنة من الحقيبة الحضنة تشمل ملقط اضعافها أو الزجاج الشعرية مع نهاية مختومة وممهدة.
• استخدام دون تغيير 15 سم باستور ماصة لطرد المياه من خلال الحقيبة الحضنة فتح، ودفع خارج رانه الأجنة، والتي ينبغي أن تستقر في الجزء السفلي من الزجاج ووتش. نقل الإناث لتنظيف FASW (دون CO ₂₎ للسماح الانتعاش قبل إعادة تقديم لها لثقافة الرئيسي. يمكن وضعها الإناث متعددة في طبق الانتعاش نفسه، ولكن تسمح الإناث حتى يتعافى تماما قبل إعادتهم إلى الثقافة الرئيسية، لأنها قد يؤكل من قبل الحيوانات الأخرى لا تزال في حالة تخدير جزئي فيها.
• استخدام دون تغيير 15 سم باستور ماصة لنقل الأجنة إلى طبق بتري مع FASW نظيفة، وعرض تحت المجهر لتحديد مراحلها الجنينية. الأجنة المنفصلة التي هي في الانقسام الثالث (المرحلة 4 ^5)، والتي هي مناسبة لهذا الإجراء. كما ينبغي أن يكون من الممكن تطبيق هذا البروتوكول إلى أي مرحلة الانقسام قبل تشكيل القرص الجرثومية (مراحل ^07-08 مايو).

4. يوم 2: الذوبان خلايا واحدة

1. ملء Sylgard مبطنة طبق بيتري مع طبقة ضحلة من FASW. استخدام دون تغيير 15 سم باستور بيpette لنقل الجنين واحدة على لوحة.
2. باستخدام ملقط حادة، ولفة بلطف الجنين لتحديد الخلية أن يكون ذاب (أرقام 2A و 2B). مقدمة ز خط الجرثومية يمكن حصرها في أصغر قسيم مكروي، الذي يجلس على رأس أصغر قسيم كبروي MÁV. بالإضافة إلى ذلك، لا ز الاتصال مباشرة الخلية أون، والذي هو قسيم مكروي مباشرة عبر من ذلك، كما مل micromeres الأديم المتوسط ​​السلائف وحصة السيد حدود الخلية في المنتصف من الجنين. السيد هو قسيم أرومي على يمين غرام، و مل هو قسيم مكروي على يسار ز. وmacromeres شقيقة السيد، مل، وحمام هي السلائف الأديم الظاهر ايه، ش، والجيش الشعبي على التوالي.
3. مع ملقط في LEFر اليد إذا كان الباحث هو اليد اليمنى (أو في اليد اليمنى إذا أعسر الباحث)، توجيه الجنين مع الخلية التي تهم الحق (أو إلى اليسار إذا أعسر الباحث)، و فهم بلطف الجنين بين ملقط لتثبيته.
4. باستخدام إبرة سحب الزجاج (الخطوة 1.5 أعلاه؛ الشكل 4)، ثقب بلطف الخلية من الفائدة. لا يدخل الإبرة بعيدا جدا، حتى لا تدفع الإبرة في الخلايا المجاورة أو أسفل الخلية من الفائدة. الإبرة لديه فقط لثقب المشيماء وغشاء الخلية الأساسية، وليس بحاجة لتمديد عميقا في الخلية أن يكون ذاب.
5. تبادل إبرة تستخدم لثقب الجنين في نهاية كوب من ماصة الفم مع غرامة سحبت ماصة باستير طرف (الخطوة 1.4 أعلاه). عقد غيض من ماصة على مقربة من الحفرة التي تم إنشاؤها في الخلية من الفائدة، وتطبيق الشفط لطيف جدا.
6. جدا الضغط بلطف الجنين مع ملقط. كما محتوى الأرومةودفعت مجرد الخروج من المشيمه من خلال ثقب بإنشائه في الخطوة 4.4، أمتص له في ماصة الفم للسماح مشهدا من الجنين. إذا كانت حفرة كبيرة بما فيه الكفاية، ونواة الخلية ثقب يمكن أن ينظر إليها في الظهور أيضا. هذا هو الاختيار الجيد للتأكد من تم إزالة محتويات الخلية بأكملها ولا يمكن تجديدها.
7. مراقبة بعناية الجنين كما يتم إزالة قسيم أرومي من الفائدة. والحدود من الخلية بثقب تنحسر نحو ثقب في المشيمه، مما يجعل من التقاطعات من الخلايا الكامنة مرئية. مواصلة الضغط حتى يتم إزالة كافة قسيم أرومي من الفائدة. استخدام ملقط للفة الجنين من جانب إلى آخر وتأكيد بصريا أن كل قسيم أرومي من الفائدة هو ذهب.
8. باستخدام دون تغيير 15 سم باستور ماصة، ونقل الجنين لتنظيف FASW + (FASW + 1 ملغ / مل الامفوتريسين B، و 100 وحدة / مل البنسلين و 100 ملغ / مل الستربتوميسين).
9. رفع الأجنة ذاب قسيم أرومي في الآبار الفرديةنظيفة لوحة 48 جيدا في FASW +، وتغيير 50٪ من المضادات الحيوية تستكمل FASW + اليومية. في أيدينا الأجنة البقاء والتطور بشكل جيد، حتى بعد الاجتثاث، في مجموعة من درجات الحرارة 18-28 درجة مئوية. يجب على الباحثين جمع الأجنة بهم عند درجة حرارة التي لديهم سطح نظيف (ولكن ليس بالضرورة العقيمة) الذي رفع الأجنة مع الحد الأدنى من الإزعاج. لتكون قادرة على المقارنة بين توقيت الأحداث التنموية في الأجنة ذاب قسيم أرومي مع الضوابط، ونحن إحالة القارئ إلى المعلومات التدريج التنموية التفصيلية التي يتوفر الأجنة التي أثيرت في 18 º C ^4، 25 º C ^4، و 26 º C ^5،6.

النتائج

التالية الاجتثاث ناجحة من الانقسام ثالث واحد P. micromeres hawaiensis كما هو موضح في هذا البروتوكول، وmicromeres المتبقية التحول تدريجيا مواقعها قليلا وذلك لتحتل جزئيا المساحة المحتلة سابقا من قبل قسيم أرومي ذاب. على سبيل المثال، عندما تتم إزالة غرام، المجاورة عن Blastomeres السيد ومل التحول قليلا ويأتي للمشاركة في حدود الخلية الجانبية التي كانت سابقا في اتصال مباشر مع ز (قارن الشكل 2A و ...

المناقشة

نحن تصف بروتوكول للالاجتثاث دليل والإزالة المادية كاملة من واحد عن Blastomeres من مراحل الانقسام في وقت مبكر من amphipod P. hawaiensis. ونحن لشرح استخدام هذا البروتوكول عن طريق إزالة واحدة خط الجرثومية الخلية السلائف ز من ثماني خلايا مرحلة الجنين، وتبين أن الاجتثاث قد حققت نجاحا من خلال التأكد من عدم وجود خلايا ابنة ز 'ق في مرحلة التطور الجنيني في وقت لاحق. هذا البروتوكول يمكن استخدامها لإزالة أي من micromeres من الجنين في مراحل الانق...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
ماصة باستور 15 سم	ويتون	53499-630 VWR	لنقل الأجنة السليمة والمفصولة بالبلاستومير من طبق إلى آخر.
ماصة باستور 22 سم	ويتون	53499-632 VWR	لصنع أطراف ماصة الفم.
أطباق بتري 3 سم	Thermo Scientific	25382-334 VWR	استخدم بعضها دون تغيير لجمع الأجنة وتخزينها ؛ قم بتغطية بعضها بطبقة من Sylgard (انظر أدناه) لإنشاء سطح عمل لاستئصال الأريمة.
48 بئر ألواح	Greiner Bio-One	82051-004 VWR	لزراعة الأجنة بعد الاستئصال.
مرشحات أعلى الزجاجة 0.2 & ميكرو; m	Nalge Nunc International	28199-296 VWR	لإنشاء FASW (انظر أدناه).
موقد بنسن	VWR	89038-530 VWR	لإنشاء أداة سلك التنغستن وطرف ماصة الفم الدقيقة.
الكاتب الماسي	موسكو للإضاءة الرياضية	52865-005 VWR	لإنشاء ماصات باستور واسعة الفم لجمع الأزواج.
أدوات العلوم الدقيقة	الملقط	11050-10 أدوات العلوم الدقيقة	لحمل الإناث المخدرات أثناء إزالة الأجنة من كيس الحضنة. لا يجب أن تكون هذه ملقط دومون ناعم الرؤوس - يمكن أن تكون الأطراف على الأقل حادة مثل تلك الموجودة في الملقط الذي تم إدراج رقم الكتالوج له هنا.
Fungizone-Amphotericin B	Sigma	A2942 Sigma Aldrich	أضف إلى FASW إلى التركيز النهائي البالغ 1 مجم / مل ، واستخدم هذا المحلول لزراعة الأجنة المستعصصة بالبلاستومير.
الشعيرات الدموية الزجاجية 4 بوصات طويلة ، 1 / 0.58 OD / ID (مم) أدوات	الدقة العالمية	1B100-4 أدوات الدقة العالمية	لصنع إبر لثقب الأريمة المراد استئصالها.
زجاج ساعة بقطر 300 مم	علوم المجهر الإلكتروني	70543-30 علوم المجهر الإلكتروني	للاستخدام في إزالة الأجنة من كيس الحضنة للإناث المخدرات.
مياه البحر الاصطناعية الفورية للمحيط (ASW)	المحيط الفوري	IS160 النظم البيئية المائية	تصنع ASW عن طريق إذابة الملح في المياه منزوعة الأيونات إلى ملوحة 1.022-1.024.
مياه البحر الاصطناعية المصفاة الفورية للمحيط (FASW)	المائية الفورية للمحيط	IS160	0.2 ومايكرو ؛ م مرشحات لتعقيم ASW. المكياج بكميات صغيرة (< 250 مل) حسب الحاجة.
Kimwipes	Kimberly-Clark	21905-026 VWR	لكسر الطرف الدقيق لماصات باستور المعدلة لجمع الأزواج.
محول ماصة الفم	Drummond Labware	A5177-5EA Sigma Aldrich	أدخل طرف ماصة باستور المسحوبة بدقة في هذه النهاية ، لاستخدامها لإزالة محتويات الخلايا المبثوقة أثناء إجراء الاستئصال.
أنبوب ماصة الفم	Aldrich	Z280356 Sigma Aldrich قص	هذا ليكون طويلا بما يكفي لتعليقه بشكل مريح حول رقبتك أثناء إجراء الاستئصال.
شركة مجتذب الإبرة	Sutter Instrument	Company P97 Sutter Instrument	Company لصنع الإبر من الشعيرات الدموية الزجاجية لثقب الأريمية المراد استئصالها.
محلول البنسلين والستربتومايسين	Mediatech	45000-650 VWR	أضف إلى FASW إلى التركيز النهائي البالغ 100 وحدة / مل البنسلين و 100 مجم / مل من الستربتومايسين ، واستخدم هذا المحلول لزراعة الأجنة المستعصصة بالبلاستومير.
لمبة مطاطية	علوم المجهر الإلكتروني	100488-418 VWR	لاستخدام ماصات باستور لنقل الأجنة من طبق إلى طبق.
سيلجارد 184	كيه آر أندرسون ، إنك.	NC9659604 فيشر المكياج العلمي	وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. صب طبقة بسمك 2-5 مم في طبق بتري 3 سم لإنشاء سطح عمل لاستئصال الأريمة.
سلك التنغستن 0.004 بوصة قطرها		AM 719000 أنظمة AM	استخدم هذا لعمل أداة لإزالة الأجنة من كيس الحضنة للإناث المخدرات.

تستخدم الأنظمة البيئية أنظمة